黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因的克隆及序列分析

通过设计特异性引物,以黑曲霉总RNA为模板,采用RT-PCR技术获得了预期大小的基因片断.将目的基因使用pMD18-T载体转化到大肠杆菌,质粒PCR鉴定表明已成功克隆了黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因.测序结果表明,获得的目的基因片段大小为2583 bp.该序列与GenBank中的β-葡萄糖苷酶基因序列相比,核苷酸序列同源性达98.88%、氨基酸序列同源性达99.77%.同时,通过PCR技术扩增,获得了去除信号肽的反应产物,大小为2500 bp左右.该结果为目的基因在毕赤酵母中能够使用载体上的信号肽序列进行分泌表达奠定了基础.     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶的研究进展

系统介绍了近年来黑曲霉β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.2)的酶解特征、酶学性质、催化机制、活性中心、生物学功能及应用技术等方面的研究进展,并展望了其应用前景。     

黑曲霉液体发酵制备β-葡萄糖苷酶的研究

研究了培养条件对黑曲霉液体发酵制备β-葡萄糖苷酶的影响及β-葡萄糖苷酶的表观酶学性质。麸皮是黑曲霉β-葡萄糖苷酶的较适诱导物。黑曲霉NL02以 40 g/L 麸皮为碳源,在 250 mL 三角瓶中装液 40 mL,接种量 8%,初始pH值5.5, 30℃、 170 r/min 下培养 10 d,β-葡萄糖苷酶活力为 19.12 IU/mL。β-葡萄糖苷酶最适温度为 65℃,40℃ 时稳定性较好;最适pH值为4.8,在pH值3.0～5.0之间稳定性较好。     

黑曲霉产β-葡萄糖苷酶发酵条件的研究

通过单因素及正交实验对现存黑曲霉菌株产酶发酵条件进行了研究,结果表明:当培养基为:玉米芯4.0%;酵母粉1.0%;KH2PO40.4%;MgSO40.08%;(NH4)2SO40.4%;培养温度30℃,摇床转速220r/min,接种量6.0%,装液量40mL/250mL,初始pH值5.0,发酵周期168h;此条件下β-葡萄糖苷酶酶活达56.96IU/mL。     

ARTP诱变黑曲霉高产β-葡萄糖苷酶的研究

通过ARTP技术操作快速获得突变菌株,提取纤维质中的β-葡萄糖苷酶产菌,进行产酶液体发酵并提取粗酶液,结果可见35～80℃时底物与酶液反应,得酶活性最大数值100％,β-葡萄糖苷酶促反应最为适宜的温度65℃.测定酶活性,最大100％,β-葡萄糖苷酶酶促反应最为适宜pH为4.5.50℃进行酶活性测量,得到100％.实验得...     

黑曲霉胞内β-葡萄糖苷酶分离提纯及其性质的研究

采用丙酮沉淀、DEAE-Sepharose阴离子交换层析、Sephactyl S-200凝胶过滤、Phenyl Sepharose CL-4B疏水层析等步骤,从黑曲霉菌丝体中获得了一种凝胶电泳均一的胞内β-葡萄糖苷酶,其单亚基相对分子质量为122.7K,纯化倍数和得率分别为7.2和19.3%.以纤维二糖为底物时,该酶葡萄糖的抑制常数Ki为0.19 mmol/L,Km值和Vmax分别为2.99 mmol/L、1.49 μmol/min.该酶最适反应温度60℃,最适反应pH为5.0;在60℃以下及pH3～6范围内均能保持稳定.甲醇、乙醇、正丁醇、丙酮和乙酸乙酯等有机溶剂对胞内β-葡萄糖苷酶有很好的激活作用.     

β-葡萄糖苷酶高产菌株的筛选及其基因的克隆与表达

利用栀子苷培养基从滨海新区盐碱地土样中筛选得到一株高产β-葡萄糖苷酶菌株,酶活力达到14.82U·mL-1,经16SrDNA鉴定,命名为短小芽孢杆菌B-4。克隆获得B-4β-葡萄糖苷酶基因,测序结果表明,其大小为1437bp,与GenBank中短小芽孢杆菌SAFR-032β-葡萄糖苷酶基因YP_001488769.1序列比对,核苷酸序列同源性达97%,氨基酸序列同源性达99%。进一步利用表达载体pET-22b（＋）,实现β-葡萄糖苷酶基因bglB在大肠杆菌BL21（DE3）中的高效表达,酶活力达46.85U·mL-1。     

黑曲霉分泌β-葡萄糖苷酶过程中pH值的调控

研究了初始pH值对黑曲霉合成β-葡萄糖苷酶的影响,并对产酶过程中pH值进行了人工调控.结果表明,利用黑曲霉合成β-葡萄糖苷酶的最佳初始pH值为5.0;使用氢氧化钠稀溶液能有效地时产酶过程中的pH值进行调控;将产酶期的pH值控制在4.0左右时,有利于β-葡萄糖苷酶的分泌,发酵120 h,酶活力能达到6.12 U·mL-1,大大高于调控前的酶活力.对黑曲霉合成β-葡萄糖苷酶工艺的制定及提高β-葡萄糖苷酶的产率具有重要的指导作用.     

β-葡萄糖苷酶的研究进展

β-葡萄糖苷酶具有非还原性的特点,其在纤维素降解和改善食品风味方面具有重要价值,在对其性质及应用情况分析的基础上使得其得到更好的应用.就β-葡萄糖苷酶的研究进展进行综述.     

β-葡萄糖苷酶产生菌产酶条件研究

本文研究了β-葡萄糖苷酶产生菌黑曲霉3．350菌株（Aspregillusniger3．350）的产酶温度、pH值、碳源等条件及其它影响产酶的有关因子，确定了黑曲霉3．350菌株产酶的最适温度为25～30℃，pH＝7.0～8.0，并发现在本实验条件下Cu2＋、Mg2＋对酶活力提高有明显作用。     

嗜热真菌β-葡萄糖苷酶基因克隆表达与调控的研究进展

β-葡萄糖苷酶是一种糖苷水解酶,可水解纤维二糖生成两分子的葡萄糖。该酶在纤维素糖化水解过程中起关键性作用,是纤维素酶代谢途径中的限速酶。嗜热真菌因其极端的生长环境,是耐高温酶的主要来源,嗜热真菌来源的β-葡萄糖苷酶种类日益丰富。构建了含13种嗜热真菌β-葡萄糖苷酶的进化树,并对嗜热真菌中β-葡萄糖苷酶的来源、嗜热真菌β-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达、及已知的β-葡萄糖苷酶调控因子进行了综述。     

β-葡萄糖苷酶发酵技术的进展

β-葡萄糖苷酶能作用于纤维二糖或纤维寡糖,使其水解为葡萄糖,在木质纤维素降解等领域具有重要的应用价值。文章对β-葡萄糖苷酶及其菌种的筛选和诱变、发酵工艺的优化以及菌体生长过程和发酵控制等进行综述。     

- 葡萄糖苷酶的研究

研究了培养条件对黑曲霉液体发酵制备β-葡萄糖苷酶的影响及β-葡萄糖苷酶的表观酶学性质。麸皮是黑曲霉β-葡萄糖苷酶的较适诱导物。黑曲霉NL02以 40 g/L 麸皮为碳源,在 250 mL 三角瓶中装液 40 mL,接种量 8%,初始pH值5.5, 30℃、 170 r/min 下培养 10 d,β-葡萄糖苷酶活力为 19.12 IU/mL。β-葡萄糖苷酶最适温度为 65℃,40℃ 时稳定性较好;最适pH值为4.8,在pH值3.0～5.0之间稳定性较好。     

β-葡萄糖苷酶的发酵工艺优化及在木糖渣酶水解中的应用

木糖渣有较高的纤维素含量,可以用作诱导产生β-葡萄糖苷酶的碳源。本文以木糖渣为诱导碳源,优化了黑曲霉发酵产β-葡萄糖苷酶的工艺。首先利用Plackett-Burman实验设计在6个因素中筛选出了影响产酶的主要因素,分别为麦麸、硫酸铵、硝酸钠。在筛选基础上,利用三因素五水平的中心组合对3个因素进行了进一步的优化,并用响应优化器得到了产酶的最佳条件麦麸、硫酸铵、硝酸钠的浓度分别为26.7g/L、10.0g/L、10.0g/L,在得到的最佳条件下,酶活可以达到15.0IU/mL。对拟合模型进行了方差分析,结果表明模型的R²值为92.12%,P值为0,模型拟合较好,可以对实验结果进行预测。以木糖渣为底物,用诱导制备的复配酶液验证了其水解效率,结果表明当里氏木霉粗酶液与黑曲霉粗酶液1：1复配时,酶水解效率为里氏木霉粗酶液的4倍。     

细菌产β-葡萄糖苷酶发酵优化

从栀子果中分离到一株在较高温度下产β-葡萄糖苷酶的地衣芽孢杆菌,对其产酶条件进行了优化.通过单因素实验和正交实验确定该菌株产酶的最佳培养条件为:碳源(甘蔗渣粉∶麸皮=3∶1)5%,牛肉膏 0.5%,栀子甙 0.2%,KH2PO4 0.4%,MnSO4 0.04%,pH值9.0,装液量20 mL/250 mL,种子液接种量10%,45℃发酵24 h.优化条件下发酵液中的酶活可达到93.48 U·mL-1.     

短小芽孢杆菌β-1,4-葡聚糖内切酶基因的克隆及在大肠杆菌中的分泌表达

从一株产碱性纤维素酶的短小芽孢杆菌H12中克隆了编码β-1,4-葡聚糖内切酶的基因,对其基因序列及其酶的结构域进行了分析预测,同时将该酶的基因构建于大肠杆菌表达载体pET20b中,获得重组表达载体pET20b-EglA,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行表达。结果表明,该基因大小为1980 bp,共编码659个氨基酸;对β-1,4-葡聚糖内切酶结构域分析表明,该酶由两个不连续的结构域组成,其一为N-端催化结构域,由糖基水解酶家族9组成,其二为C-端底物结合结构域,由碳水化合物绑定结构域家族3组成;平板实验结果表明,β-1,4-葡聚糖内切酶基因在重组大肠杆菌中得到了良好的分泌表达;SDS-PAGE电泳图谱表明该酶的分子大小约为73 kDa。     

嗜热β-葡萄糖苷酶的原核表达、纯化及其活性

目的原核表达、纯化嗜热β-葡萄糖苷酶,并检测其活性。方法从嗜热细菌Fervidobacterium pennivorans基因组DNA中PCR扩增β-葡萄糖苷酶基因,插入原核表达载体p ET-28a中,构建重组表达质粒,转化E.coli BL21(DE3)Codon Plus,筛选阳性重组菌,IPTG诱导表达。采用镍柱亲和层析法纯化重组酶;紫外吸收法检测酶活力和底物选择性。结果 PCR退火温度为67℃时,可扩增得到单一的目的基因条带;测序结果显示,重组表达质粒中目的基因的核苷酸序列与细菌基因组中该基因序列同源性为100%,未发现终止密码子及氨基酸的改变;表达的重组酶相对分子质量约为54 000;纯化的目的蛋白纯度达95%,浓度为10 mg/L;该重组酶能够高效催化对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(p NPG)的水解,60℃条件下的比活力达124 293.5 U/mg。结论成功在E.coli中表达了嗜热细菌Fervidobacterium pennivorans来源的具有较高催化活力和底物专一性的β-葡萄糖苷酶。     

人体β-防御素-3突变基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的对人体β-防御素-3基因进行定点突变,并在E.coli中表达。方法从人正常皮肤组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增编码β-防御素-3成熟肽的cDNA,测序正确后,设计含突变位点的引物,用PCR重叠延伸法对β-防御素-3成熟肽cDNA进行定点突变,将突变产物克隆至pUC18,并在E.coli中融合表达。结果测序结果表明,经RT-PCR所得的β-防御素-3成熟肽序列与GenBank中报道的序列完全一致。经过突变,β-防御素-3成熟肽第29位谷氨酰胺密码子由CAG突变为精氨酸密码子CGA,其余核苷酸序列均未发生变化。将突变β-防御素-3基因在E.coli中诱导表达后,可见突变β-防御素-3蛋白表达。结论已成功克隆并表达了β-防御素-3突变体基因。     

嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶高产菌株及其性质

从生物质资源丰富的武夷山中采样天然腐烂枯枝、烂叶、土壤等材料中分离筛选,采用对硝基酚-β-葡萄糖苷(pNPG)法对复筛菌株进行酶活测定,得到一株高产β-葡萄糖苷酶菌株,并对其酶学性质进行研究,结果表明:该酶的液体发酵最高酶活高达482.1U/mL,最适反应pH值为4.8,最适反应温度为65℃;乙醇浓度为10%对酶活有最大促进作用,对β-葡萄糖苷酶酶活提高将近1倍,乙醇耐受能力高达30%。将该酶应用于同步糖化发酵中,发酵至120h得乙醇最高产量,所产乙醇含量高达41.25g/L,与阴性、阳性对照相比,乙醇产量提高近2倍。该菌株所产的β-葡萄糖苷酶酶活力较高,应用于同步糖化发酵过程具有明显的促进效果,对于促进纤维素乙醇的产业化进程具有广阔的发展前景。     

β-葡萄糖苷酶ACA微胶囊固定化实验研究

对壳聚糖为壁材的共价交联固定、海藻酸钠为壁材的包埋固定及壳聚糖和海藻酸钠共用的新型复合载体(ACA)固定的β-葡萄精苷酶进行了对比研究,得出ACA微胶囊固定化的酶具有较好的催化活性、重复使用和低温贮藏性能.醋酸和戊二醛及CaCl2的浓度、壳聚糖和海藻酸钠用量、引发和交联时间对ACA微胶囊固定酶的形态和性能影响较大,葡萄糖转化率随醋酸与戊二醛和CaCl2浓度的增加、壳聚糖和海藻酸钠用量的增大,交联和引发时间的延长呈先增大后减小的变化趋势,并于不同特定值达到最大.