Azocasein法测定嗜冷菌耐热胞外蛋白酶活性研究

人工底物偶氮酪蛋白(azocasein)在酶的作用下释放发色团,通过分光光度法可以定量嗜冷菌蛋白酶活性。经波长扫描,确定发色物质最大吸收波长为345nm。通过单因素试验,表明试验的最佳参数为:底物与酶反应时间2h,TCA质量分数为12%,TCA终止反应后溶液静止时间30min;该方法在一定浓度范围内线形关系良好(R2=0.9913),样本标准差为8.3×10-4～1.4×10-3,变异系数为0.21%～0.54%,检测限为1.33U/mL;通过对UHT中嗜冷菌蛋白酶活性测定,表明酶活性随温度升高、培养时间延长而增加。     

微量测定木聚糖酶活力的新方法——MBTH法

建立一种木聚糖酶活力的微量测定新方法--3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)法。根据木聚糖及其酶解产物的特殊性,研究MBTH法的显色条件,并以多点测定法对酶活力测定中的几个关键参数进行探讨。结果表明：蛋白质在其质量浓度低于30μg/mL时对测定无干扰;木聚糖溶液的最佳测定质量浓度为4mg/mL;较高的酶解温度会使木聚糖酶在测定过程中失活,因此,酶活力测定的最佳温度为30℃,而远低于该酶的最适温度;酶解时间为60min以内;酶解产物与MBTH试剂的反应时间应控制在13～16min之间,以15min为最佳。以酶解时间为30min计,本法检测限为0.135mU/mL,定量限为0.451mU/mL,适当延长酶解时间可相应提高酶活力检测灵敏度。该法准确度高,结果稳定,灵敏度远高于DNS法。     

肉牛唾液作为氯丙那林残留易获表征样本的可行性研究

目的 评估牛唾液作为氯丙那林残留易获表征样本的可行性。 方法 选取4只雌性健康育肥期肉牛(500±25 kg),其中1只作为对照,另3只作为试验组,每日将氯丙那林按1 mg/kg?bw 经基础日粮混饲试验组肉牛1次,连续给药30 d。基于高效液相色谱串联质谱技术,建立肉牛唾液中的氯丙那林残留量检测方法,并对给药期内肉牛唾液中的氯丙那林残留量进行跟踪测定。 结果供试品溶液中氯丙那林浓度在0.1～100 ng/mL范围内时,浓度-峰面积线性关系良好;方法检测限为1.0 ng/mL;方法回收率在73.7%～87.2%之间,重现性良好。混饲给药24 h后,3头受试牛唾液中氯丙那林残留量在33.5～119 ng/mL;连续给药25 d的期间内,尽管残留量表现出较大的个体差异,但受试牛唾液中氯丙那林残留量均呈逐步上升趋势,最高值达到273.6 ng/mL。结论 肉牛唾液较血液和尿液易于获取,基于高效液相色谱串联质谱法,能准确地反映养殖过程非法使用氯丙那林的情况,可作为行政监管的易获表征组织。     

豆浆中脲酶活性测定方法的建立及酶学性质的研究

生豆浆中的胰蛋白酶抑制因子在实验室中较难检测,但其活性与脲酶活性呈正相关。对此建立了豆浆中脲酶的定量检测方法,并对其酶学性质进行研究。结果表明,采用纳氏试剂测定豆浆脲酶活性的最适条件为:波长415nm,显色剂用量1mL,尿素浓度3%,反应温度35℃,反应时间7min。豆浆中脲酶的最佳作用pH为7.0,最适反应温度为35℃,脲酶在25～40℃之间贮存3h有较好的热稳定性,酶活保留率在80%以上。利用Lineweaver-Burk双倒数作图法求得脲酶的Vmax为0.173mmol/min,Km为0.0172mol/L。     

没食子酸对猪胰α-淀粉酶和蛋白酶的抑制作用

以没食子酸为材料,通过考察酶质量浓度、反应体系中底物和酶及没食子酸添加顺序、不同反应时间、不同没食子酸质量浓度对猪胰α-淀粉酶、蛋白酶的活性影响,研究没食子酸对两种酶的抑制作用。结果表明,在底物质量浓度为1g/100mL、体系添加顺序为酶液与抑制剂没食子酸溶液37℃预温5min后加入底物溶液的条件下,没食子酸抑制猪胰α-淀粉酶活性最优条件为:α-淀粉酶质量浓度0.64mg/mL,反应时间15min,没食子酸对α-淀粉酶的最大抑制率为95.52%;在体系添加顺序为酶液与抑制剂没食子酸溶液40℃预温5min后加入底物溶液的条件下,没食子酸抑制猪胰蛋白酶活性的最优条件为:胰蛋白酶质量浓度0.63mg/mL,反应时间30min,没食子酸对胰蛋白酶的最大抑制率为99.24%。没食子酸对两种酶的抑制效果均随没食子酸质量浓度的增大而增强。     

直接竞争化学发光酶免疫法检测谷物中的伏马菌素B1

建立1种检测谷物中伏马菌素B1的直接竞争化学发光酶免疫方法。该方法的最佳检测条件为:抗原包被质量浓度0.4μg/mL,酶标抗体3000倍稀释,竞争反应时间20min;检测限为0.13ng/mL,半抑制浓度(IC50)为1.43ng/mL,批内变异系数2.4%,批间变异系数9.2%,以玉米为样品的加标回收率达到100.2%～115.4%。谷物盲样的检测结果显示,该方法与酶联免疫吸附检测试剂盒、高效液相色谱检测结果的相关系数分别为0.9793、0.9851,三者之间无显著性差异,所建立的直接竞争化学发光酶免疫方法可用于谷物样品中伏马菌素B1的大规模快速筛查。     

豆浆中脲酶活性测定方法的建立及酶学性质的研究

生豆浆中的胰蛋白酶抑制因子在实验室中较难检测,但其活性与脲酶活性呈正相关。对此建立了豆浆中脲酶的定量检测方法,并对其酶学性质进行研究。结果表明,采用纳氏试剂测定豆浆脲酶活性的最适条件为:波长415nm,显色剂用量1mL,尿素浓度3%,反应温度35℃,反应时间7min。豆浆中脲酶的最佳作用pH为7.0,最适反应温度为35℃,脲酶在25～40℃之间贮存3h有较好的热稳定性,酶活保留率在80%以上。利用Lineweaver-Burk双倒数作图法求得脲酶的Vmax为0.173mmol/min,Km为0.0172mol/L。      

甲基红褪色光度法测定大米中过氧化氢酶活性

探讨甲基红褪色光度法测定过氧化氢酶(CAT)活性新方法。酶促反应后剩余的过氧化氢与甲基红发生褪色反应,Fe3+能够加速反应进程,褪色程度与酶活性有函数关系。根据酶促反应前后吸光度变化值△A确定CAT活性E。结果表明,在20 min内,酶促反应符合一级动力学反应的特征,CAT活性E (U/mL)在0~0.12 U/mL范围内与△A呈良好的线性关系：△A = 0.001+2.276E (U/mL),r=0.9989,检测限为0.07 U/mL。该方法用于不同产地,不同年份大米过氧化氢酶活性测定,并与两种常用方法进行了对比,结果满意。。     

高通量MBTH法测定β-葡聚糖酶的活力

本文建立了一种以3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)为氧化剂,以微孔板测定β-葡聚糖酶活力的新方法,该法特别适合于成分复杂的材料中痕量β-葡聚糖酶活力的测定。根据MBTH法测定β-葡聚糖酶解产物还原端基的特点,设计并优化了酶活力测定的关键参数。结果表明,在最适p H 5.0和30℃条件下测定β-葡聚糖酶活力,所得酶的工作浓度范围为0~12.3 m U/m L,饲料中酶的工作浓度范围均为0~2.94 U/g,本法测β-葡聚糖酶和四种饲料样品中酶的平均回收率分别为93.1%、97.5%、104.3%、97.0%、106.4%,β-葡聚糖酶活力检测限为0.37 m U/m L,定量限为1.24 m U/m L,四种饲料酶活力检测限分别为0.10 U/g、0.09 U/g、0.14 U/g、0.09 U/g,定量限分别为0.33 U/g、0.30 U/g、0.46 U/g、0.31 U/g。该法准确、低成本、省时、省力,特别是其灵敏度远高于DNS法,可极大程度上避开饲料中其它成分对测定的干扰。     

基于氧化型3,3’,5,5’-四甲基联苯胺纳米材料的比色和光热双模式检测谷胱甘肽

目的 建立基于氧化型3,3'',5,5''-四甲基联苯胺(3,3'',5,5'' -tetramethylbenzidine, TMB)的比色和光热双模式谷胱甘肽(glutathione, GSH)检测方法,用于食品中谷胱甘肽含量的快速检测。方法 利用普鲁士蓝(Prussian blue, PB)的过氧化物酶活性催化TMB与过氧化氢反应生成蓝绿色且具有光热转化性能的氧化型TMB。而GSH能将氧化型TMB还原为无色的TMB,使溶液吸光度值和光热转化产生的温升与GSH含量呈线性相关,实现比色法和光热法双模式定量检测GSH。结果 检测最优pH为3.5,反应时间为5 min,PB质量浓度为1 mg/mL,过氧化氢质量浓度为2.5 μL/mL,TMB质量浓度为15 mg/mL,光热照射时间为70 s,照射功率为3.5 W,最优条件下比色法检出限为14.8 μg/mL,光热法为1.1 μg/mL,光热检测灵敏度较比色法提高约13倍,检测可在10 min内完成,实际样品加标回收率在84~119%之间。结论 该方法具有良好的重复性、特异性和准确性,可用于保健食品、果蔬中GSH的快速检测。     

豆浆中脲酶活性快速检测试纸研究

目的制备一种对豆浆中脲酶活性进行快速定性检测的试纸。方法利用生豆浆中的脲酶能够对尿素专一性催化分解引起体系酸碱度的变化这一原理制备试纸,能够便捷、高效、准确地对豆浆的生熟度进行判定,从而筛查出脲酶活性为阳性的豆浆。结果确定最优的试剂配比为10 mL 0.4g/L苯酚红试剂和0.005g尿素,选择最佳的显色时间为20min之内,制备出的快检试纸浸入到豆浆样品后可以直接读取实验结果,对脲酶活性进行快速判定。结论该试纸制备方法简单,易于操作,检测重现性较好,方法毒性更小,而且在常温下能够长期储存,可为实施豆浆的现场监督和快速检测提供有效的技术支撑。     

酸度计法快速检测牛奶中残留的β-内酰胺酶

为了快速、准确地检测牛奶制品中残留的β- 内酰胺酶的含量,利用β- 内酰胺酶分解青霉素产酸使牛奶pH 值下降的原理,对人工添加了β- 内酰胺酶的牛奶制品与青霉素反应后pH 值的下降规律进行研究。得到牛奶中残留的β- 内酰胺酶与青霉素反应的较适宜条件,从而获得快速检测牛奶制品中残留的β- 内酰胺酶的方法。结果确定牛奶制品中残留的β- 内酰胺酶与青霉素反应的适宜条件为温度33℃、底物质量浓度10mg/mL,检测时间仅为60min。此方法对液态纯牛奶中β- 内酰胺酶的最低检出限为8.92U/mL。     

Urease production by Streptococcus thermophilus

In order to identify potential alternative sources of urease for the removal of urea from alcoholic beverages, 205 strains of lactic acid bacteria belonging to 27 different species were screened for urease production. Only Streptococcus thermophilus produced urease. Cell permeabilization with toluene allowed to increase activity significantly. Optimal pH for urease activity in whole and permeabilized cells and of cell free extracts differed slightly, but was in the range 6.0-7.0. Significant activity was retained at pH 3.0 and 8.0, and, for cell free extracts, at pH 4.0 in the presence of ethanol. Urease production was evaluated in fermentations with pH control (5.25-6.5) and without pH control. Very little urease was produced in absence of urea, which at 5g/l slowed growth significantly in fermentations without pH control, but prevented a decrease in pH below 5.1 and resulted in higher final biomass. Optimal pH for growth was between 6.0 and 6.5 but specific urease activity was higher for fermentations at low pH at the beginning of the exponential phase. However, a higher total urease activity was obtained at pH 6.0 and 6.5 because of higher biomass. Potential technological applications of urease production by S. thermophilus are discussed.     

Fe2+-催化臧红T褪色光度法测定过氧化氢酶活性

基于Fe²⁺-H₂O₂-臧红T褪色体系完成过氧化氢酶活性测定。H₂O₂氧化臧红T引起吸光度变小,褪色反应又受酶分解反应的抑制,加酶前后吸光度变化(ΔA)与酶活性有相关性。取酶分解反应和褪色反应的最佳条件,CAT活性在0.00~0.02U/mL之间与ΔA呈现良好的线性关系:ΔA=-0.0012+9.5528E(U/mL)(r=0.9990),检出限为6.28×10^-3U/mL;采用酶失活样品液作空白,可有效排除样品共存还原性物质的干扰。方法用于新鲜大米样品检测,结果令人满意。     

酶电极法测定发酵酒中尿素的含量

为实现准确、快速检测发酵酒中尿素含量,本文以明胶和壳聚糖为包埋材料,透析膜为载体,戊二醛为交联剂,用包埋交联吸附相结合的方法制作了固定化脲酶膜,结合铵离子选择性电极实现了尿素含量的快速测定,研究了脲酶固定化的条件和尿素传感器的响应性能,并应用于实际样品的测定。实验表明：脲酶固定化最适戊二醛浓度为0．05％,最适交联时间为1．5h;尿素传感器最佳使用环境为温度40℃,最适溶液pH值5．0,线性范围为2～50mg／L,最低检测限为0．5mg／L,线性良好（RE〉0．999）,重复性好（RSD=1.45％）,可靠性较高。此方法每片脲酶膜可进行多次测量,且可更换,降低了测量成本,可用于实现酸1生环境下发酵酒中尿素含量的快速检测,为控制发酵酒的营养、质量及食用安全提供技术支持。     

双孢菇酪氨酸酶的提取纯化及其性质

以双孢菇为原料,通过硫酸铵盐溶、盐析、透析和反渗透方法提取双孢菇酪氨酸酶并进行纯化,探究其性质。结果表明,经丙酮沉淀和硫酸铵盐溶初步纯化的酪氨酸酶与粗酶相比较,酶活力(25 U/mL)提高5倍,比活力提高8.75倍;经60%饱和硫酸铵盐析、半透膜透析、反渗透进一步纯化后的酪氨酸酶与粗酶相比较,酶活力(25 U/mL)提高68.4倍,比活力提高501.2倍。通过测定双孢菇酪氨酸酶的性质发现,最适pH为6.5,最适反应温度为30℃,米氏常数为0.543 mmol/L,最大反应速度为41.5 U/min,反应速度与酶量、底物浓度的关系均符合酶促反应动力学。D-异抗坏血酸可有效抑制双孢菇酪氨酶的活性。     

基于MnO2纳米片类氧化酶特性的有机磷农药荧光分析方法建立

利用MnO2纳米片类氧化酶特性并结合有机磷农药的酶抑制原理,构建一种快速、简便、高灵敏有机磷农药荧光分析方法.通过测定反应体系荧光强度前后的变化,可以检测样品中有机磷农药的含量.通过优化酶浓度、底物浓度和反应时间,发现乙酰胆碱酯酶浓度为9.375 U/L,底物浓度为10mmol/L,反应时间为11 min时,该荧光分析...     

Application of an Acid Urease to Wine: Determination of Trace Urea in Wine

An improved method of urea detection having a sensitivity to 0.05 ppm, applicable to white wines, was developed by modifying Jansen's procedure. The urea concentration in many commercial bottled wines was found to be around 2 ppm. The method was utilized to the urea degradation by an acid urease which degraded naturally occurring urea of 0.5–2 ppm at the same reaction rate as that for the spiked urea of 30 ppm in the same white wine. Wine treatment with the acid urease also reduced ethyl carbamate formed by heating.     

儿茶素对马铃薯酪氨酸酶的抑制作用

采用分光光度计法测定酶液加入量、底物浓度、温度、pH 值对酶活力的影响,确定最适反应条件。在30℃、pH6.8 的Na2HPO4-NaH2PO4 缓冲体系中,采用酶动力学方法研究儿茶素对马铃薯酪氨酸酶的抑制效应。结果表明：反应最适条件为酶液加入量0.5mL、底物浓度2mmol/L、温度30℃、pH6.8。儿茶素对马铃薯酪氨酸酶有抑制作用,抑制率达到50% 的儿茶素质量浓度(IC50)约为0.27mg/mL;Lineweaver-Burk 图显示儿茶素对马铃薯酪氨酸酶的抑制作用表现为竞争型抑制,抑制常数(KI)为0.16mg/mL。