德尔卑沙门氏菌血清型分子检测靶点筛选及多重PCR检测方法的建立

利用比较基因组技术筛选到德尔卑沙门氏菌(Salmonella Derby, SD)的血清型特异性基因,以此为靶点设计引物与139-141引物共同构建多重PCR检测体系,对其特异性、菌落灵敏度、抗干扰能力及人工污染等方面进行评价。当扩增出171、284和512 bp电泳条带时,检测结果为阳性。通过该方法检测39株沙门氏菌和18株非沙门氏菌,表现出100%特异性,该检测体系的DNA灵敏度为383.2 pg/μL,菌落灵敏度为52 CFU/mL。当SD与自然(猪肉、鸡肉和牛肉)的背景菌群浓度比为1∶10~4时,该检测体系能获得清晰、准确的3条扩增条带。在人工污染的猪肉、鸡肉和牛肉样品的检测中,增菌10 h,检测灵敏度为3.8 CFU/25g。该检测方法准确灵敏的检测SD,可在食品安全领域得到广泛应用。     

沙门氏菌多重PCR检测方法的建立

采用CTAB/NaCl法提取沙门氏菌及对照菌株的基因组DNA。对引物浓度、TaqDNA聚合酶用量进行优化,建立了沙门氏菌属特异基因-hut基因(495bp)、hilA基因(490bp)、invA基因(284bp)和hns基因(152bp)间的多重PCR检测方法,并进行了灵敏度测试。结果表明,建立的多重PCR检测结果与预期一致,二重PCR的检测灵敏度与单一PCR的一致,三重PCR检测灵敏度有所下降。     

乳品中3种常见细菌多重PCR检测方法的建立

分别以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌标准株为样本,提取其DNA,以大肠杆菌的pho A基因、金黄色葡萄球菌的nuc A基因和沙门氏菌的inv A基因作为靶基因,建立可以同时检测这3种菌株的多重PCR方法。与国标法对照,探讨多重PCR技术检测乳品样品中3种细菌的灵敏性和特异性。结果表明,建立的多重PCR检测方法与国标法检测的结果一致,人工模拟试验结果稳定,多重PCR具有快速、敏感和特异性强的特点。     

3种食源性致病菌多重PCR检测体系的建立

目的:探究用PCR方法检测食品中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonella spp.)及志贺氏菌(Shigella spp.)的检测灵敏度,建立快速检测3种食源性致病菌的多重PCR方法。方法:分别依据金黄色葡萄球菌的fem A、沙门氏菌的hil A基因及志贺氏菌的ipa H基因设计3对特异性引物,对3对引物进行多重PCR反应体系构建与优化。结果:建立的多重PCR方法具有灵敏度高、特异性强、方便快捷的优点。结论:研究结果为上述3种食源性致病菌快速检测试剂盒的研发及在食品安全检测工作中的应用提供了重要技术保障。     

4种鳕鱼多重PCR检测方法建立

为了建立可对鳕鱼DNA进行特异性检测的PCR方法,从Gen Bank数据库下载太平洋鳕、大西洋鳕、狭鳕、绿青鳕4种鳕鱼的突触素样蛋白(pantophysin Pan I)基因序列,并用Bioedit 7.0软件对上述不同鳕鱼的该基因碱基序列进行比较。根据引物设计的基本原则,选择了鳕鱼与其他鱼类碱基序列上差异位点较多片段,设计出太平洋鳕、大西洋鳕、狭鳕、绿青鳕PCR特异性引物。用该引物分别对从7种鳕鱼和14种非鳕鱼鱼类的肌肉、脏器组织中提取的DNA进行PCR扩增。实验将所设计的引物通过两种引物组合、三种引物组合以及四种引物组合,进行多重PCR试验,结果表明,大西洋鳕、绿青鳕、太平洋鳕和狭鳕四种鳕鱼分别出现597、392、266、527 bp大小的清晰条带,4种引物之间相互不干扰,具有显著特异性。该方法具有较高灵敏度,低至4 ng/μL混合样品仍可检出。     

三种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立

目的:建立同时快速检测沙门氏菌、志贺氏菌和肠出血性大肠杆菌O157∶H7的多重PCR方法。方法:根据沙门氏菌的invA基因、志贺氏菌的ipaH基因及肠出血性大肠杆菌O157∶H7的uidA基因设计3对引物,通过单因素实验、L9(34)正交实验优化反应体系,并对多重PCR扩增的敏感性进行分析。结果:3对引物能特异性扩增出495、620、252bp的目的片段;在最优多重PCR反应体系下,多重PCR检测3种致病菌的灵敏度达104CFU/mL;将该法应用于人工污染实验,可在5h内得到准确、稳定的检测结果。结论:该方法操作简单、检测特异性和灵敏度较高,能够实现对沙门氏菌、志贺氏菌和肠出血性大肠杆菌O157∶H7 3种食源性致病菌的快速监控和诊断。      

冻虾类海产品中3种致病菌的多重PCR快速检测技术的建立

建立快速检测冻虾类海产品中沙门氏菌(Salmonella typli)、副溶血性弧菌(Vibrio parahae-molyticus)和单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的多重PCR方法。根据3种致病菌的靶基因,分别设计了3对引物,进行PCR扩增及反应条件的优化,建立了三重PCR检测虾类海产品中沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生李斯特菌的方法,实现了对这3种致病菌的同时检测。该方法操作简单,检测周期短,具有灵敏度高、特异性强等优点,能够快速地实现对海产品中多种致病菌的诊断和监控。     

散装即食食品中3种食源性致病菌多重荧光定量PCR检测方法的建立

该研究旨在建立散装即食食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌3种食源性致病菌的多重荧光定量PCR检测方法,根据沙门氏菌侵染上皮细胞表面蛋白的invA基因、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶(nuc)基因、蜡样芽孢杆菌的cer A基因分别设计3对特异性引物与探针,并对体系中引物探针的浓度以及退火温度等反应条件进行优化筛选,建立多重荧光定量PCR检测方法,同时评估其特异性、灵敏性及重复性,并应用该方法检测散装即食食品样本中致病菌,同时与国标法比对。结果表明,建立的多重荧光定量PCR检测方法能特异性地扩增沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌3种目标菌,其他菌株均不扩增,灵敏度分别为4×10²、3×10²、2×10² cfu/mL,且批内和批间变异系数均小于2%,重复性和稳定性良好。同时用国标法和多重荧光定量PCR法对100份散装即食食品样本进行检测比对,多重荧光定量PCR法的阳性检出率略高于传统国标法,且检测时间大幅缩短。综上所述,建立的多重荧光定量PCR检测方法特异性强、灵敏度高、快速准确,在食源性致病菌快速筛查方面具有良好...     

通用引物多重PCR技术检测3种病原微生物

为寻找快速且准确的病原微生物检测方法,在普通多重PCR(polymerase chain reaction)技术的基础上研究一种新的通用引物多重PCR(universal primers-multiplex PCR,UP-M-PCR)技术。利用该技术对食品中主要的3种致病菌——大肠杆菌、单增李斯特菌和沙门氏菌进行同时检测,经过单重PCR验证、二重以及三重UP-PCR反应条件和体系优化。结果表明,该方法的最低检测限为0.5pg目标DNA,复合引物和通用引物的加入量分别为2nmol/L和300nmol/L。此方法检测灵敏度高、病原菌检测限低,可在实践中应用。     

多重PCR法对乳制品中3种致病菌的同时快速检测

通过调整混合培养基的配比摸索乳制品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的快速共增菌条件,并选择稳定高效的细菌基因组DNA提取方法,然后根据三种目标致病菌的保守基因分别设计多重PCR引物,对致病菌进行多重PCR检测.结果表明,方法具有良好的针对目标致病菌的特异性,检测限可达102mL1.且反应体系各组分间未见交叉干扰.对人工污染的乳品盲样检测验证了方法的实用性.     

四重荧光定量PCR法鉴定肠炎、鼠伤寒以及伤寒沙门氏菌

目的建立四重荧光定量PCR体系鉴定肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌以及伤寒沙门氏菌。方法针对沙门氏菌属特异性ompC基因、肠炎沙门氏菌sdf基因、鼠伤寒沙门氏菌STM4495和伤寒沙门氏菌STY2021序列设计引物和TaqMan探针,建立多重荧光定量PCR体系,进行特异性与敏感性研究。结果 28株不同血清型的沙门氏菌均扩增出ompC基因,其他13株非沙门氏菌均未出现ompC的非特异性扩增。sdf、STM4495、STY2021的探针和引物分别特异性扩增出肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌以及伤寒沙门氏菌,而25株其他血清型沙门氏菌以及13株非沙门氏菌均未见扩增曲线。敏感性试验显示,该体系的最低检测限分别为48 pg/mL(ompC)、560 pg/mL(sdf)、530 pg/mL(STM4495)、35 pg/mL(STY2021)。结论该方法特异好、灵敏高、能够快速检测沙门氏菌并鉴定肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌以及伤寒沙门氏菌。     

多重实时荧光定量PCR同时检测冷冻蔬菜中4种食源性致病菌

目的 建立一种基于TaqMan探针的多重实时荧光定量PCR(multiplex quantitative real-time PCR, multiplex qPCR)同时检测冷冻蔬菜中4种食源性致病菌的方法。方法 针对金黄色葡萄球菌nuc基因、痢疾志贺菌rfc基因、沙门氏菌invA基因、单增李斯特氏菌hly基因, 设计4对引物和探针, 优化反应体系, 建立稳定的多重qPCR反应体系。通过阳性菌株污染的方法验证体系的特异性, 并确定了冷冻蔬菜样品在细菌水平的检出限。结果 各对引物和探针对目标菌有较强的特异性, 对其他非目标菌进行检测均未检出, 人工污染冷冻蔬菜中志贺菌的检出限为102 CFU/g, 沙门氏菌和单增李斯特氏菌的检出限均为103 CFU/g, 金黄色葡萄球菌的检出限为104 CFU/g。结论 本研究可以实现冷冻蔬菜样品中4种致病菌qPCR高效检测。     

Multiplex PCR for the simultaneous detection of Salmonella spp. and Salmonella Enteritidis in food

Multiplex PCR assay (mPCR) for the detection of Salmonella spp. and S. Enteritidis was developed in this study using artificially contaminated chicken carcasses. The assay showed 100% specificity to detect approximately 1 CFU of Salmonella in 10 g of chicken skin after non‐selective enrichment. The mPCR was evaluated in Minas cheese, fresh pork sausage and chicken carcasses commercially available. Salmonella spp. was detected in nine of sixty‐six chicken carcasses, five of fifty‐two cheese samples, and five of fifty‐two sausage samples. The serovar Enteritidis was detected in two samples of contaminated sausage. The mPCR results were confirmed by conventional culture and biochemical identification of the isolates. Serotyping confirmed the presence of S. Enteritidis in sausage samples and showed contamination by serovars Schwarzengrund and Montevideo in chicken carcasses.     

产黄曲霉毒素真菌多重PCR检测体系的建立

依据标准SN/T 2582—2010《产黄曲霉毒素真菌PCR检测方法》推荐的产黄曲霉毒素调节基因afl R、柄曲霉素转甲氧基酶基因omt-1、杂色曲霉素A脱氢酶基因ver-1及真菌共有的5.8S r DNA的ITS序列分别设计4对特异性引物,对4对引物进行多重PCR反应体系构建与优化,建立快速检测产黄曲霉毒素真菌的多重PCR方法,并应用10株试验菌株对所建立的检测方法进行验证。结果表明,建立的多重PCR方法具有灵敏度高、特异性强、方便快捷的优点,为产黄曲霉毒素真菌快速检测试剂盒的研发及应用提供了重要技术保障。     

多重PCR快速检测两种致泻性大肠杆菌方法的建立

本研究以肠出血性大肠杆菌O157∶H7及肠侵袭性大肠杆菌为目标菌,针对大肠杆菌共同基因uid A、肠出血性大肠杆菌O157∶H7的特异基因O-antigen、肠侵袭性大肠杆菌的特异基因ipa H设计3对引物,建立并优化了检测两种菌的多重PCR检测方法,进行了特异性验证和灵敏度分析,并应用于人工接种新鲜莴苣的检测中。实验结果表明,本研究建立的三重PCR快速检测两种致病菌的检出限为6.3×103CFU/m L,具有较好的灵敏度和特异性。利用所建立的多重PCR方法对人工接种肠出血性大肠杆菌O157∶H7和肠侵袭性大肠杆菌的新鲜莴苣进行检测,检出限为7.8×104CFU/m L。此方法能够对肠出血性大肠杆菌O157∶H7和肠侵袭性大肠杆菌两种食源性致病菌进行快速检测。      

多重实时荧光定量PCR快速检测婴幼儿奶粉中沙门氏菌、克罗诺杆菌和金黄色葡萄球菌

目的建立多重实时荧光定量PCR(multiplex quantitative real-time PCR,multiplex qPCR)快速检测奶粉中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和克罗诺杆菌3种常见致病菌的方法。方法筛选目标菌株的特异性引物与探针,优化反应体系,建立稳定的多重q PCR反应体系。通过阳性菌株加标的方式验证体系的特异性,并确定人工污染奶粉的检出限。结果各对引物探针对目标菌株均能扩增,多重实时荧光PCR未发现交叉反应,对17株非目标菌进行检测均未检出,人工污染奶粉中克罗诺杆菌和沙门氏菌的检出限均为10~3 CFU/mL,金黄色葡萄球菌的检出限为10~4 CFU/mL。结论本研究方法可实现婴幼儿奶粉样品中3种致病菌qPCR高效率检测。     

6种肉类成分多重PCR鉴别方法的建立及应用

目的建立单管同步快速鉴别水牛、黄牛、牦牛、山羊、驴和鸭的物种成分的多重PCR鉴别方法。方法对水牛、黄牛、牦牛、山羊、驴和鸭的线粒体全基因组,采用Primer-blast在线软件,设计6对特异性引物,优化反应条件,建立PCR体系。结果该方法仅对水牛、黄牛、牦牛、山羊、驴和鸭肉有特异性扩增,与其他动物的核酸无交叉反应;同时检测6种物种成分的检测低限为10-4 ng/μL。在鸭肉中分别模拟掺入牛肉、羊肉和驴肉成分,方法对鸭肉中掺入牛成分、羊成分和驴成分中的检出限均小于0.5%。结论该方法特异性好、敏感度高,可以被应用于水牛、牦牛、黄牛、山羊、驴和鸭的物种成分鉴别。     

食品中沙门氏菌恒温隔绝式PCR检测方法的建立

为弥补传统培养方法耗时长和现场检测步骤繁琐等缺陷,该研究建立了一种针对食品中沙门氏菌的恒温隔绝式PCR快速检测方法.根据沙门氏菌的invA基因设计特异性引物和探针,通过水浴法快速提取细菌DNA,优化引物、探针以及模板用量,建立了一种基于恒温隔绝式PCR快速检测沙门氏菌的方法,并对方法的特异性和灵敏度及稳定性进行评价,最...