植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因在大肠杆菌中表达

构建乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因的重组质粒并表达。以植物乳杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增亚硝酸盐还原酶基因,连接到表达载体pET-32a(+)上,构建的重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,菌体总蛋白经SDS-PAGE鉴定显示重组质粒诱导表达产物有特异性蛋白条带。该表达产物经细菌亚硝酸盐还原酶试剂盒测定显示有明显的酶活性。实验结果为深入研究植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶提供有益的参考。     

植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶相关基因的研究

植物乳杆菌具有降解亚硝酸盐的能力。根据已知四种类型亚硝酸盐还原酶蛋白序列的保守序列,利用互联网相关蛋白分析软件及生物信息学工具,查找到植物乳杆菌基因组上的亚硝酸盐还原酶疑似基因8个,克隆出全部基因序列,分别构建表达载体p ET-32a(+)-Ni Rs。将构建的质粒转入BL21(DE3)表达菌的感受态细胞中进行诱导表达,表达的目的蛋白,经亚硝酸盐还原酶总活性测定试剂盒检测,结果显示,其中HP蛋白具有显著还原亚硝酸盐的能力。     

植物乳杆菌DMDL 9010中亚硝酸盐还原酶的基因克隆、表达和纯化

研究了植物乳杆菌DMDL 9010亚硝酸盐还原酶基因克隆、表达及表达产物的纯化。首先以植物乳杆菌DMDL 9010的DNA为模板,利用PCR扩增亚硝酸盐还原酶基因,扩增后nir编码序列大小为1638 bp,再将其编码序列克隆到原核表达载体p ET-32a(+)上,转化到感受态细胞DH5α,成功构建重组质粒p ET-32a(+)-nir。将重组质粒转化到大肠杆菌表达菌株E.coli BL21中,在IPTG浓度为1 mmol/L和诱导温度为25℃的条件下诱导4 h后诱导表达NIR蛋白,经诱导后的工程菌能将50μg/m L的亚硝酸盐降解90%以上,利用亲和层析柱Ni sepharose 6 Fast flow进行纯化得到重组蛋白,该重组蛋白经SDS-PAGE电泳后的分子量约为60 KDa。总之,经由植物乳杆菌DMDL 9010克隆出亚硝酸还原酶基因,并成功构建了重组质粒p ET-32a(+)-nir,利用基因工程方法得到的工程菌能有效降解亚硝酸盐,并能利用亲和层析得到高纯度的NIR。     

植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因在大肠杆菌中重组表达、纯化及酶学性质分析

构建植物乳杆菌(Lactobacillus sp.LMY-20)中亚硝酸盐还原酶(nitrite reductase,NiR)的重组大肠杆菌、纯化重组蛋白并对其进行酶学性质分析。将人工合成的密码子优化的亚硝酸盐还原酶基因(nir)亚克隆至载体pET28a(+),构建重组表达载体p ET28a(+)-nir并转化到E.coli BL21(DE3)中实现表达。包涵体复性,利用镍柱亲和层析纯化重组亚硝酸盐还原酶。成功构建产亚硝酸盐还原酶的重组大肠杆菌并纯化了重组亚硝酸盐还原酶,纯化后经变性聚丙烯酰氨凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析在45 k Da附近出现明显条带。Na_2S_2O_4-MV法测得酶活为2 332.72 U/L,最适pH值为6.5,最适作用温度为37℃,在4～70℃下孵育40 min后可保持超过85%的活力。该研究实现植物乳杆菌来源的NiR在大肠杆菌中的重组表达、纯化及其酶学性质分析,重组NiR具有较好的温度适应性和稳定性,为其在农业、食品及医药等领域应用奠定基础。     

植物乳杆菌DMDL 9010降解亚硝酸盐特性及其相关基因挖掘

笔者前期对植物乳杆菌DMDL 9010（Lactiplantibacillus plantarum DMDL 9010,LP9010）已进行全基因组测序,其NCBI登录号为CP063986-CP063988。该文通过研究LP9010在不同培养条件和培养基成分下的理化指标变化,结合全基因组序列初步分析LP9010降解亚硝酸盐的特性。结果表明,LP9010具有高效降解亚硝酸盐的能力,其亚硝酸盐降解率随着pH的降低而升高;温度为37 ℃有利于LP9010降解亚硝酸盐;LP9010在营养充分的条件下降解亚硝酸盐的效果最佳,且氧环境和生长因子对其无显著影响（p>0.05）。相应地,在LP9010全基因组中发现了酸耐受（nhaC、gadA、argG和glnR）、冷热耐受（cfa、cspA、hrcA、htpX、cplC、clpE、clpP、clpX和clpL）、氧耐受（catB、trxB、trxA、gor、msrC、msrA和msrB）以及糖转运（pstI、Crr、NagE、ScrA、MtlA、ManX、ManY、ManZ、GatA、GatB、GatC、FruA和FruB）相关的基因,尤其是发现了亚硝酸盐还原酶基因（lmrB和pgl）。总之,LP9010具有高效降解亚硝酸盐的能力和降解亚硝酸盐相关的基因。此结果为植物乳杆菌降解亚硝酸盐的机理提供了新的思路。     

亚硝酸盐对植物乳杆菌FQR细胞表面性质及形态的影响

研究不同NaNO_2浓度对植物乳杆菌(Lp)FQR降解NaNO_2能力、亚硝酸盐还原酶(NiR)活性以及细胞表面特性的影响,并经电镜观察细胞形态。结果表明,在0~0.150%NaNO_2范围内,随着浓度的增大,FQR降解能力以及NiR活性均呈下降趋势,在0.045%NaNO_2条件下,FQR能够高效降解NaNO_2,16 h降解率达(94.85±2.96)%,NiR活力(174.60±13.67)U/104细胞,而高浓度NaNO_2会引起细胞表面疏水性和膜通透性发生显著升高。扫描电镜观察发现,0.045%NaNO_2条件下FQR表面形态与对照组相比未发现明显变化,但0.120%NaNO_2时菌体表面出现褶皱和凹陷。透射电镜观察发现,对照组中FQR存在大量储能颗粒,随着NaNO_2浓度增大,颗粒物数量明显下降;在0.120%NaNO_2时胞内储能物质几乎消失,并出现细胞质空化现象。高浓度NaNO_2会引起菌体表面形态和内部结构发生明显变化。     

从泡菜中分离的植物乳杆菌P51降解亚硝酸盐影响因素的动态研究

从泡菜中分离得到一株植物乳杆菌P51,研究了在不同温度、不同NaCl含量、不同亚硝酸盐浓度以及不同培养基起始pH下其降解亚硝酸盐的动态变化和培养液pH值的改变。结果表明:植物乳杆菌P51能够有效降解培养基中的亚硝酸盐,其最适降解温度为37℃,最适NaCl含量为4%,最适亚硝酸盐浓度为200μg/mL,最适起始pH为6,同时植物乳杆菌P51高效降解亚硝酸盐可能主要依靠酸降解。该菌株表现出良好的耐食盐和亚硝酸盐特性,可作为良好的乳酸菌发酵剂,对于应用到泡菜和腌制肉制品中具有很大的潜力。     

四川泡菜中植物乳杆菌的筛选与鉴定

该研究旨在从四川泡菜中筛选植物乳杆菌,为益生菌筛选提供来源。经MRS琼脂培养基筛选,采用革兰氏染色法,生化鉴定法,结合分子生物学方法,对筛选的菌株进行鉴定。VITEK 2棒状杆菌鉴定卡（CBC）共涉及到41个生化反应,能够鉴定到种属水平,该方法能够很好的筛选植物乳杆菌。经CBC卡鉴定,20个菌株中筛选到12个菌株,可鉴定为植物乳杆菌。这些菌株经16S rRNA PCR扩增测序后,在NCBI网站上进行同源性比对,确定为植物乳杆菌。由邻接法构建的系统进化树可知,该12个菌株与已知植物乳杆菌序列聚为一簇,6号菌株与Lactobacillus plantarum 3356聚为一支,亲缘关系更近;4号、5号、14号、15号、23号和38号菌株与Lactobacillus plantarum NCU116,Lactobacillus plantarum MBEL2169,Lactobacillus plantarum AN7等序列相似性极高,无遗传距离。综合所有的鉴定结果,这12个菌株都被鉴定为植物乳杆菌。CBC鉴定卡是初筛植物乳杆菌较好的方法。     

植物乳杆菌在自制培养基中降解亚硝酸盐的研究

观察植物乳杆菌LP-L134-1-P(简称LP)在自制培养基中生长及降解亚硝酸盐状况,结果发现:空白培养液中LP几乎不降解亚硝酸盐;在只添加3%碳源(葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉)的培养液中LP不能正常生长、产酸,72 h后对亚硝酸盐的降解率只有6.70%左右;在添加3%葡萄糖和2%氮源的培养液中:酵母抽提物培养液、酶解的大豆分离蛋白培养液、未酶解的大豆分离蛋白培养液在72 h后pH分别为3.84、3.89、4.64,对亚硝酸盐的降解率为96.44%、96.27%、36.44%。而硝酸铵培养液pH仅为5.27,亚硝酸盐降解率为8.34%。调节乳酸溶液pH为5或以上时亚硝酸盐降解效果不明显,pH为4和3时降解率分别达到31.33%、87.30%。总之,LP在培养液中产酸达到pH为4或以下时酸降解作用才比较强烈,此时酶降解效果也能显著增强。LP在碳源和有机氮源的培养液中生长产酸较好,营养条件已足够供给LP达到清除亚硝酸盐的目的。     

一株降解亚硝酸盐植物乳杆菌的生长特性及其在泡菜制作中的应用

通过盐酸萘乙二胺法、平板计数法等方法研究了具有降解亚硝酸盐作用植物乳杆菌36的生长特性及其在泡菜制作中的应用。结果表明：菌株36培养至12 h活菌数最大（9.49 lg CFU/mL）且具有较强的耐酸性和耐盐能力。用菌株36制作的泡菜pH值在自然发酵组第7天降至3.42,而试验组第3天就降至3.34;总酸含量在自然发酵组第7天达最高值（4.11 g/kg）并趋于平稳,而试验组到第5天达最高值（6.16 g/kg）并趋于平稳,这有利于缩短泡菜生产周期。亚硝酸盐含量在自然发酵组第9天达2.10 mg/kg,而试验组到第9天维持在1.13 mg/kg左右,显著低于自然发酵组（p<0.05）,表明菌株36具有良好降解泡菜中亚硝酸盐的能力。乳酸菌数在自然发酵组第3天达最高值（8.16 lg CFU/mL）,但试验组在第7天达最高值（9.95 lg CFU/mL）且比自然发酵组高一个数量级。而且,泡菜感官评定值在两组间无显著差异（p>0.05）。因此,植物乳杆菌36为降低泡菜中亚硝酸盐含量提供理论依据并在生产中具有实际意义。     

发酵辣椒中产亚硝酸盐还原酶短乳杆菌L5的选育及特性研究

以传统发酵辣椒为分离源,从中分离出10株可降解亚硝酸盐的乳酸菌,经过复筛得到一株产亚硝酸盐还原酶能力最强的短乳杆菌（Lactobacillusbrevis）L5,并通过单因素及正交试验对其降解特性进行了研究。结果表明：L5对亚硝酸盐有明显的降解作用,在正常培养条件下,发酵36 h,L5对亚硝酸盐的降解率为56.25%;在维持pH 6.0以上,消除酸对亚硝酸盐降解作用的条件下,发酵36 h, L5对亚硝酸盐的降解率为66.42%,主要为产酶降解。L5降解亚硝酸盐的最佳条件为温度34℃,时间30 h,底物质量浓度120 m g/L,食盐含量6%,此时,L5对亚硝酸盐的降解率可达82.84%。     

可降解亚硝酸盐植物乳杆菌在广式腊肠发酵中的应用

目的:以可降解亚硝酸盐的植物乳杆菌为发酵剂,分析探讨广式腊肠制作中使用该发酵剂的产品特征。方法:研究两株植物乳杆菌分别对2%氯化钠和300mg/kg亚硝酸钠的耐受性,以及在MRS培养基中降解亚硝酸盐的能力。并以其中一株植物乳杆菌为发酵剂加入广式腊肠中,测定不同发酵时间产品的pH值、水活度以及乳酸菌、霉菌和大肠菌的生长情况,与对照组进行比较,研究该发酵剂对发酵腊肠产品特征的影响。结论:将具有良好耐盐和耐亚硝酸盐能力,同时对亚硝酸盐具有较强降解能力的H1菌作为发酵剂加入腊肠后,降低了腊肠的pH值,同时对有害菌有明显的抑制效果,说明所选植物乳杆菌具有较好的环境适应性并显示出强大的酸化潜力,能通过抑制肠杆菌科的生长,提高微生物的安全性。因此,H1菌有望成为一种具有生物安全性的本土发酵剂。     

蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus LJ01中亚硝酸盐还原酶的基因克隆、表达和纯化

利用克隆表达技术,对一种蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus LJ01的亚硝酸盐还原酶（nitrite reductase,NiR）基因进行克隆、原核表达,利用Ni柱亲和层析和DEAE Sepharose Fast Flow交换层析对表达的重组NiR进行纯化,分析重组酶的性质。研究结果显示,该NiR含有一个1?623?bp的开放阅读框,编码540?个氨基酸序列,重组NiR的分子质量约为67?ku;该酶中同时存在铁离子和铜离子,且含量分别为51.0?mg/kg和184.5?mg/kg;圆二色谱结果显示α-螺旋结构在重组NiR中所占比例最大。     

泡菜中植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的克隆表达

目的:对植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因(nirS)进行克隆及表达,检测重组酶表达情况及其酶活力。方法:以分离自传统泡菜植物乳杆菌的基因组DNA为模版进行PCR扩增nirS;重组构建TA克隆质粒pMD 19-T-nirS,并转化到大肠杆菌DH5a中保存;通过双酶切消化将nirS基因连接到pET-32a(+)上,获得重组表达质粒pET-32a(+)-nirS,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达;重组酶经纯化后进行SDS-PAGE电泳检测其表达情况;重组酶经复性后检测其酶活力。结果:扩增得到nirS基因并成功在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,所得重组酶以包涵体形式存在,酶活力为2131.5U/mg。结论:采用基因工程技术获得亚硝酸盐还原酶具有一定的应用前景。     

植物乳杆菌对黄秋葵泡菜亚硝酸盐含量的影响及其发酵工艺研究

该研究以新鲜黄秋葵为主要原料,探讨植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）发酵对黄秋葵泡菜亚硝酸盐含量的影响,并以亚硝酸盐含量为考察指标,通过单因素试验及响应面试验对其发酵工艺参数进行优化。结果表明,与自然发酵相比,植物乳杆菌发酵制作的黄秋葵泡菜的亚硝酸盐含量（最高达9.78 mg/kg）更低,成熟期更短;植物乳杆菌发酵黄秋葵泡菜的最优发酵工艺为接种量3.5%,发酵温度30 ℃,发酵时间5.5 d,食盐水浓度4.0%,在此优化工艺条件下,黄秋葵泡菜中的亚硝酸盐含量最低,为（2.98±0.02） mg/kg,低于国家腌渍蔬菜亚硝酸盐的限量标准（≤20 mg/kg）,比优化前降低1.21 mg/kg。     

蜡样芽孢杆菌LJ01中亚硝酸盐还原酶的基因克隆和生物信息学分析

为研究蜡样芽孢杆菌LJ01(Bacillus cereus LJ01)中亚硝酸盐还原酶(NiR)的酶学性质,获得高表达量的基因工程菌,本文对B.cereus LJ01的NiR序列进行了生物信息学分析,并将NiR基因克隆到表达载体pET-28a(+)和pET-32a(+)中,构建了基因工程菌pET-28a(+)-nir-BL21和pET-32a(+)-nir-BL21,随后探究了不同诱导条件对重组NiR表达量的影响。结果表明NiR编码蛋白的理论分子量约为60 kDa,理论pI为5.47,二级结构主要为α-螺旋和无规则卷曲,是不具有跨膜结构的亲水性蛋白。随着诱导温度的升高,重组NiR的表达量逐渐减少,诱导温度为16℃时重组NiR表达量最高。在同一诱导温度下,NiR在pET-28a(+)-nir-BL21中的表达量明显高于pET-32a(+)-nir-BL21,因此选用pET-28a(+)-nir-BL21作为基因工程菌。从B.cereus LJ01中克隆了NiR基因,构建了基因工程菌pET-28a(+)-nir-BL21,为该重组NiR的理化性质研究和食源芽孢杆菌中NiR的异源表达奠定了基础。     

茶多酚辅助植物乳杆菌FQR降解亚硝酸盐效应的研究

该研究在含有NaNO2的植物乳杆菌FQR培养液中加入茶多酚（TPs）,考察培养12 h后体系中亚硝酸盐降解率,以评价茶多酚辅助植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）降解亚硝酸盐的效果。结果表明,茶多酚对植物乳杆菌FQR的生长状况有一定的促进作用,添加量为0.2%时生长状况最佳,12 h时菌落数达到3.3×108 CFU/mL。进一步研究了不同培养条件对茶多酚辅助植物乳杆菌降解亚硝酸盐效应的影响,得出茶多酚添加量为0.3%时亚硝酸盐降解效果最好,为（83.05±1.48）%;接种量为3%时,亚硝酸盐降解率最高,为（89.09±0.63）%;培养温度为37 ℃时,亚硝酸盐降解率最高,为（88.23±0.59）%;起始pH值为6.0时,亚硝酸盐降解率最高,为（89.79±0.57）%。     

植物乳杆菌X7021吸附重金属和降解亚硝酸盐能力的研究

目的 为了发掘植物乳杆菌X7021在食品发酵剂和益生菌方面的应用潜力, 本文研究了该菌株吸附重金属与降解亚硝酸盐的能力 。方法 采用分光光度法检测Cu2+和亚硝酸盐含量, 采用石墨炉原子吸收分光光度法检测Cd2+和Pb2+含量。探讨pH、温度、吸附时间和离子浓度等因素对植物乳杆菌X7021吸附重金属能力的影响, 以及亚硝酸盐浓度对其生长和降解能力的影响。结果 植物乳杆菌X7021对重金属的吸附率和吸附量均受到吸附条件的影响。首先,吸附量随着金属离子浓度的增加而增加, 而吸附率呈现出先快速下降后趋于平缓的趋势。其次, 吸附率和吸附量均随吸附时间增加而增加, 且植物乳杆菌X7021对Pb2+的吸附量明显优于Cu2+、和Cd2+。第三, Cu2+、Cd2+和Pb2+的最大吸附率分别在pH=7、7和6;且温度为37 °C时, 三种重金属离子的吸附率和吸附量均达到最大。除此之外, 植物乳杆菌X7021在24 h内几乎完全降解100 mg/L NaNO2, 且可耐受浓度高达700 mg/L的亚硝酸盐。结论 植物乳杆菌X7021能够有效吸附Cu2+、Cd2+、Pd2+等重金属离子, 且对亚硝酸盐有较强的降解和耐受能力, 在发酵食品及益生菌领域具有潜在的应用前景。     

植物乳杆菌的筛选及其在泡菜中的应用

实验筛选了1株产酸较好的菌株,鉴定为植物乳杆菌(Laobacillusplantarum),将其应用在制作泡菜中,进行小批量自然发酵和人工发酵。结果表明,自然发酵的最佳周期为48h,人工接种发酵的最佳周期为36h。人工接种发酵从发酵周期、乳酸产量、感官评定等各方面都明显优于自然发酵,既适合家庭制作,又适于工业化大批量生产。     

植物乳杆菌L5降解亚硝酸盐机理的初步研究

为了研究植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L5降解亚硝酸盐的机理,采用盐酸萘乙二胺法、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和扫描电镜分别对亚硝酸盐存在条件下L5的降解亚硝酸盐能力、蛋白的表达和菌体形态等进行了初步研究。结果表明,在正常培养条件下,发酵36 h,L5对亚硝酸盐的降解率为56.25%;在控制p H 6.8,消除酸对亚硝酸盐降解作用的条件下,发酵36 h,L5对亚硝酸盐的降解率为70.59%;在有亚硝酸盐存在的条件下,L5能分泌一种分子质量约为200 k Da的a蛋白,且分子质量为50 k Da左右的b蛋白、分子质量为40 k Da左右的c蛋白、分子质量为34 k Da左右的d蛋白的表达均上调;L5在以亚硝酸盐为唯一氮源的培养基中仍然能生长,但亚硝酸盐的存在使L5的菌体形态发生了改变。