抗克伦特罗单链抗体基因构建及蛋白结构模拟

目的：构建抗克伦特罗单链抗体(scFv)基因cbl,进行蛋白质结构模拟并对其理化特性进行分析。方法：采用重叠延伸PCR 方法,以能特异性分泌抗克伦特罗mAb 的杂交瘤细胞株5D1 为原料,构建抗克伦特罗scFv 基因cbl,进行测序,采用生物信息软件对氨基酸序列推导并进行结构预测,同时对理化性质进行分析。结果：抗克伦特罗scFv 基因cbl 全长720bp,对应225 个氨基酸,单链抗体分子量约为25826.6,等电点预测值8.78,为碱性蛋白质;二级结构显示抗克伦特罗单链抗体含α螺旋20 处,β折叠99 处,β转角28 处,随机卷曲93 处。cbl 三级结构建模显示重链(VH)和轻链(VL)形成一个疏水的" 口袋",Linker 游离于此结构之外,符合scFv 的结构特点,明显具有抗原结合位点的空间构象,理论上应该具有良好的抗原结合活性。结论：构建一个抗克伦特罗scFv 基因cbl,应用信息学技术所获得的预测和分析结果为抗克伦特罗单链抗体的进一步表达、纯化和活性研究提供信息。     

抗莠去津抗体基因构建及蛋白结构模拟

构建抗莠去津单链抗体基因,采用DNAStar软件对单链抗体基因进行氨基酸序列推导,用生物信息学在线网站预测莠去津单链抗体基本特性及二、三级结构。结果表明,抗莠去津单链抗体基因全长744 bp,对应248 个氨基酸,单链抗体相对分子质量约为26 061.9,等电点预测值7.81,为碱性蛋白质;二级结构中α-螺旋17 处,延伸链85 处,β-转角19 处,无规卷曲127 处;三级结构建模显示,重链和轻链的6 个环区共同组成了抗体的抗原结合区,符合单链抗体的结构特点,具有抗原结合位点的空间构象。该研究为抗莠去津单链抗体的进一步表达、纯化和活性研究奠定了基础。     

低剂量暴露下呋喃唑酮在大菱鲆体内的迁移规律及预测

为评价养殖环境中低剂量呋喃唑酮在大菱鲆体内残留的风险,科学预测水产品中药物残留来源,以大菱鲆为研究对象,在饲料中分别以0.5、1.5 mg/kg和5.0 mg/kg三个添加量的呋喃唑酮,在（16±2）℃连续投喂30 d,采用液相色谱-串联质谱法测定大菱鲆体内呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-噁唑烷基酮（3-amino-2-oxazolidinone,AOZ）残留量,确定饲料添加量与AOZ残留量关系、稳态富集时间、组织分布特征和生物富集系数（bioaccumulation factor,BCF）,并构建判别模型预测饲料中呋喃唑酮含量。结果表明,在低剂量暴露条件下连续投喂含呋喃唑酮的饲料30 d,大菱鲆各组织中AOZ残留量与添加量呈正相关;在3 个添加量下,AOZ在肌肉和皮中达到稳态富集的时间分别为15、15 d和25 d;AOZ在大菱鲆各组织中的分布呈相似规律,其残留量由大到小依次为肝脏＞肾脏＞脾＞鳃＞皮＞肌肉;低添加水平条件下呋喃唑酮在大菱鲆体内的BCF大于高添加水平;当饲料中呋喃唑酮含量分别≥0.68 mg/kg和≥0.46 mg/kg时,在该养殖条件下连续投喂30 d,大菱鲆肌肉和皮组织中AOZ残留量≥1.0 μg/kg。大菱鲆中呋喃唑酮痕量残留可能与养殖环境污染相关,通过模型预测和科学监控,可以减少养殖过程的带入风险,有效保障水产品的食用安全。     

抗呋喃它酮代谢物噬菌体单链抗体库的构建

目的：构建抗呋喃它酮代谢物(AMOZ)的衍生物噬菌体单链抗体库。方法：从分泌抗AMOZ 的单克隆抗体的杂交瘤细胞系(BC3-E8)中提取总RNA,经RT-PCR 反转录成cDNA,设计通用简并引物,PCR 扩增抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL)。经重叠延伸PCR (SOE-PCR),将VH 和VL 基因用编码(G1y4Ser)3 的linker随机拼接成单链抗体(scFv)基因,然后将其克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E 中,转化大肠杆菌(Escherichia coli) TG1 感受态细胞,经辅助噬菌体M13K07 超感染,建立噬菌体单链抗体库。随机挑取10 个阳性克隆,经PCR 和双酶切鉴定,并测序。登陆DNAMAN 软件对序列进行分析、比对。结果：成功扩增VH、VL 及scFv 基因,并得到库容为1.2 × 106 的噬菌体抗体库,噬菌体的滴度为2.0 × 1010PFU,PCR 鉴定及双酶切鉴定文库重组率较高,软件对序列比对结果显示,scFv 基因全长序列之间差异为8.38%,VH 序列差异为3.68%,VL 序列差异为14.34%,且序列差异多集中在CDR 抗原结合区域对应的核酸序列上。结论：已构建抗呋喃它酮代谢物的衍生物噬菌体单链抗体库,为进一步富集筛选并表达抗AMOZ 的衍生物的单链抗体提供参考。     

不同抗生素参与下呋喃唑酮代谢物 在鲫鱼体内的残留消除规律

本文研究了土霉素、恩诺沙星、磺胺间甲氧嘧啶分别与呋喃唑酮联合药浴给药后,呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-恶唑烷酮(AOZ)在鲫鱼体内的残留消除规律。结果表明,呋喃唑酮在进入鲫鱼体内后迅速代谢成AOZ,停药0 h,呋喃唑酮对照组中鲫鱼肾脏、肝脏、肌肉中AOZ残留量便达到最高,分别为88.87、59.20、14.91μg/kg,平均消除速率为0.86、0.52、0.14μg/(kg·h);与对照组相比,土霉素-呋喃唑酮组鲫鱼肾脏、肝脏、肌肉中AOZ最大残留浓度明显增加,分别为165.40、125.29、28.69μg/kg,平均消除速率为1.71、1.17、0.31μg/(kg·h);而恩诺沙星-呋喃唑酮组鲫鱼肾脏、肝脏、肌肉中AOZ最大残留浓度与对照组相比显著减少,仅为46.70、41.64、9.69μg/kg,平均消除速率为0.36、0.31、0.03μg/(kg·h);磺胺间甲氧嘧啶-呋喃唑酮组中鲫鱼体内AOZ最大残留量及平均消除速率与对照组相比也有差异但变化不大。消除96 h后,各实验组鲫鱼体内仍有大量AOZ残留。本实验初步表明AOZ在鲫鱼体内难消除,且土霉素、恩诺沙星、磺胺间甲氧嘧啶能够不同程度的影响AOZ在鲫鱼体内的残留与消除,这为水产品质量安全监管和渔药残留研究提供了理论基础。     

西维因单链抗体基因克隆、表达及活性分析

利用兼并引物从西维因单克隆杂交瘤细胞的cDNA中克隆得到抗体基因的轻链可变区（VL）和重链可变区（VH）,长度分别为324bp和360bp,将其分别连接入pGEM-T-Easy载体进行测序;根据测序结果设计特异性引物和连接序列（Gly4Ser）3,利用重叠延伸PCR扩增得到长度为729bp的单链抗体基因片段（scFv）,亚克隆至原核表达载体pET30a（+）,并转化感受态细胞BL21（DE3）进行诱导表达;聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果显示,重组表达单链抗体形成包涵体,分子量大小约为33kDa,变性后利用不同条件进行复性,结果显示最佳复性时间为48h,最佳起始蛋白浓度为200μg/mL,含有精氨酸的复性液效果最佳;利用亲和层析纯化scFv,并利用竞争ELISA检测其活性,结果显示该scFv对西维因具有良好的亲和性和特异性。      

二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体的构建

为构建一种食品残留检测用二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体(sdsFvCAP)。以抗氯霉素抗体可变区基因为模板,通过引物突变PCR 在轻链和重链的可变区分别引入一个半胱氨酸定点突变,以重叠延伸PCR 组装成sdsFvCAP。在大肠杆菌系统强启动子T7 驱动下,sdsFvCAP 基因不能单独表达,而通过同义突变降低其5＇端序列GC 含量则可实现高效表达。表达产物主要以包涵体形式存在,经β- 环糊精分子伴侣系统复性可获得亲和力与母本抗体相似的sdsFvCAP。所构建的sdsFvCAP 具有取代单克隆抗体用于氯霉素残留检测的潜力。     

动物性食品中呋喃唑酮代谢物酶联免疫检测方法的研究

3-氨基-2-恶唑烷酮（AOZ）是硝基呋喃类抗生素呋喃唑酮在动物体内的稳定代谢物，通过选用对醛基苯甲酸对AOZ进行衍生制得CPAOZ，以CPAOZ作为半抗原，再与载体蛋白连接制成免疫原，经过免疫，制得多克隆抗体。经过筛选纯化得到的抗体，用直接竞争酶联免疫检测方法得CPAOZ检出限为0.2μg／L，且与其他抗生素无交叉反应，抗体特异性好。     

抗克百威单链抗体的可溶性表达载体的构建及鉴定

为构建克百威（carbofuran,CBF）单链抗体（sc Fv）可溶性表达载体,实现其在大肠杆菌中的表达。以p CANTAB5E-sc Fv质粒为模板扩增CBF的重链（VH）及轻链（VL）片段,通过引物设计引入由15个氨基酸组成的连接肽（Gly4Ser）3,经重叠延伸拼接重链及轻链片段,并通过PCR扩增得到sc Fv基因,再与载体p LIP6/GN连接,转化大肠杆菌BL21,阳性克隆质粒经PCR鉴定并测序。重组菌经0.6μmol/L异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）及低温诱导表达重组单链抗体,并通过SDS-PAGE和Western blotting对其鉴定。采用ELISA法检测重组单链抗体的抗原结合活性。结果表明重组质粒p LIP6/GN-sc Fv含有插入片段,sc Fv与碱性磷酸酶（AP）相连得到重组蛋白的分子量接近78 ku,可被游离的CBF竞争性抑制,IC50值为26.80 ng/m L。这说明成功构建了重组质粒p LIP6/GN-sc Fv并实现了其在大肠杆菌中的可溶性表达,为研究其在免疫分析方法中的应用奠定了基础。      

氧氟沙星单链抗体库的构建、筛选及蛋白结构模拟

利用噬菌体展示技术构建兽药氧氟沙星单链抗体(scFv)库,从中筛选氧氟沙星特异性噬菌体scFv以及模拟其三维结构。将从氧氟沙星杂交瘤细胞提取的总RNA,用RT-PCR反转录合成第一链cDNA,设计以针对鼠源重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)基因的兼并引物,通过PCR扩增获得VH和VL可变区基因,采用重叠延伸PCR技术将VH和VL拼接为全长scFv基因片段,将经内切酶EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后的scFv基因片段插入到T7噬菌体中,经包装蛋白体外包装后转化宿主菌BLT5403,成功构建库容量为3×105pfu/mL氧氟沙星单链抗体库,经过4轮吸附-洗脱-扩增的富集后,采用直接竞争ELISA筛选得到4个特异性噬菌体scFv,经测序最后运用Expasy软件模拟特异性scFv的三维结构和物理化学性质。为进一步大量表达氧氟沙星单链抗体奠定了坚实的基础。     

抗-Cry2Aa单链抗体分子互作及荧光免疫检测研究

Cry2Aa毒素是一种新型生物农药,分析该毒素与特异性单链抗体分子互作,并建立快速检测毒素残留的方法对保障食品和生态安全有重要意义。本研究以同源蛋白为模板对单链抗体进行建模,并进行了Cry2Aa毒素与单链抗体的分子对接模拟,确定关键结合位点,以此为基础将单链抗体作为检测抗体,建立了间接竞争时间分辨荧光免疫分析方法,对大米样品中Cry2Aa毒素进行了检测。利用生物信息学工具模拟获得单链抗体三维结构模型,分子对接结果显示重链可变区81NY82和121SGNY124区域及轻链可变区的245YSSN248氨基酸残基在与毒素结构Ⅱ区识别过程中起关键作用,为建立高效检测方法奠定基础,进一步基于该单链抗体建立的时间分辨检测方法灵敏度(IC10)为0.08 ng/mL,中抑制浓度(IC50)为7.99 ng/mL,线性检测范围(IC20~IC80)为0.24~263.77 ng/mL,且与常规双抗夹心ELISA法检测呈良好线性关系。     

Evaluation of the residues of furazolidone and its metabolite, 3-amino-2-oxazolidinone (AOZ), in eggs

The use of furazolidone in food-producing animals is banned within the EU. Detection of the protein-bound side-chain metabolite, 3-amino-2-oxazolidinone (AOZ), in animal tissues is the most effective method of enforcing the ban. The study was undertaken to find out if the same applies to eggs. The concentrations of furazolidone and AOZ in eggs reached a plateau of ~360-380 μgkg -1 by the fourth day of treating birds with 400mgkg -1 furazolidone. After a 4-day withdrawal from treatment, intact furazolidone could not be detected. AOZ residues could still be detected up to 21 days following withdrawal from treatment. During treatment, most intact furazolidone residues occur in the albumen. For AOZ, there is a more even distribution of residues between albumen and the yolk. The concentration of furazolidone in egg homogenates stored at -20°C decreases by 44% after 55 days. AOZ residues are stable during this period. From these results, it is clear that AOZ is a more suitable marker residue than the parent compound for monitoring concentrations of the drug in eggs.     

Evaluation of antibacterial activity of 3-butenyl, 4-pentenyl, 2-phenylethyl, and benzyl isothiocyanate in Brassica vegetables

This study investigated antibacterial activities of 4 isothiocyanates (3-butenyl, 4-phentenyl, 2-phenylethyl, and benzyl isothiocyanate) against 4 Gram-positive bacteria (Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Listeria monocytogenes, and Staphylococcus aureus) and 7 Gram-negative bacteria (Aeromonas hydrophila, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella choleaesuis, Salmonella enterica, Serratia marcescens, Shigella sonnei, and Vibrio parahaemolyticus) by an agar disc diffusion assay. Benzyl isothiocyanate (> 90.00 mm inhibition zone diameter at 0.1 μL/mL) and 2-phenylethyl isothiocyanate (58.33 mm at 0.2 μL/mL) showed large inhibition zones especially against B. cereus. Also, 3-butenyl isothiocyanate (21.67 mm at 1.0 μL/mL) and 4-pentenyl isothiocyanate (19.67 mm at 1.0 μL/mL) displayed potent antibacterial activity against A. hydrophila. Benzyl and 2-phenylethyl isothiocyanate indicated higher activity against most of the pathogenic bacteria than 3-butenyl and 4-pentenyl isothiocyanate, and were more effective against Gram-positive bacteria than Gram-negative bacteria.     

Porosity and Water Activity Effects on Stability of Crystalline β‐Carotene in Freeze‐Dried Solids

Abstract: Stability of entrapped crystalline β‐carotene as affected by water activity, solids microstructure, and composition of freeze‐dried systems was investigated. Aliquots (1000 mm³, 20% w/w solids) of solutions of maltodextrins of various dextrose equivalents (M040: DE6, M100: DE11, and M250: DE25.5), M100‐sugars (1:1 glucose, fructose and sucrose), and agar for gelation with dispersed β‐carotene were frozen at ?20, ?40, or ?80 °C and freeze‐dried. Glass transition and α‐relaxation temperatures were determined with differential scanning calorimetry and dynamic mechanical analysis, respectively. β‐Carotene contents were monitored spectrophotometrically. In the glassy solids, pore microstructure had a major effect on β‐carotene stability. Small pores with thin walls and large surface area allowed β‐carotene exposure to oxygen which led to a higher loss, whereas structural collapse enhanced stability of β‐carotene by decreasing exposure to oxygen. As water plasticized matrices, an increase in molecular mobility in the matrix enhanced β‐carotene degradation. Stability of dispersed β‐carotene was highest at around 0.2 a_w, but decreasing structural relaxation times above the glass transition correlated well with the rate of β‐carotene degradation at higher a_w. Microstructure, a_w, and component mobility are important factors in the control of stability of β‐carotene in freeze‐dried solids Practical Application: β‐Carotene expresses various nutritional benefits; however, it is sensitive to oxygen and the degradation contributes to loss of nutritional values as well as product color. To increase stability of β‐carotene in freeze‐dried foods, the amount of oxygen penetration need to be limited. The modification of freeze‐dried food structures, for example, porosity and structural collapse, components, and humidity effectively enhance the stability of dispersed β‐carotene in freeze‐dried solids.     

2-取代-1，3-硫杂环戊烷香料的合成和香气评价

以醛／酮与1，2-乙二硫醇或1，2-丙二硫醇在对甲苯磺酸催化下反应，合成了10种2-取代-1，3-二硫杂环戊烷，产率62．8％～87．8％；其中，2-正丙基-1，3-二硫杂环戊烷产率达87．8％，纯度99．5％。经元素分析、FTIR、GC-MS和’HNMR确定了10种产物的结构。香气评价结果表明：合成的2-正丙基-1，3-二硫杂环戊烷具有花香、肉汤香气，可用于食品香精和调味料中；其余9种2-取代-1，3-二硫杂环戊烷具有肉香、葱蒜香和萝卜香。