共轭亚油酸合成相关基因在耶氏解脂酵母中异源表达及活性研究

为了探究植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中与共轭亚油酸(CLA)生物合成相关的3个基因:(亚)油酸水合酶基因(mcra)、短链脱氢酶/氧化还原酶基因(dh)、乙酰乙酸脱羧酶基因(dc)在耶氏解脂酵母(Yarrowia lipolytica,Y.lipolytica)中异源表达后能否具有活性,利用两个耶氏解脂酵母整合表达质粒(p INA 1269和p INA 1312),将3个基因分别导入耶氏解脂酵母营养缺陷型宿主菌Polf(Ura~-,Leu~-)中,构建了重组菌株。在不同重组菌中添加相应的底物:亚油酸(LA)和10-羟基-顺12-十八碳烯酸(10-HOE),然后对反应体系进行脂肪酸检测,得到基因对应的不同产物:10-HOE和10-氧代-反11-十八碳烯酸(10-oxo-trans 11-octadecenoic acid),证明mcra、dh、dc在耶氏解脂酵母中进行了异源表达并且具有活性。     

田口设计优化保加利亚乳杆菌静息细胞转化合成共轭亚油酸

应用田口设计对保加利亚乳杆菌静息细胞转化合成共轭亚油酸进行优化。在单因素试验基础上,应用Minitab设计2水平4因素正交试验,采用田口设计方法分析正交试验结果。结果表明,静息细胞浓度、pH值、温度、亚油酸浓度对共轭亚油酸产量影响均不显著。软件预测产共轭亚油酸的最佳工艺为静息细胞浓度7%、pH值为5.7、温度32℃、亚油酸浓度1.7g/L,此时共轭亚油酸产量为142.3mg/L,与软件预测值140.63mg/L相吻合,表明优化方案达到了预期效果,且具有良好的稳定性。     

蛋白质谷氨酰胺酶在毕赤酵母中的异源表达

蛋白质谷氨酰胺酶(protein glutaminase, PG)可水解蛋白质侧链的谷氨酰胺残基,生成氨和蛋白质-L-谷氨酸,从而增加负电荷、降低蛋白等电点,进而改善蛋白质的功能特性。但其生产菌株解朊金黄杆菌的产酶量较低,仅有0.258 U/mL,且基因操作效率低,故近年来多采用异源表达的方法,以提高其产量。该实验成功实现蛋白质谷氨酰胺酶酶原(Pro-PG)在毕赤酵母GS115中异源表达,还进行了培养基优化及重组酶学性质的研究。结果表明：重组毕赤酵母pPIC9K-Pro-PG/GS115在摇瓶水平经1%(体积分数)甲醇诱导120 h,表达出的Pro-PG经胰蛋白酶加工后,PG酶活力达到0.878 U/mL。酶学性质研究发现,重组的PG最适作用温度为60℃,在不超过60℃时孵育1 h其相对酶活力可保持在80%以上;该酶作用的最适pH为6.0,在pH 3.0～8.0条件下孵育1 h其相对酶活力可保持在70%以上。     

超临界CO2体系中固定化亚油酸异构酶催化合成共轭亚油酸

以固定化亚油酸异构酶和亚油酸(LA)为原料,在考察超临界CO2(SC-CO2)处理对酶稳定性影响的基础上,采用单因素试验和响应面法研究SC-CO2中LA质量浓度、反应温度、压力、反应时间对共轭亚油酸(CLA)合成的影响。结果表明:固定化亚油酸异构酶在SC-CO2压力小于30MPa,处理温度低于40℃,处理时间小于2 h时,相对酶活较高,具有较好的稳定性;响应面法优化CLA合成条件为LA质量浓度0.05 g/mL,反应温度36℃,压力30 MPa,反应时间1.5 h;在此条件下,CLA的含量为60.58 mg/g;固定化亚油酸异构酶重复使用3次,CLA保持较高的含量。     

瘤胃中干酪乳杆菌的亚油酸异构酶基因的克隆与表达

以从黄牛瘤胃中分离到的一株具有将亚油酸转化为c9,t11-共轭亚油酸(conjugated linoleic acid,CLA)的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Fx为出发菌株,提取其基因组DNA,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增得到1 700 bp大小的亚油酸异构酶(linoleic acid isomerase,LAI)基因片段,将该基因片段纯化后进行TA克隆,得到重组质粒p UCm-T-LAI,将重组质粒p UCm-T-LAI和表达质粒p ET-Dsb A同时进行双酶切,连接得到重组表达载体p ET-Dsb A-LAI,经PCR鉴定和酶切后,将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21中,得到具有LAI活性的重组菌株,能将亚油酸转化为c9,t11-CLA,表明从Lactobacillus casei Fx成功克隆LAI,该研究将有助于深入了解不同瘤胃细菌特异性合成不同CLA异构体的LAI基因差异。     

植物乳杆菌亚油酸异构酶的分离纯化及其性质研究

经硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析和凝胶过滤,由植物乳杆菌(LactobacillusplantarumL 2 9)分离纯化得到亚油酸异构酶,分子量为4 3ku。对其酶学性质进行研究,结果表明,温度37℃、pH 6 0时酶活性较高;Co2 + 、Fe2 + 可提高酶的活性,Cu2 + 、Zn2 + 则对酶活力有抑制作用;该酶作用于亚油酸的Km=2 5 3×10 -5mol/L ,Vmax=2 5 7×10 -8mol/ (min·mg)。     

黑曲霉中葡萄糖氧化酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

为了提高葡萄糖氧化酶的生产能力,提取和纯化了黑曲霉Aspergillus niger PCTC的基因组DNA,以此为模板进行PCR扩增获得葡萄糖氧化酶基因,经测序,所得基因全长1 772 bp,编码含有589个氨基酸的蛋白质。将目的基因和表达载体pPIC9K连接经电转化导入毕赤酵母GS115中,在甲醇诱导和α信号肽的转运下,将葡萄糖氧化酶分泌到胞外。经G418梯度抗性平板和显色平板的初筛以及摇床复筛,获得了一株产葡萄糖氧化酶活力较高的菌株,该株菌在30℃、180 r/min的培养条件下,经0.5%的甲醇诱导发酵4 d可获得0.342 U/mL的酶活。对该菌株进行了摇瓶产酶条件优化,其最佳发酵条件为:200 r/min、pH 5、接种体积分数50%、25℃下经1.5%甲醇诱导7 d,酶活达到25 U/mL。实验结果表明:葡萄糖氧化酶基因已经成功转入毕赤酵母,并获得相当的产量。     

定向进化植物乳杆菌和痤疮丙酸杆菌高产共轭亚油酸

为获得高产共轭亚油酸(conjugated linoleic acid,CLA)的菌株,对亚油酸异构酶系植物乳杆菌的肌球蛋白交叉反应抗原(myosin-cross-reactive antigen,MCRA)基因mcra和痤疮丙酸杆菌的亚油酸异构酶基因lai-p进行克隆,克隆成功后连接到骨架质粒pCold-SUMO上构...     

固定化亚油酸异构酶制备及其性质

以海藻酸钠、壳聚糖为载体,分别采用直接包埋、交联-包埋法制备固定化亚油酸异构酶;研究酶的固定化条件和固定化酶的部分性质。结果表明：以海藻酸钠为载体,采用交联-包埋法以戊二醛为交联剂时固定化效果较好;最佳固定化条件为：海藻酸钠质量浓度为3g/100mL,戊二醛质量浓度为0.3g/100mL,CaCl2质量浓度为2g/100mL;固定化酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH值为5.0;与游离酶相比,固定化酶的热稳定性显著提高,温度在20～60℃之间较稳定,pH值在2～8之间表现出较好的酸碱耐受性;固定化亚油酸异构酶的Km为0.36mg/mL。连续操作6次固定化相对酶活力仍保持70.6%,与游离酶相比,固定化亚油酸异构酶催化效率约提高了50%。     

漆酶基因的克隆及在甲醇毕赤酵母中的表达

以白腐菌杂色云芝RNA为模板,通过RT—PCR获得不带自身信号肽漆酶Lccl基因的cDNA片段。构建了重组表达载体pMETαA—Lccl,并将其线性化后用电穿孔法导入Pichia methabolica PMAD16,PCR结果表明Lccl基因已经整合到甲醇毕赤酵母染色体上。经摇瓶培养筛选出表达水平较高的酵母菌株,漆酶酶活力达78U／L。     

亚油酸异构酶研究进展

亚油酸异构酶可催化亚油酸异构化为共轭亚油酸.随着共轭亚油酸的应用日益广泛,人们对亚油酸异构酶的研究也日益深入.在查阅大量文献的基础上,对亚油酸异构酶国内外的研究情况进行了综述.     

共轭亚油酸生物合成的研究

共轭亚油酸是80年代末才被发现的一种具有多种生理功能的天然不饱和脂肪酸，具有抗癌、抗动脉粥样硬化、减肥、促进生长、缓和免疫反应副作用等许多重要生理功能，在医药、食品、保健品、化妆品等中具有广阔的应用前景。目前，工业化生产共轭亚油酸的方法是碱并构化法，但共轭亚油酸的生物合成法是未来的发展趋势。本文对近年来共轭亚油酸生物合成方面的研究进展进行了综述。     

植物乳杆菌ZS2058中亚油酸异构酶的定位研究

植物乳杆菌ZS2058是本实验室从泡菜中筛选到的一株具有亚油酸异构酶活性的乳酸菌。本文对植物乳杆菌ZS2058中亚油酸异构酶的部分粗酶性质进行了考察,建立了初酶活性检测方法,在此基础上对此亚油酸异构酶在细胞中的定位进行了研究,这将为后续分离纯化此亚油酸异构酶提供理论依据与指导。考察的结果是超声波破碎获得亚油酸异构酶初酶液的最佳条件为破碎功率400W,破碎时间7.5min（破碎5s,间歇9s）。初酶活性测定时的最适亚油酸底物浓度为0.08mg/mL;EGTA等金属螯合剂及Ca2+对亚油酸异构酶活性的影响均不显著;粗酶液经超高速离心分级沉淀和加入去垢剂Triton X-100提取的实验结果表明,该亚油酸异构酶为细胞膜结合酶。      

产亚油酸异构酶的乳酸菌的筛选

对16株乳酸菌产亚油酸异构酶（linoleate isomerase）的能力进行分析,紫外分光光度法和气相色谱法分析发酵液中的共轭亚油酸（CLA）,筛选出产亚油酸异构酶的乳酸菌,PCR扩增筛选出菌株的亚油酸异构酶基因,并对其进行序列分析。结果显示,通过紫外分光光度法检测16株乳酸菌中有9株菌可将亚油酸（LA）转化为共轭亚油酸（CLA）;气相检测6株乳酸菌的发酵液中存在cis-9,trans-11CLA和trans-10,cis-12CLA两种同分异构体（各占CLA总产量的50%）;成功扩增出鼠李糖乳杆菌与亚油酸异构酶密切相关的肌球蛋白交叉反应抗原（MCRA）基因片段。      

嗜酸乳杆菌发酵法制备亚油酸异构酶的研究

以正交试验确定了嗜酸乳杆菌的最佳发酵条件，对其产生的亚油酸异构酶以硫酸铵分级沉淀和Sephadex G100层析进行了分离，并测定了酶活力。结果表明，嗜酸乳杆菌适宜发酵条件为：温度40℃，初始pH6．5，接种量1％，发酵时间24h；以上条件下产生的亚油酸异构酶经纯化后测得酶活为4358．6U。     

响应面法优化重组亚油酸异构酶产酶条件

共轭亚油酸(CLA)广泛存在于多种食物中,具有减肥、抗癌、抗动脉粥状硬化和抗糖尿病等诸多生理活性。为了获得活性CLA高产,本文将突变的亚油酸异构酶克隆到大肠杆菌中表达,单因素试验确定最优产酶条件为发酵时间18 h、IPTG诱导浓度0.2mmol/L、20%装液、培养基初始p H7、诱导前菌体生物量OD_(600)=0.4、LA浓度0.5mg/m L、离子浓度0.02%;在此基础上采用响应曲面法优化重组大肠杆菌培养条件提高生产亚油酸异构酶的能力,根据响应面法实验结果分析显示,发酵时间、诱导前生物量和LA浓度对重组亚油酸异构酶的表达有显著影响且均为正效应。三个影响因素最佳组合为发酵时间19.5h、诱导前生物量OD600=0.47和LA浓度0.57 mg/mL,此时预测亚油酸异构酶催化LA转化为CLA最大量为143.33μg/m L。验证显示,发酵CLA的产量为141.75±0.14μg/m L,与预测产量相符;通过优化设计,提高了107.5%。