麦芽三糖酶酶解大米淀粉产物的回生性质研究

摘 要: 目的 研究麦芽三糖酶对大米淀粉回生性质的影响。方法 以不同麦芽三糖酶添加量(0、200、300、400、500、600 U)水解大米淀粉, 利用差示扫描量热仪、X射线衍射仪测定酶解产物的回生性质和重结晶性质, 并利用凝胶色谱分析系统分析酶对淀粉分子结构的影响。结果 麦芽三糖酶酶解大米淀粉, 随着水解程度增加可显著降低其4℃储藏14 d后的回生焓、相对结晶度以及分子尺寸, 显著提高脱支大米淀粉酶解产物中聚合度(degree of polymerization, DP)<9的极短链所占比例; 淀粉水解率≥25.96%后, 实验条件下未能检测到回生焓和重结晶峰。结论 麦芽三糖酶酶解大米淀粉后可有效抑制酶解产物的回生, 当淀粉水解率≥25.96%, 大米淀粉酶解产物的回生被完全抑制, 这主要是因为支链淀粉的外链被水解生成具有大量DP<9的极短链的分支糊精,。本研究可为麦芽三糖酶应用大米淀粉制品的酶法回生控制提供理论参考和技术依据。     

黑曲霉-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质

"绿色资源"纤维素广泛应用于能源、医药、食品等领域,β-葡萄糖苷酶(BGL)作为纤维素降解酶系的限速酶是当前研究热点之一。作者对黑曲霉利用豆渣发酵所产的胞外β-葡萄糖苷酶进行分离纯化,并对该酶进行了酶学性质表征。实验结果表明,BGL最适反应温度为55℃,最适反应p H为2.0~2.5,p H稳定范围为2.0~7.5。在最适反应条件下,K_m值为8.4×10~(-4)mol/L,kcat为16 s~(-1),催化效率k_(cat)/K_m为1.92×10~4L/(mmol·s)。相比较其他报道的BGL酶,该酶具有更好的耐酸性能,可为BGL的理论研究与酶制剂的生产应用提供一定基础。     

海洋细菌JMUAZ5琼胶酶的酶学性质及酶解产物的抗氧化活性

【目的】分离海洋来源的琼胶酶产生菌,确定其分类地位,研究其所产琼胶酶粗酶的酶学性质及酶解产物的抗氧化活性,为琼胶酶的进一步开发应用提供理论依据。【方法】利用以琼胶为唯一碳源的筛选培养基筛选分离产琼胶酶的菌株;采用16S r RNA基因序列分析确定菌株的分类地位;研究菌株所产琼胶酶粗酶的酶学性质;通过测定酶解产物的还原能力和清除自由基ABTS·+的能力,分析酶解产物的抗氧化活性。【结果】分离到一株产胞外琼胶酶的菌株JMUAZ5,根据16S r RNA基因序列分析,该菌株归属于弧菌属(Vibrio sp.);菌株JMUAZ5琼胶酶粗酶具有良好的底物专一性;最适反应温度为40°C,在20°C和25°C条件下稳定;最适反应p H值为8.0,在p H 6.0~10.0范围内稳定;Ca~(2+)和Al~(3+)对酶活性具有强烈促进作用,而Zn~(2+)和Fe~(3+)对酶具有强烈抑制作用;琼胶酶粗酶对测试的抑制剂、去垢剂和变性剂均具有好的抗性;酶解产物琼胶低聚糖具有还原能力和清除ABTS·+的能力。【结论】海洋细菌弧菌属JMUAZ5可产胞外琼胶酶,酶解产物有一定的抗氧化活性,具有潜在应用价值。     

鸡肉和猪肉蛋白质酶解动力学及产物性质分析

采用体外模拟方法,对两种蛋白的消化动力学及其产物抗氧化活性进行了分析。结果显示,鸡肉蛋白更容易被蛋白酶所水解,生成更多的游离氨基酸和非蛋白氮(NPN),具有较低的K_m值和较高的V_(max)。体外抗氧化活性结果显示,经胃液、肠液消化后,两种蛋白消化产物的抗氧化活性显著增强(p≤0.01),且差异显著(p≤0.01),除脂质过氧化抑制活性外,鸡肉蛋白消化产物显示出更强的体外抗氧化活性。研究表明,不同膳食蛋白具有不同的消化动力学性质,其产物具有不同抗氧化活性。     

海枣曲霉产内切菊糖酶的发酵条件及菊糖酶解条件的研究

利用海枣曲霉发酵获得菊糖酶粗酶液,对粗酶液的发酵条件和酶解条件进行了研究.结果表明,菊糖酶的最适发酵条件为:菊糖2%,磷酸二氢铵0.5%,磷酸二氢钾0.25%,MgSO4·7H2O 0.05%,pH 6.0～7.0,接种量8%,温度28℃,时间60h,按最优条件得到的菊糖酶粗酶液,酶活为18.39 U/mL,I/S值为...     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究

利用硫酸铵盐析、季氨乙基-琼脂糖凝胶FF（Q-Sepharose FF）离子交换层析、苯基-琼脂糖凝胶6 FF（Phenyl-Sepharose 6 FF）疏水层析和丁基-琼脂糖凝胶HP（Butyl-Sepharose HP）疏水层析对黑曲霉来源β-葡萄糖苷酶进行分离纯化,采用十二烷基硫酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定其分子质量,并对其酶学性质进行研究。结果表明,经分离纯化后得到分子质量约为116 kDa的β-葡萄糖苷酶,纯化倍数达到50.39倍,回收率为4.65%,比酶活为103.80 U/mg,该β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为60 ℃,最适反应pH值为5.0,在温度30～50 ℃,pH 2.0～8.0之间具有较好的稳定性。     

微泡菌昆布多糖酶Lam128A的酶学性质及酶解产物抗氧化活性

该研究探讨微泡菌ALW1来源的昆布多糖酶Lam128A的酶学性质及其酶解产物的抗氧化活性。利用毕赤酵母异源表达重组蛋白rLam128A,该昆布多糖酶的分子量为70 ku,最适反应温度和最适反应pH值分别为45 ℃和pH值5.5;温度低于45 ℃时稳定,分别在pH值3.0、5.0和11.0条件下处理96 h后,残余酶活力不低于60%。还原试剂二硫苏糖醇（DTT）对昆布多糖酶活力有促进作用,rLam128A对螯合剂乙二胺四乙酸（EDTA）表现出良好的稳定性,对去垢剂Tween 20和Tween 80、变性剂尿素表现出一定的稳定性。昆布多糖经rLam128A水解后,酶解产物对DPPH、ABTS和OH·自由基的半数抑制剂量IC50分别为7.12、1.01和 2.40 mg/mL,相比未经酶解处理的昆布多糖表现出更显著的抗氧化活性。微泡菌昆布多糖酶Lam128A的酶学性质为该酶开发利用昆布多糖生物资源提供了理论基础。     

黑曲霉β-D甘露聚糖酶酶学性质及化学组成

在纯化研究的基础上对土壤中筛选诱变得到的黑曲霉菌株所产的β－Ｄ甘露聚糖酶进行了部分酶学性质的研究。该酶的最适温度为５５℃，最适ｐＨ为５．５，酸碱稳定区域为４．５～８．０，以魔芋精粉和瓜儿豆胶为底物分别测得该酶米氏常数为１４．２ｇ／Ｌ，１０．２ｇ／Ｌ，发现Ａｇ＋、Ｐｂ２＋离子对该酶有较强的抑制作用，Ｃａ２＋离子有一定的激活作用。纯化酶的氨基酸组成分析表明，天门冬氨酸和谷氨酸（包括酰胺）含量为２６．９％．利用纸层析初步了解了不同条件下粗酶对魔芋精粉底物的水解产物情况。     

黑曲霉5143脂肪酶离子注入诱变及酶学性质的研究

以产脂肪酶菌株黑曲霉Aspergillus niger51-43为出发菌株,经氮离子注入技术对其进行诱变,筛选获得酶活力有较大提高且传代稳定的正突变菌株L7,其脂肪酶活力达29.17U/mL,较原初酶活力19.28U/mL提高了151.3%。在此基础上,对该酶的酶学性质进行了研究。结果表明,高产突变株L7所产脂肪酶的最适作用温度为30℃,最适作用pH8.0,在50℃和pH6.0～9.0之间有很好的稳定性。Ca2+、Na+、Mg2+对该酶有一定的激活作用,而Cu2+、Mn2+、Fe2+、Co2+、Zn2+则抑制该酶的活性。      

内切菊糖酶的分离纯化及性质研究

采用DEAE-Sepharose CL-6B离子交换层析从Fructozyme (Aspergillus niger) 中分离得到三个菊糖酶组份EⅠ、EⅡ和EⅢ,其中EⅠ主要表现为内切菊糖酶,其分子量为65,000,以菊糖为底物其最适pH为4.6,最适温度为60℃,Km值为16mmol/L,对pH及温度有较高的稳定性,并利用液相色谱对菊糖酶EI催化水解菊糖的产物进行分析研究。     

黑曲霉N5-5单宁酶的纯化及酶学性质测定

采用中空纤维膜超滤和葡聚糖凝胶层析相结合的方法对黑曲霉N5-5单宁酶进行纯化,然后对纯酶性质进行测定。结果显示,黑曲霉N5-5单宁酶用该方法纯化后,可纯化近20倍,酶活力可回收23.30%。对纯酶作十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,可知黑曲霉N5-5单宁酶为分子质量64.2 k D的单肽链蛋白。纯酶的酶促反应最适温度为45℃,且在25~45℃范围内热稳定性良好;酶促反应最适p H值为5.0,且在p H 5.0~5.5范围内酸碱稳定性良好。另外,反应动力学测定结果表明,该酶对底物没食子酸丙酯的米氏常数K_m为0.916 mmol/L,最大反应速率vmax为0.877 mmol/(L·min)。     

丁香假单孢菌重组褐藻胶裂解酶的酶学性质及酶解产物的抗氧化活性

目的：将丁香假单孢菌的褐藻胶裂解酶进行克隆表达和纯化,研究重组酶的酶学性质及酶解产物的抗氧化活性,为进一步研究该酶的结构与功能奠定良好的基础。方法：利用PCR扩增褐藻胶裂解酶基因,将它克隆至表达载体pET-28a;表达产物用亲和层析纯化,研究重组酶的酶学性质;通过测定酶解产物的还原能力和清除ABTS·+和·OH自由基的能力,分析酶解产物的抗氧化活性。结果：来自丁香假单孢菌的重组褐藻胶裂解酶的分子质量为40.8 ku。该重组酶专一性降解聚甘露糖醛酸,酶的最适反应温度和pH分别为30 ℃和7.5,温度低于50 ℃时稳定。除了SDS和DTT,重组酶对其它抑制剂和去垢剂具有较好的抗性。酶解产物对ABTS·+和·OH自由基的半数抑制剂量IC50分别为1.56 mg/mL和0.56 mg/mL,还原能力较强。结论：该重组褐藻胶裂解酶的酶解产物有一定的抗氧化活性,具有应用潜力。     

黑曲霉木聚糖酶（xynZF-2）基因克隆、表达及酶学性质分析

利用RT-PCR技术从黑曲霉（Aspergillusniger）XZ-3S中成功克隆出木聚糖酶基因（xynZF-2）的cDNA序列（Genbank登录号为：JQ700382）。该基因核苷酸序列阅读框全长678bp,编码225个氨基酸,其中成熟肽为107个氨基酸。以重组质粒pUCm-T—xynZF-2为模板,扩增得到编码xynZF－2成熟肽的cDNA片段（624bp）。将其与表达载体pET－28a连接,构建重组表达载体pET－28a—xynZF－2,并转化大肠杆菌（Escherichiacoh）BL21（DE3）,获得重组工程菌BL21／xynZF-2。经IPTG诱导表达,木聚糖酶的的比酶活最高可达42．33U／mg。重组表达的木聚糖酶最适反应温度为40℃,最适反应pH为5．0,在碱性条件下具有良好的稳定性。Fe^3＋对酶的激活作用最为明显。     

葡萄糖氧化酶在无孢黑曲霉中的重组表达及酶学性质

针对目前食品级葡萄糖氧化酶的工业生产产量不高,选择黑曲霉CBS513.88的葡萄糖氧化酶基因goxC,通过密码子优化、信号肽替换对其编码区进行改造,并利用强启动子PglaA、杂合启动子Pna2/tpi及营养缺陷标记pyrG构建表达载体,旨在构建高活力的葡萄糖氧化酶表达工业菌株。goxC表达载体转化低蛋白背景的黑曲霉SH2原生质体后,经营养缺陷标记pyrG筛选获得重组菌株,邻联茴香胺显色和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳结果显示,在SH2宿主中成功表达葡萄糖氧化酶,蛋白质大小约为80 kDa。500 mL摇瓶发酵在第7天时酶活力可达563.8 U/mL;50 L发酵罐发酵在179 h时酶活力最高,达到1 128 U/mL,相比摇瓶发酵提高了1倍多,在目前曲霉表达系统的相关表达研究中,本研究葡萄糖氧化酶表达量已达到较高的水平。酶学性质研究发现,重组葡萄糖氧化酶最适pH值为5.5,最适温度为45℃。综上所述,本研究成功实现了葡萄糖氧化酶在黑曲霉中的高效重组表达。     

γ-CGTase酶学性质及产物特异性影响因素

将γ-环糊精葡萄糖基转移酶(γ-CGTase)的特有区域作为判断依据,在美国国家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库中,通过序列比对及生物信息学分析,筛选出一种新型基因,并将其克隆表达得到一种酶。利用高效液相色谱-质谱联用进行产物鉴定,表明该酶为γ-CGTase;酶分子质量大约为80 kDa,最适温度50℃,最适pH 10.0;无α-环糊精生成;甲醇、乙醇、环己烷、十二醇激活γ-CGTase活力,异丙醇和正丁醇抑制γ-CGTase活力;反应时间、淀粉质量浓度及乙醇体积分数均会影响γ-CGTase的产物特异性。HPLC结果显示,在10%的乙醇最终体积分数条件下,γ-CGTase催化产物中γ-环糊精的比例由40.11%增加至78.20%,专一性提高了94.96%。该研究提供了一种新型的γ-CGTase,为提高γ-CGTase产物特异性提供研究基础。     

黑曲霉产菊粉酶的条件及其酶学性质的研究

对黑曲霉SL-09在摇瓶条件下产菊粉酶的奈件及其酶学性质进行了研究。结果发现,接种量和装瓶量对产酶影响不大,而pH值影响较为显著,最佳产酶pH值为6．0;在对催化条件的研究中发现最佳反应温度、底物浓度和pH值分别为60℃、60g/L和6．0;锰离子对酶活有较强的激活作用,最适浓度为1．5&#215;10mol／L;同时发现该酶存在着严重的产物抑制现象,当果糖浓度大于1％时,菊粉酶活力将大幅度下降。     

黑曲霉脂肪酶Lip A的异源表达与酶学性质分析

脂肪酶在油脂分解和脂质合成方面具有广泛应用,是一种很有前途的生物催化剂。该研究对来源于黑曲霉的脂肪酶Lip A进行了异源表达及催化特性研究。结果表明,该重组脂肪酶的最适温度为50℃,最适pH为8.0,并且在40～60℃和pH 5.0～8.0有较好的稳定性。该酶对有机试剂有较好的耐受性,金属离子Ca²⁺和Mg²⁺对脂肪酶水解活性有促进作用,Fe³⁺、Zn²⁺和Cu²⁺严重抑制该酶活性。反应动力学参数表明,对硝基苯酚乙酸酯是脂肪酶Lip A的最适底物,其反应K_m为(0.228±0.05) mmol/L,催化常数K_cat为(0.023±0.001) s^-1。生物信息学分析表明,脂肪酶Lip A是abH23同源家族Rhizomucor mihei脂肪酶中的一员。黑曲霉脂肪酶Lip A具有催化乳酸和乙醇生成乳酸乙酯特性,为其在酿造领域的应用奠定了基础。     

溶菌酶LyAa在黑曲霉中的高效表达与酶学性质分析

该研究探讨了将嗜碱顶孢霉中的GH25溶菌酶基因进行密码子优化后,构建包含糖化酶信号肽的溶菌酶单拷贝和双拷贝表达载体并均由启动子PnaⅡ控制表达,利用双拷贝表达载体和CRISPR/Cas9基因编辑工具,使用PEG介导法转化无孢黑曲霉宿主HL-1,获得高酶活力的溶菌酶表达菌株。重组菌株LyAa-C的溶菌酶活力达到2 291.37 U/mL,是仅使用双拷贝表达载体的LyAa-F菌株酶活力（869.74 U/mL）的2.63倍,是仅使用传统单拷贝表达载体的LyAa-T菌株酶活力（358.41 U/mL）的6.39倍。通过6×His标签使用镍柱亲和层析成功纯化了重组溶菌酶LyAa,并对其酶学性质进行了分析。溶菌酶LyAa蛋白大小约为25.0 ku,最适pH值为4.0,最适温度为30 ℃,并显示出良好的胃蛋白酶稳定性。综上,该研究基于双拷贝载体和CRISPR技术成功优化和提高了溶菌酶在黑曲霉中的表达。     

黑曲霉果胶酯酶固定化前后酶学性质比较研究

采用明胶加戊二醛包埋法和蛋壳微粒吸附法分别对黑曲霉果胶酯酶进行了固定化,并研究了两种固定化方法制备得到的固定化黑曲霉果胶酯酶的酶学性质.结果表明,通过固定化,黑曲霉果胶酯酶的各项酶学性质指标都得到了改善,明胶固定化果胶酯酶和蛋壳固定化果胶酯酶的酶活回收率分别为46.3%和42.2%,而且与游离果胶酯酶相比,两种固定化酶的最适温度都由40℃上升到45℃,最适pH由4.4下降到4.0和4.2,Km值0.0113%由下降到0.0033%和0.0027%.