营养面条生产过程中克罗诺杆菌污染状况与溯源研究

目的调查营养面条生产加工环节中肠杆菌科和克罗诺杆菌的污染状况,对克罗诺杆菌进行溯源研究。方法采集某营养面条生产企业的生产原料、中间产品、环境、设备、人员和终产品等共101份样品,进行肠杆菌科和克罗诺杆菌检测。利用脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术对克罗诺杆菌进行分子分型和溯源研究。结果在整个生产过程的样品中,肠杆菌科检出率为53.5%(54/101),其中环境样品的肠杆菌科检出率最高(72.7%,16/22);克罗诺杆菌检出率为29.7%(30/101),其中终产品的克罗诺杆菌检出率最高(50.0%,5/10)。31株克罗诺杆菌分离株共获得20个PFGE带型,多样性较高,经聚类分析可划分为6个簇型。结论营养面条生产加工环节中存在克罗诺杆菌的污染状况,该致病菌污染可能与原料污染有关。克罗诺杆菌的污染问题需要引起食品安全管理部门重视,加强生产加工过程监测,制定有效措施予以控制。     

克罗诺杆菌检测方法的研究进展

克罗诺杆菌是一种食源性致病菌,能够感染婴幼儿并导致坏死性小肠结肠炎、脑膜炎和菌血症,死亡率最高可达80%。克罗诺杆菌广泛地存在于食品和自然环境当中,并且具有极强的抗干燥能力,因此容易污染乳粉和其原料并在其中长期存在。控制克罗诺杆菌的污染需要增强食品生产质量控制,也需要开发相应的检测技术。本研究主要从生理生化检测、免疫学检测技术、核酸检测技术等对克罗诺杆菌的检测方法进行综述,对上述各种检测方法的原理和优劣势进行了分析和总结,并且对克罗诺杆菌检测方法的未来发展进行展望。需要指出的是,由于克罗诺杆菌在婴幼儿食品中污染量低、婴幼儿食品基质成分复杂且检测要求高的特点,增菌培养是不同检测方法不可缺少的步骤并且是检测的限速步骤,未来还需要对这一环节进行更为深入的研究以提升检测效率。     

谷类食品中克罗诺杆菌的分离与鉴定

为了解谷类食品中克罗诺杆菌(Cronobacter spp.)的污染情况。本研究采集了100份谷类食品样品,采用国家标准GB 4789.40-2010分离克罗诺杆菌,并利用基于ITS和Omp A特异基因片段的PCR鉴定方法、16S r DNA基因序列分析等方法对可疑克罗诺杆菌进行了初步的鉴定。结果发现谷类食品中克罗诺杆菌的污染率为21.0%,并分离出21株可疑克罗诺杆菌,其中17株(占总数的81.0%)被初步鉴定为阪崎克罗诺杆菌(C.sakazakii),3株(占总数的14.2%)为都柏林克罗诺杆菌(C.dublinensis),1株(占总数的4.8%)可能为尤尼沃斯克罗诺杆菌(C.universalis)或苏黎世克罗诺杆菌(C.turicensis)。研究结果表明市售谷类食品中存在食源性克罗诺杆菌的污染,应该加强谷类食品中克罗诺杆菌的流行病学监测。     

婴幼儿配方米粉克罗诺杆菌污染调查与分析

目的:了解广西区内市售婴幼儿配方米粉中克罗诺杆菌污染情况,并对添加的配方原料与受污染情况相关性进行初步分析,为生产企业改良生产流程提供依据。方法:采集广西区内市售不同添加成分的婴幼儿配方米粉125份,进行克罗诺杆菌分离鉴定。通过PCR方法对分离菌株fus A基因进行扩增并测序,在克罗诺菌多位点序列分型数据库比对分析,鉴定细菌种类。结果:在受检样品中克罗诺杆菌检出率为16.00%(20/125)。不同添加成分的污染率不同,从高到低分别为淮山(淮莲)配方米粉污染26.09%(12/46)、蔬果类配方米粉15.00%(3/20)、高蛋白配方米粉8.82%(3/34)、营养米粉(无添加)8.00%(2/25)。MLST比对表明分离的20株克罗诺杆菌中包括14株C.sakazakii、3株C.malonaticus,2株C.dublinensis和1株C.muytjensii。结论:广西区市售婴幼儿配方米粉受克罗诺杆菌污染较为严重,且污染与配方原料添加的种类有关,污染的主要菌种为C.sakazakii。     

阪崎克罗诺杆菌耐热性和耐酸碱性的研究

研究阪崎克罗诺杆菌分离菌株对温度及酸碱的耐受性,从而对婴儿配方粉生产过程中的阪崎克罗诺杆菌的污染进行控制。对4株来源不同的阪崎克罗诺杆菌进行不同温度和酸碱条件的处理,并将处理后的菌液涂布于TSA培养基观察菌株的存活情况;以阪崎克罗诺杆菌ATCC 29544为阳性对照。结果显示,不同来源的菌株对温度及酸碱的耐受性存在一定的差异,这为降低该菌的感染风险提供了依据。     

食品香辛料和调味品中克罗诺杆菌的分离与鉴定

利用生理生化鉴定方法和分子生物学方法对从湖南、湖北、江苏和上海等地的8个地区采集的64份干制食品香辛料和调味品样品进行了克罗诺杆菌分离与鉴定,结果从19份样品中检出了克罗诺杆菌,污染率为29.7%,其中检出率较高的样品为白胡椒粉、花椒粉和红辣椒粉,污染率分别为62.5%、50.0%和33.3%。本研究从采样的7个地区的样品中检出了克罗诺杆菌,其中检出率最高的地区为湖南永州,其次为上海市和湖北赤壁,检出率分别为50.0%、37.5%和33.3%。利用基于fus A基因序列分析的方法对克罗诺杆菌分离株进行了种的水平的鉴定,结果将本研究分离得到的克罗诺杆菌鉴定为5个种,其中9株(47.4%)被鉴定为阪崎克罗诺杆菌(C.sakazakii),4株(21.0%)为苏黎世克罗诺杆菌(C.turicensis),3株(15.8%)为都柏林克罗诺杆菌(C.dublinensis),2株(10.5%)为丙二酸盐阳性克罗诺杆菌(C.malonaticus),1株(5.3%)为尤尼沃斯克罗诺杆菌(C.universalis)。研究结果表明市售干制食品香辛料和调味品中存在克罗诺杆菌的污染,应该加强对该类食品中克罗诺杆菌的流行病学监测。     

粮食加工品和肉制品中克罗诺杆菌的污染状况及致病性阪崎克罗诺杆菌生物膜形成能力研究

目的 了解我国粮食加工品和肉制品中克罗诺杆菌(Cronobacter spp.)的污染情况及致病性。方法对我国8个省份的226份粮食加工品和肉制品的克罗诺杆菌污染情况进行检测,对分离菌株进行种间鉴定,并针对阪崎克罗诺杆菌进行脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis, PFGE)分型及生物膜形成能力研究。结果 粮食加工品和肉制品中克罗诺杆菌的检出率分别为21.92%和12.50%。种间鉴定显示,115株分离菌株中有94株阪崎克罗诺杆菌。PFGE和结晶紫染色结果表明,94株阪崎克罗诺杆菌可被分为49个型别,均在36～60 h内达到最大菌膜生产量。结论 上述8个省份粮食加工品和肉制品中存在克罗诺杆菌污染,其中阪崎克罗诺杆菌有多种PFGE带型,且均具有生物膜形成能力,本研究可为食品安全风险评估及标准制定提供基础数据。     

婴儿配方乳粉中克罗诺杆菌的分离鉴定及分型

采集了市场中的220份婴儿配方乳粉,利用生理生化和分子鉴定的方法对采集样品中的克罗诺杆菌进行了分离鉴定,检出10株克罗诺杆菌,污染率为4.55%。利用16S r RNA和omp A基因对克罗诺杆菌进行分型分析,都将10株克罗诺杆菌分为了2个簇,但是不同分型方法各个簇中的菌株不同。结果表明16S r RNA和omp A基因可以用于克罗诺杆菌的分型,但是辨识度不高。     

河南省市售婴幼儿配方食品中克罗诺杆菌的分子分型及系统发育研究

目的 了解河南省市售婴幼儿配方食品中克罗诺杆菌污染情况、分子分型特征及耐药情况,分析不同菌株间的系统发育进化关系。方法 采集婴幼儿配方食品227份,按照GB 4789.40—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验》方法进行克罗诺杆菌的分离鉴定,并用微量肉汤稀释法和脉冲场凝胶电泳(PFGE)对分离株进行药敏实验和溯源分析,采用16S rRNA和多位点序列分型(MLST)方法进行种属鉴定和系统发育进化分析。结果 227份婴幼儿配方食品中检出13株克罗诺杆菌,分别属于阪崎克罗诺杆菌、苏黎世克罗诺杆菌和都柏林克罗诺杆菌。13株克罗诺杆菌药敏结果显示头孢唑啉耐药率达到84.6%(11/13),PFGE分型得到7个带型,MLST共分为6个ST型,其中ST1为优势型别,相同PFGE型的菌株也有相同的MLST型。结论 河南省市售婴幼儿配方食品中克罗诺杆菌污染以阪崎克罗诺杆菌为主,种属和基因型具有多样性,系统进化树分析结果显示MLST能够更好地说明种水平之间的亲缘关系。     

免疫富集联合MALDI-TOF MS检测奶粉中阪崎克罗诺杆菌的方法建立

目的:制备高效且特异性好的阪崎克罗诺杆菌抗体及其免疫磁珠,建立免疫富集联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)检测奶粉中的阪崎克罗诺杆菌的方法。方法:制备阪崎克罗诺杆菌混菌抗体及其免疫磁珠,对免疫磁珠分别在纯培养及奶粉基质中的捕获率进行研究,利用MALDI-TOF MS对不同奶粉基质中不同杂菌污染条件下的检测样本进行鉴定并验证免疫磁珠的特异性。结果:阪崎克罗诺杆菌免疫磁珠在纯培养条件及奶粉基质中对4株阪崎克罗诺杆菌及其混菌的捕获率均>80%,联合MALDI-TOF MS鉴定结果显示在奶粉基质中不同杂菌污染条件下具有较好的鉴定结果,即使在高比例（1:100）杂菌污染条件下,仍能准确鉴定奶粉中阪崎克罗诺杆菌,此时检测样品中阪崎克罗诺杆菌浓度仅为20 CFU/mL。结论:本研究建立了一种操作简便、鉴定结果准确的免疫富集联合MALDI-TOF MS检测奶粉中阪崎克罗诺杆菌的方法,为奶粉中阪崎克罗诺杆菌的快速准确鉴定提供了新的方法参考。     

婴儿配方粉干法加工过程肠杆菌科和克罗诺杆菌属监测

目的了解婴儿配方粉干法加工过程中肠杆菌科和克罗诺杆菌属的分布,掌握终产品中克罗诺杆菌属的污染途径。方法对4家企业的产品相关样品(原辅料、中间产品和终产品)和环境进行监测,选择传统分离培养方法对肠杆菌科和克罗诺杆菌属进行检验,利用脉冲场凝胶电泳技术进行克罗诺杆菌属溯源研究。结果地面、空调回风口和使用后的清洁工具中肠杆菌科检出率较高,均在20%左右。产品相关样品、清洁作业区环境相关样品中克罗诺杆菌属检出率分别为2.56%(12/468)和0.27%(6/2 185),22株分离株共有13种脉冲场凝胶电泳(PFGE)带型,每个企业的指纹图谱各不相同,其中有四组分离株分别具有同源性。终产品中克罗诺杆菌属的污染主要来自原辅料,其次为环境中定植的菌株。结论该研究对掌握婴儿配方粉加工企业肠杆菌科和克罗诺杆菌属的污染分布及终产品中克罗诺杆菌属的可能污染源,制定加工过程的卫生控制措施,确保终产品的安全具有重要意义。     

我国婴儿配方粉来源的克罗诺杆菌脉冲场凝胶电泳分子分型和多位点序列分型研究

目的探讨我国婴儿配方粉污染克罗诺杆菌的主要分子分型特征,分析不同地区间菌株亲缘相关性,为我国克罗诺杆菌引起的疾病溯源提供技术支撑。方法采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分型(MLST)两种方法,对全国19个省/自治区/直辖市婴儿配方粉来源的49株克罗诺杆菌进行分型研究。结果 49株克罗诺杆菌PFGE分型得到38个带型,未发现有明显的优势分型和聚集现象。MLST共获得15个已知序列型(ST型)和2个新ST型,ST4、ST1和ST64为优势型别,分别占菌株总数的20.4%(10/49)、18.4%(9/49)、10.2%(5/49)。PFGE型和MLST型结果分析表明,具有相同PFGE型的菌株也有相同的MLST型,而相同MLST型却不一定具有较高的亲缘关系。结论我国婴儿配方粉来源的克罗诺杆菌图谱具有高多态性和离散性,据此预测我国婴儿配方粉污染克罗诺杆菌导致婴儿患病以散发为主,出现多人患病的暴发事件几率较低。     

Application of pulsed-field gel electrophoresis to characterise and trace the prevalence of Enterobacter sakazakii in an infant formula processing facility

Enterobacter sakazakii (E. sakazakii) contamination of powdered infant formula (PIF) and its processing environment was monitored between April 2005 and March 2006. The purpose of the monitoring programme was to locate points of contamination, investigate clonal persistence, and identify possible dissemination routes along the processing chain. A total of 80 E. sakazakii isolates were recovered from the manufacturing facility. The overall frequency of isolation of E. sakazakii in intermediate and final product was 2.5%, while specific locations in the processing environment were contaminated at frequencies up to 31%. All E. sakazakii isolates were characterised by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). XbaI macrorestriction digests yielded 19 unique pulse-types that could be grouped into 6 clusters of between 5 and 32 isolates. The formation of large clusters was consistent with the presence of a number of clones in the manufacturing environment. While the majority of isolates were of environmental origin (72.5%), no cluster was confined to one specific location and indistinguishable PFGE profiles were generated from isolates cultured from the manufacturing environment, sampling points along the processing chain and from intermediate and final product. These findings suggest that the manufacturing environment serves as a key route for sporadic contamination of PIF. These data will support the development of efficient intervention measures contributing to the reduction of E. sakazakii in the PIF processing chain.     

克罗诺杆菌环境耐受性的评价

婴儿配方奶粉(powdered infant formulas,PIF)是克罗诺杆菌(Cronobacter spp.)的主要污染来源,其原辅料的添加和加工环境是最为主要的传播途径。为彻底有效地对克罗诺杆菌进行预防和控制,保障乳制品的安全,本实验以8株分离自PIF及其加工环境中的克罗诺杆菌为研究对象,对其耐热性、耐酸碱性、耐干燥性及耐高渗性进行研究,分析不同菌株环境耐受性之间的差异。结果表明：8株克罗诺杆菌对热的耐受性存在差异性,其中分离自终产品的菌株耐热性相对较强;克罗诺杆菌普遍具有耐酸不耐碱的特性,在pH为1.5的酸性条件下,所有菌株在处理30 s后仍可存活;克罗诺杆菌具有较强的抗干燥能力,在室温条件下,空气相对湿度为20.7%的条件下,所有菌株在7个月的试验过程中菌数均从初始浓度10⁸ CFU/mL下降到10⁵ CFU/mL,这种缓慢的下降趋势说明克罗诺杆菌具有很强的抵抗干燥环境的能力;克罗诺杆菌具有较强的耐高渗性,当NaCl的浓度大于8%时,所有菌株生长缓慢,且在等渗条件下,克罗诺杆菌对山梨醇的耐受性强于NaCl。     

克罗诺杆菌在婴儿配方奶粉及其加工环境中耐受性和耐药性研究进展

克罗诺杆菌（Cronobacter）是一种食源性致病菌，容易感染新生儿和低体重早产儿并引起坏死性小肠结肠炎、脑膜炎和败血症等疾病，致死率高达40%~80%，治愈后可能存在严重精神系统后遗症。由流行病学可知，婴幼儿感染克罗诺杆菌与婴儿配方奶粉（Powdered Infant Formula，PIF）的关系十分密切。近年来，克罗诺杆菌污染PIF事件频发并且因其耐药性给临床治疗带来巨大挑战，造成严重后果。究其原因，是由于该菌对PIF及其加工环境的耐受能力强，不易被完全消杀从而造成持续污染。因此，为详细了解克罗诺杆菌在不利条件下的生长特性，该研究从克罗诺杆菌耐热性、耐干燥性、耐酸碱性、耐紫外性以及耐药性多个角度综述目前克罗诺杆菌耐受性相关研究进展，以期为我国克罗诺杆菌的防控消杀以及临床治疗提供参考。     

市售婴幼儿米粉中克罗诺杆菌的分子分型和耐药分析

为了解婴幼儿配方米粉中克罗诺杆菌的污染情况、分子分型特征及耐药性情况,采集广西区内市售6个厂家和品牌不同配方的婴幼儿米粉进行克罗诺杆菌分离及fusA基因的扩增、测序和MLST数据库比对分析。并应用脉冲场凝胶电泳（PFGE）对菌株进行分型鉴定及微量肉汤稀释法测定分离株对8种常见抗生素的最小抑菌浓度（Minimal Inhibitory Concentrations,MICs）。采集的268份婴幼儿米粉共分离到32株克罗诺杆菌,检出率为11.94%,菌株鉴定结果显示32株分离株包括22株C.sakazakii、6株C.malonaticus、3株C.dublinensis和1株C.muytjensii。不同添加成分的婴幼儿配方米粉污染情况差异明显,其中添加淮莲和果蔬的米粉污染率最高为17.78%和15.38%。PFGE分析显示32个菌株共分成32种不同的分子型,相似度为61.20%~92.30%,所有分离株对环丙沙星、庆大霉素和头孢噻肟都敏感,部分菌株（6.25%~43.75%）对氯霉素、四环素、甲氧苄啶/磺胺甲基异恶唑、头孢西丁和萘啶酸表现为中等敏感,有2个菌株对氯霉素表现为抗性。结果表明市售婴幼儿配方米粉中存在一定的克罗诺杆菌污染,尤其是添加营养成分的米粉。婴幼儿配方米粉中克罗诺杆菌污染来源广泛,部分菌株对一些抗菌药表现为中等敏感甚至是抗性,提示克罗诺杆菌对抗菌药的敏感性呈现减弱的趋势。     

Ecology of Listeria spp. in a fish farm and molecular typing of Listeria monocytogenes from fish farming and processing companies

This study focused on the ecology of Listeria monocytogenes in a fish farm by following the changes in its occurrence in different types of samples for a three year period. In addition, L. monocytogenes isolates from different seafood industry areas were compared with pulsed field gel electrophoresis (PFGE) typing to discover possible associations between primary production, further processing and final products. Weather conditions were found to have a strong influence on the probability of finding Listeria spp. in a fish farm environment. The number of samples contaminated with Listeria spp. was typically bigger after rainy periods. Brook and river waters as well as other runoff waters seemed to be the main contamination source at the farm studied. The farmed fish originally found to carry L. monocytogenes become gradually Listeria free. The time needed for the purification of the fish was several months. The sea bottom soil samples were the ones that preserved the L. monocytogenes contamination the longest time. It can be stated that the fish and fish farm equipment studied did not spread listeria contamination. On the contrary, they were found to suffer from listeria contamination coming from outside sources like the brook water. There was a wide range of different L. monocytogenes PFGE-pulsotypes (30) found at 15 Finnish fish farms and fish processing factories. L. monocytogenes isolates from the final products often belonged to the same pulsotypes as did the isolates from the processing environment as well as from the raw fish. This suggests that, in addition to the fish processing factory environment, the fish raw materials are important sources of L. monocytogenes contamination in final products.     

GB 4789.40-2016和ISO 22964:2017方法检测婴幼儿配方奶粉中克罗诺杆菌属的实验室适用性研究

克罗诺杆菌属（原阪崎肠杆菌）可在婴幼儿配方粉（Powdered Infant Formula,PIF）中长期存活。随着食品贸易的全球化，人们对婴幼儿配方粉（PIF）中克罗诺杆菌的污染尤为关注。本文参照ISO 16140-2 2016中方法比对的原则要求，对检测PIF中克罗诺杆菌的中国标准方法 GB 4789.40-2016（参考方法）和欧盟标准方法 EN ISO 22964:2017（替代方法）进行了方法比较研究。共有12个外部实验室参与检测3个不同污染水平（0 MPN/10 g,1.299 MPN/10 g和2.210 PMN/10 g）下添加了测试菌株的576份盲样的测试。结果表明，在低污染水平和高污染水平下，GB 4789.40-2016的灵敏度分别为80.00%和81.16%，而ISO 22964:2017对应的灵敏度分别为90.00%和97.10%。无论污染程度如何，相对检测水平（RLODs）都低于接受限（AL=2.5）。同时，采用AOAC指南中提出的检测概率（POD）模型对统计数据进行了分析，结果显示替代方法和参考方法之间没有统计学上的显著差异。据此得出用于检测PIF中阪崎...