共查询到18条相似文献,搜索用时 62 毫秒
1.
米黑根毛霉脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达 总被引:4,自引:0,他引:4
脂肪酶是主要工业用酶制剂之一,在食品、洗涤剂和制药等领域广泛应用。将编码米黑根毛霉(Rhizo-mucor miehei)脂肪酶RML的基因克隆到pPIC9K载体中,构建了分泌型表达载体pPIC9K-RML,载体经线性化后转化Pichia pastorisGS115,G418梯度筛选获得了分泌表达RML的重组毕赤酵母工程菌,SDS-PAGE分析显示表达的脂肪酶分子量大小与预期一致。初步研究表明,重组脂肪酶最适温度为40℃,最适pH值为8.0,以橄榄油为底物时,发酵上清液酶活最大可达102 U/mL,表明构建的重组毕赤酵母工程菌具有较好的工业化生产潜力。 相似文献
2.
3.
研究毕赤酵母工程菌GS-LM-18产高温碱性脂肪酶的发酵培养基。通过单因素及正交试验对发酵培养基种类、初始pH及甲醇诱导浓度进行优化,并进行10L发酵罐放大培养研究。结果表明,在诱导温度为30℃,甲醇诱导浓度为1.0%时,最优发酵培养基配方为葡萄糖2%,蛋白胨2%,酵母浸粉1.5%,硫酸镁0.05%,磷酸二氢钾0.11%,磷酸氢二钾0.044%;发酵初始pH为8。按优化条件进行10L发酵罐放大培养,获得发酵液酶活高达2 749U/mL,是摇瓶发酵水平的3.9倍,蛋白含量为1.8mg/mL,OD600为290。该毕赤酵母工程菌发酵生产高温碱性脂肪酶,具有工业化生产的潜力。 相似文献
4.
为实现新型CGTase在毕赤酵母中的高效表达,提取嗜热芽孢杆菌CHB1基因组DNA为模块,PCR扩增野生型基因CGT1,编码680个氨基酸。将该基因进行密码子优化CGT2,与野生型基因CGT1分别插入分泌型载体pPICZαA转化毕赤酵母GS115,获得两株酵母工程菌GS115/pPICZαA-CGT1和GS115/pPICZαA-CGT2;经甲醇诱导表达120 h后,CGT2活力达0.62U/mL,是优化前CGT1(0.37 U/mL)活性的1.7倍;进一步对GS115/pPICZαA-CGT2进行摇瓶发酵条件优化,确定其最优发酵条件为:pH 6.5、28℃、200 r/min、每24小时补加体积分数1.5%的甲醇诱导,120 h后其胞外酶活力达到1.26 U/mL,是优化前的两倍。 相似文献
5.
以克氏担孢酵母V3脂肪酶基因为研究对象,构建毕赤酵母稳定的高效表达系统。采用同源克隆法从克氏担孢酵母V3中获得一个脂肪酶基因,并将其构建到表达载体pPICZαA,转入毕赤酵母X33中,成功实现了克氏担孢酵母V3脂肪酶基因在毕赤酵母X33中的表达。重组工程菌摇瓶培养120 h后,酶活力可达18 U/mL。重组酶的最适反应温度为60 ℃,最适pH值为5.0。1 mmol/L的Mg2+、K+和Na+以及质量浓度为1 g/100 mL的曲通-100、吐温-80、吐温-20对重组KLIP具有激活作用。重组酶的最适底物为三硬脂酸甘油酯(C18)。 相似文献
6.
为了克服巴斯德毕赤酵母高密度发酵过程中的溶氧限制,提高外源蛋白的表达量,本文以启动子YPT介导透明颤菌血红蛋白(VHb)在培养过程中组成型表达。同时以启动子AOX1介导的南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)基因作为报告基因,使CALB在甲醇诱导阶段表达。另外,还将绿色荧光蛋白在过氧化物表面表达,将红色荧光蛋白在过氧化物基质中表达以检测信号肽能否定位在相应的位置。最后,将VHb分别在过氧化物酶体表面和基质两个位置表达,以观察表达位置的不同所产生的影响。通过SDS-PAGE和Western Blot分析表明,CALB和VHb在重组菌中成功实现了共表达。在限氧条件下,重组菌株GS115/ExVHb、GS115/VHbSKL的外源蛋白CALB的表达量比对照菌株GS115/CALB分别提高了27.57%和20.52%。这说明VHb与外源基因共表达可以改善酵母在发酵过程中的摄氧情况,提高外源蛋白的表达量。 相似文献
7.
本研究组合了基因密码子优化及分子伴侣共表达策略提高碱性果胶酶(PGL)在毕赤酵母中的胞外产量。基于Pichia pastoris密码子偏好性,优化了来源于Bacillus sp.WSHB04-02 PGL高热稳定性突变体K314M基因,并克隆至pPIC9K的Eco R I-Not I得到PGL表达载体p PIC9K-PGL。p PIC9K-PGL转化Pichia pastoris GS115(his-)得到重组菌GS115/PGL 14#,胞外PGL酶活达到301.32 U/mL,较优化前提高25.1%。在此基础上,分别及同时共表达分子伴侣内质网蛋白折叠氧化还原辅助因子(ERO1)和泛素共轭酶(UBC1)。结果显示,同时表达ERO1和UBC1(GS115/PGLl-ERO1-UBC1 2#)使重组菌胞外PGL较共表达前提高49.3%,达到450.12 U/mL。应用指数流加策略对重组菌株GS115/PGLl-ERO1-UBC1 2#进行3 L罐发酵,诱导发酵96h胞外PGL可达1 362.31 U/mL。研究结果对促进PGL产量的提升及其应用具有重要现实意义。 相似文献
8.
木聚糖酶是主要工业用酶制剂之一,在食品行业应用广泛.将编码枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis B2)木聚糖酶XYN的基因克隆到pPIC9K载体中,构建了分泌型表达载体pPIC9K-XYN,载体经线性化后转化Pichia pastoris GS115,G筛选获得了分泌表达XYN的重组毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K-XYN.初步研究表明:以山毛榉木聚糖为底物时,重组毕赤酵母工程菌摇瓶水平发酵上清液中木聚糖酶酶活可迭1542.6 U/mL,重组木聚糖酶最适温度为50℃,最适pH值为6.0,并显示出较好的热稳定性和宽pH适应性. 相似文献
9.
木聚糖酶是主要工业用酶制剂之一,在食品行业应用广泛。将编码枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis B2)木聚糖酶XYN的基因克隆到pPIC9K载体中,构建了分泌型表达载pPIC9K-XYN,载体经线性化后转化Pichia pastoris GS115,G筛选获得了分泌表达XYN的重组毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K-XYN。初步研究表明:以山毛榉木聚糖为底物时,重组毕赤酵母工程茵摇瓶水平发酵上清液中木聚糖酶酶活可达1542.6U/mL,重组木聚糖酶最适温度为50℃,最适pH值为6.0,并显示出较好的热稳定性和宽pH适应性。 相似文献
10.
11.
人对氧磷酶1(Human Paraoxonase 1,hPON1)是人体血液中的一种非专一性酯酶,可以水解多种有机磷化合物,被认为是一种有机磷农药中毒的解毒剂。为了得到较纯的具有活性的hPON1,本文采用巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris表达系统,对hPON1进行胞内表达。hPON1基因经过密码子优化后克隆至pPICZA表达载体上,构建得到pPICZA-PON1重组表达质粒,经线性化后转化至巴斯德毕赤酵母X33菌株中,筛选得到阳性重组菌株。将重组菌株进行摇瓶发酵120 h,酶活达0.15 U/mL。收集发酵液并细胞裂解后,用Ni-NTA螯合亲和层析的方法进行纯化,得到纯化的hPON1,SDS-PAGE结果显示表达产物的大小约37 ku,与预期的蛋白分子量相符。表达的重组hPON1的最适反应温度为45 ℃,最适pH为9.0。以上结果表明,本研究成功地表达并得到较纯的有活性的hPON1蛋白。 相似文献
12.
以右旋糖酐酶产生菌棘孢青霉F1001基因组为模板反转录合成右旋糖酐酶的cDNA(dex),基因全长1 866 bp,根据毕赤酵母密码子偏好性优化dex序列获得优化右旋糖酐酶基因(opt-dex),分别构建dex-pPICZαA和opt-dex-pPICZαA重组质粒,电击转入毕赤酵母X33中构建重组子。通过蓝色右旋糖酐T-2000平板以及摇瓶发酵筛选获得产右旋糖酐酶的重组酵母菌株。重组酶的酶学性质分析显示,重组酶分子质量65?kDa、最适pH?5.0、最适温度35?℃,专一作用于α-1,6糖苷键。在摇瓶水平上对重组毕赤酵母表达条件进行优化,优化培养条件为培养温度25?℃、初始pH?5.0、每24?h甲醇添加量1%(体积分数)、每24?h山梨醇添加量5?g/L、吐温-80添加量4?g/L、摇瓶装液量50?mL/500?mL锥形瓶,优化后的重组右旋糖酐酶分泌表达酶活力提高到240.74?U/mL。重组酵母X33是一株适合外源表达棘孢青霉右旋糖酐酶基因的工程菌,该重组酶可替代棘孢青霉右旋糖酐酶直接应用于工业生产催化制备右旋糖酐。 相似文献
13.
提取人肝总RNA,通过RT-PCR扩增出了Mn-SOD相应的基因片段,与载体相连后导入毕赤酵母中.根据酵母偏爱密码子对基因序列进行优化处理后的基因序列也导入毕赤酵母中.对这两种工程菌产SOD情况进行对比实验,发现经过基因序列优化的工程菌在产酶能力上具有更大的优势,这表明在基因序列表达中序列优化具有重要作用. 相似文献
14.
本研究全基因合成了来源于类芽孢杆菌的碱性果胶酶基因pel,克隆至p HKA载体上,成功实现其在毕赤酵母GS115中的分泌表达;并对信号肽和启动子进行优化,使得摇瓶发酵诱导168 h果胶裂解酶酶活达到432.36 U/m L。初步测定了果胶裂解酶Pel的基本酶学性质,其最适反应温度和p H分别为60℃、10.0;在50℃下处理300 min裂解酶活力保留90%以上,而在60℃下处理210 min,酶活力剩余约50%;在p H 9~12的50 m M各缓冲液中处理酶液16 h,酶活力仍然保留90%以上,该酶耐碱性强,但在偏酸性缓冲液中处理该酶,酶活力有所下降;同时研究了二价金属离子对果胶裂解酶活性力的影响,Ca~(2+)对Pel发挥裂解作用是必需的,Fe~(2+)、Mg~(2+)、Ni~(2+)对Pel均有激活作用,而金属离子螯合物EDTA的存在则使酶活力完全丧失;该酶在碱性条件下较好的稳定性决定了其潜在的工业应用前景。 相似文献
15.
16.
在50 L发酵罐水平对影响毕赤酵母表面展示米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor miehei lipase,RML)发酵因素进行了研究。最适初始菌体密度(OD600)约为250,最佳诱导pH为6.0;降低诱导温度能有效提高单位甲醇转化率,诱导温度为20℃和25℃时的转化率分别是30℃的1.56倍和1.32倍。在以上最适条件下单位干菌体展示酶活及生产强度分别达275.0 U/g和462.5 U/(L.h),比优化前提高54.5%。研究发现,山梨醇和甲醇混合补料有效地提高了诱导前期(t=12h)的产酶效率,当山梨醇和甲醇混合比例为1∶4及1∶5是以甲醇为单一碳源时酶活力的1.7倍。 相似文献
17.