16S rDNA克隆文库法分析生鲜牛乳中 细菌种群的多样性

目的 利用16S rDNA基因文库分析法, 对生鲜牛乳中微生物的种群多样性进行研究。方法 提取生鲜牛乳中总微生物基因组DNA为模板, 将扩增到的生鲜牛乳样品的16S rDNA的PCR产物与pMD~18T载体连接, 构建其菌群的16S rDNA文库。对随机选取的56个阳性克隆子进行序列测定和BLAST比对。结果 文库序列分析表明, 有53个克隆子分属3个不同的类群, 即厚壁菌类群、变形菌类群和异常球菌-栖热菌类群, 其余3个克隆子属于未知类群。其中, 优势细菌类群为厚壁菌类群(86%), 在该类群中, 尤以无乳链球菌为主要代表, 约占所有克隆子的82%; 其他类群为γ~变形菌类群(7.1%)和异常球菌-栖热菌门类群(1.8%)。系统发育分析表明, 未知类群在分类地位上更接近与厚壁菌类群。结论 生鲜牛乳中微生物具有多样性, 无乳链球菌为其中的优势种群, 同时生鲜牛乳中还存在葡萄球菌等致病菌, 或不动杆菌和肠道菌等条件致病菌。     

16S rDNA克隆文库法分析生鲜牛乳中细菌种群的多样性

目的利用16S rDNA基因文库分析法,对生鲜牛乳中微生物的种群多样性进行研究。方法提取生鲜牛乳中总微生物基因组DNA为模板,将扩增到的生鲜牛乳样品的16S rDNA的PCR产物与pMD~18T载体连接,构建其菌群的16S rDNA文库。对随机选取的56个阳性克隆子进行序列测定和BLAST比对。结果文库序列分析表明,有53个克隆子分属3个不同的类群,即厚壁菌类群、变形菌类群和异常球菌-栖热菌类群,其余3个克隆子属于未知类群。其中,优势细菌类群为厚壁菌类群(86%),在该类群中,尤以无乳链球菌为主要代表,约占所有克隆子的82%;其他类群为γ~变形菌类群(7.1%)和异常球菌-栖热菌门类群(1.8%)。系统发育分析表明,未知类群在分类地位上更接近与厚壁菌类群。结论生鲜牛乳中微生物具有多样性,无乳链球菌为其中的优势种群,同时生鲜牛乳中还存在葡萄球菌等致病菌,或不动杆菌和肠道菌等条件致病菌。     

冬瓜腌制过程中微生物多样性的分析

采用分子生态检测方法研究传统腌冬瓜加工过程中微生物多样性及其变化情况,揭示传统腌制冬瓜品质形成规律及产品质量控制的微生物学本质。采用构建16S rDNA克隆文库法并结合传统的微生物培养方法解析冬瓜腌制过程中微生物种类组成及变化,对照理化品质的变化分析结果。试验结果表明,冬瓜腌制体系中,在腌制开始时的优势种群为不动杆菌属、魏斯氏菌属、芽孢杆菌属和肠杆菌属;第5天的优势种群为魏斯氏菌属、芽孢杆菌属和肠杆菌属;第10天的优势种群变成了乳杆菌属、魏斯氏菌属和芽孢杆菌属;腌制后期的优势种群为魏斯氏菌属、芽孢杆菌属和葡萄球菌属。与此同时,冬瓜腌制过程中腌制体系的pH值和亚硝酸含量下降较显著,最低值分别为3.33 mg/kg和3.55 mg/kg。乳酸菌总数增加,盐度和细菌总数相对稳定。本研究结果可促进冬瓜腌制的微生物生态研究,为生产上优化控制提供微生物学依据。     

16S rDNA克隆文库法分析小龙虾肠道细菌多样性

利用16S rDNA克隆文库法对小龙虾肠道共生细菌进行系统发育分析。采用细菌16S rDNA通用引物以小龙虾全肠DNA为模板扩增共生细菌的16S rDNA并建立基因文库,对得到的基因序列进行系统发育分析。结果表明,从小龙虾肠道共得到24个不同的16S rDNA序列,系统发育分析表明这24个16S rDNA序列代表的克隆分别与柠檬酸杆菌属、拟杆菌属、梭菌属、Anaerorhabdus furcosa、Haloplasma、希瓦菌属、巨型球菌属、中慢生根瘤菌属、Brachymonas、Sinanaerobacter、Cyanobium、丹毒丝菌属菌株的16S rDNA序列最为接近,相似性为83.6%～99.4%。小龙虾肠道内细菌资源丰富,且肠道细菌在小龙虾食物消化过程中发挥一定作用,而16S rDNA克隆文库法在反映小龙虾肠道中主要微生物的物种组成,特别是样本中优势微生物类群上具有一定优势。     

苋菜梗腌制过程细菌群落变化及风味的研究

采用16S rDNA基因克隆文库结合GC-MS分析等方法,对腌制苋菜梗体系的细菌多样性、品质变化和腌制成熟时的挥发性风味物质进行分析。结果表明,腌制苋菜梗开始时（即腌制第0d）其优势菌群为乳杆菌属、片球菌属和魏斯氏菌属,第10d优势菌群为乳杆菌属和产碱杆菌属,到腌制中后期细菌群落组成基本稳定,其中产碱杆菌属、拟杆菌属和梭菌属为优势菌群。苋菜梗腌制过程中,pH、亚硝酸盐含量和细菌总数均先上升后下降,至腌制结束时分别为5.28、4.0mg/kg和数量级107cfu/mL。利用GC-MS分析方法测定了腌制苋菜梗卤汁中的挥发性风味成分,发现其主体风味成分为醇类、酸类和烷烃类,其中醇类物质占19.5%、酸类占15.9%和烷烃类占14.6%,相对含量较高的挥发性组分有2-丁醇、乙醇、己烷和乙醛。      

苋菜梗腌制过程细菌群落变化及风味的研究

采用16S rDNA基因克隆文库结合GC-MS分析等方法,对腌制苋菜梗体系的细菌多样性、品质变化和腌制成熟时的挥发性风味物质进行分析。结果表明,腌制苋菜梗开始时(即腌制第0d)其优势菌群为乳杆菌属、片球菌属和魏斯氏菌属,第10d优势菌群为乳杆菌属和产碱杆菌属,到腌制中后期细菌群落组成基本稳定,其中产碱杆菌属、拟杆菌属和梭菌属为优势菌群。苋菜梗腌制过程中,pH、亚硝酸盐含量和细菌总数均先上升后下降,至腌制结束时分别为5.28、4.0mg/kg和数量级107cfu/mL。利用GC-MS分析方法测定了腌制苋菜梗卤汁中的挥发性风味成分,发现其主体风味成分为醇类、酸类和烷烃类,其中醇类物质占19.5%、酸类占15.9%和烷烃类占14.6%,相对含量较高的挥发性组分有2-丁醇、乙醇、己烷和乙醛。     

腌制苋菜梗的微生物菌群结构及其品质

腌制苋菜梗是浙东传统的特色腌制食品,了解其细菌种群结构并探讨对亚硝酸盐等理化品质的影响,以确保腌制食品的安全性。采用16S rDNA基因克隆文库的方法,对腌制成熟的苋菜梗中细菌组成结构多样性进行了分析,共检测出了乳杆菌、类香菌、弓形杆菌等6个菌属,其中乳杆菌属占优势为总数的83.9%。与此同时,测定了腌制苋菜梗体系亚硝酸盐等一些理化指标,腌制成熟时pH值为4.35,盐度为5.5,亚硝酸盐质量分数为3.99mg/kg(未超标),细菌和乳酸菌浓度分别为8.8×106 CFU/mL和1.6×106 CFU/mL。     

5.8S rDNA-ITS克隆文库法分析腌制冬瓜的酵母菌多样性

应用构建的5.8S r DNA-ITS基因克隆文库法,分析冬瓜腌制体系不同时期酵母菌的多样性、优势菌种及相关指标的变化。结果表明:冬瓜腌制过程中酵母菌种类丰富,随着腌制时间的不同,卤水中酵母菌组成存在较大差异。腌制早期优势酵母菌为普鲁兰类酵母,腌制中、后期,酵母菌群中优势菌种转变为热带假丝酵母。此外,冬瓜腌制过程中酵母菌数量和p H也相应地发生变化。本研究结果为研究酵母菌对浙东传统腌制蔬菜品质的影响提供微生物学基础。     

榨菜低盐腌制过程的微生物群落结构与动态分析

采用平板菌落计数法及PCR-SSCP(单链构象多态性)方法,分析低盐榨菜腌制过程中微生物群落结构及数量的变化情况;对通过SSCP方法得到的图谱中11条优势条带序列进行比对,结果表明,在榨菜腌制发酵初期,肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)为主要的优势菌群;随着腌制环境条件的变化,出现植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和短乳杆菌(Lactobacillus brevis);在腌制保存后期起主导作用的微生物为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和Lactobacillus versmoldensis;榨菜腌制保藏过程中pH值始终呈下降趋势,乳酸菌数量经历了一个先急速上升后逐渐趋缓,并稳定在一定数量的过程.对优化条件下制得的不同阶段的高品质低盐腌制榨菜样品进行微生物结构及分布分析,证实了不同乳酸菌的作用.     

PCR-DGGE技术分析腌制麻竹笋中微生物多样性

采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE）技术对盐质量浓度5 g/100 mL和19 g/100 mL腌制麻竹笋的微生物区系进行研究。结果表明,经DNA提取、巢式PCR、DGGE电泳和克隆测序后,从低盐质量浓度（5 g/100 mL）腌制笋中分离出4 条明显的亮带,经鉴定分别为食窦魏斯氏菌（Weissella cibaria）、乳球菌属（Lactococcus sp.）、魏斯氏菌属（Weissella sp.）和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）;从高盐质量浓度（19 g/100 mL）腌制笋中分离出5 条明显的亮带,经鉴定分别为绿色气球菌（Aerococcus viridans）、赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus sp.）、未得到培养的细菌（unculturedbacterium）、厌氧芽孢杆菌属（Anoxybacillus sp.）和芽孢杆菌属（Bacillus sp.）;低盐腌制笋的优势菌多为益生菌,而高盐腌制笋的优势菌则多为抗性较强的菌。基于16S rDNA的PCR-DGGE技术为分析腌制麻竹笋中微生物多样性提供了一条可靠、快速的有效途径。     

基于16S rRNA的徽派腊肉加工过程中微生物群落结构分析

为探究徽派腊肉加工过程中的微生物群落演替规律,采用高通量测序技术对不同加工阶段的徽派腊肉中微生物16S rRNA进行V3～V4区测序,比较不同加工阶段(鲜肉、腌制中期、腌制结束、成熟中期、成熟结束)腊肉中细菌群落结构组成及多样性差异.结果表明:5个加工阶段分别获得80155、80116、80174、80114、8017...     

Evaluation of Bacterial Diversity in Palm Wine by 16S rDNA Analysis of Community DNA

Bacterial diversity and fermentation dynamics in palm wine, a traditional alcoholic fermented beverage, collected from upright palm trees from Idiaba community, Abeokuta, Ogun State, Nigeria were evaluated by DNA based method using the 16S rDNA of the microbial community to verify and complement previous reports, improve our understanding and document yet unreported, uncultured microbial diversity associated with palm wine. The 16S rRNA gene fragments were amplified from microbial community and genomic DNA of isolates, by Polymerase Chain Reaction (PCR) using universal primers; and sequenced. The partial sequences were identified by comparison with sequences deposited in the non-redundant nucleotide database of National Center for Biotechnology Information (NCBI). This analysis revealed that 32 community clones were identified as Lactobacillus sp, Lactobacillus casei strain zhang, Lactobacillusplantarum, Leuconostoc mesenteriodes ssp dextranicum, Leuconcostoc lactis, Pediococcusparvulus strain Bpe-299, Acetobacter pomorum, Acetobacter pasteurianus, Gluconobacter oxydans, Acinetobacter calcoaceticus, Enterobacterium bacterium, Acidovorax sp, Comamonas sp, Bacillus subtilis, Staphylococcuspiscifermentans and uncultured bacteria clone D1-78. The results showed that bacterial diversity in the palm wine sample is dominated by Lactobacillus and Leuconostoc species as reported by previous workers and uncultured bacteria clone D1-78 (1 clone) was detected for the first time in palm wine.     

基于16S rDNA高通量测序技术分析北京豆汁儿微生物多样性和功能预测的研究

以北京不同城区具代表性的6家豆汁儿店的豆汁儿为研究对象,采用16S rDNA测序分析对豆汁儿中所含优势菌进行研究。结果表明:乳杆菌属(Lactobacillus)是豆汁儿中的优势菌属,乳杆菌目(Lactobacillales)占比达到95.8%以上。优势菌种为食窦魏斯氏菌(Weissella cibaria)、沙克乳酸杆菌(Lactobacillus sakei)。对豆汁儿中乳杆菌目(Lactobacillales)进行功能预测分析,推测豆汁儿中的风味物质来源于氨基酸代谢,发酵过程中产生β-低聚半乳糖及GOS,益于肠道菌群健康。     

SSCP方法的条件优化与榨菜低盐腌制微生物多样性分析

应用单链构象多态性(SSCP)方法研究榨菜低盐腌制条件下的微生物群落结构与变化。研究了凝胶质量浓度、电泳前处理、银染操作条件对SSCP分析方法的影响。结果表明,在凝胶质量浓度为22 g/dL、丙烯酰胺与双丙烯酰胺质量比为29∶1,并加入体积分数6%的甘油,4℃条件下1×TBE缓冲液中250 V电泳18 h,通过强碱性显影液和甲醛作还原剂的银染方法显色,可以获得理想的SSCP图谱。对榨菜低盐腌制不同时期样品的SSCP图谱分析结果,发现在榨菜腌制初期优势菌群为肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides),随后转变为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和短乳杆菌(Lactobacillus brevis)占优势;腌制后期主要存在的优势菌群为植物乳杆菌和Lactobacillus versmoldensis,结合感官分析证实这些优势乳酸菌对保持制品高品质具有功能作用。     

基于Illumina MiSeq技术分析腌干鱼加工过程中微生物群落多样性

为研究传统和乳酸菌法加工腌干鱼过程微生物的变化规律,为优化腌干鱼工艺提供理论依据,采用MiSeq测序技术,研究腌干鱼在不同加工阶段的细菌多样性,结果表明:腌干鱼加工过程微生物种类丰富,主要分为三大类:拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和变性菌门(Proteobacteria);蓝圆鲹初始菌相中优势细菌为肠杆菌科(Enterbacteriaceae)、肠球菌科(Enterococcactae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)和希瓦氏菌科(Shewanellaceae);海鲈初始菌相中优势菌主要是气单胞菌科(Aeromonadaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、肠杆菌科(Enterbacteriaceae)、肠球菌科(Enterococcaceae)、摩式摩根菌科(Moraganellaceae)、链球菌科(Streptococcaceae)等。传统腌制加工过程中菌相比较单一,优势菌主要是弧菌科(Vibrionaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)和动性球菌科(Planococcaceae);而接种乳酸菌发酵后,加工过程中细菌多样性呈现增加趋势,并且乳酸菌成为优势菌,促进了微杆菌科(Exiguobacteracea),葡萄球菌(Staphylococcaceae)等优势菌的繁殖;此外还检测到气单胞菌(Aeromonadaceae)和乳杆菌(Lactobacillaceae)等传统蓝圆鲹腌制加工过程中没有出现的菌。海鲈在腌制加工过程中细菌多样性明显高于蓝圆鲹,乳酸菌法腌制加工过程中细菌多样性明显增加。     

PCR-DGGE分析天源酱园豆酱发酵过程中微生物多样性

以天源酱园生产豆酱为研究对象,通过PCR-DGGE指纹图谱技术分析豆酱发酵过程中微生物群落动态变化。结果表明:豆酱发酵过程中的优势细菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis,相似率98%)和未培养明串珠菌克隆(uncultured Leuconostoc sp.clone,相似率100%)的近缘种,其中芽孢杆菌协助真菌分解原料中蛋白质和淀粉,明串珠菌有助于豆酱风味物质的形成;豆酱发酵过程中主要真菌为米曲霉(Aspergillus oryzae,相似率99%)的近缘种,在豆酱发酵前期分解原料中蛋白质和淀粉。