三种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立

目的:建立同时快速检测沙门氏菌、志贺氏菌和肠出血性大肠杆菌O157∶H7的多重PCR方法。方法:根据沙门氏菌的invA基因、志贺氏菌的ipaH基因及肠出血性大肠杆菌O157∶H7的uidA基因设计3对引物,通过单因素实验、L9(34)正交实验优化反应体系,并对多重PCR扩增的敏感性进行分析。结果:3对引物能特异性扩增出495、620、252bp的目的片段;在最优多重PCR反应体系下,多重PCR检测3种致病菌的灵敏度达104CFU/mL;将该法应用于人工污染实验,可在5h内得到准确、稳定的检测结果。结论:该方法操作简单、检测特异性和灵敏度较高,能够实现对沙门氏菌、志贺氏菌和肠出血性大肠杆菌O157∶H7 3种食源性致病菌的快速监控和诊断。     

多重PCR检测食源性致病菌的研究

建立多重PCR方法来同时检测和鉴定食品中单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌和肠出血性大肠杆菌三种致病菌。试验以单增李斯特菌蛋白转录调控基因(hlyA)、金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因(nuc)和肠出血性大肠杆菌O157︰H7的O157抗原特异基因(rfbE)为靶基因设计引物,并对其反应体系进行优化,确定其灵敏度及检出限。多重PCR反应的灵敏度为102cfu/mL,检出限为103cfu/mL。该研究建立的多重PCR检测方法简单、快速、灵敏度高具有很好的应用前景。     

IMSA技术快速检测肠出血大肠杆菌O157:H7方法的建立及应用

为了建立和评价一种适合食药监及基层检验部门使用的肠出血性大肠杆菌O157:H7快速检测方法,针对肠出血性大肠杆菌O157:H7特异性rfbE 基因,应用等温多自配引发扩增技术（Isothermal Multiple Self-matching-initiated Amplification,IMSA）,设计引物进行检测。对建立的方法进行特异性试验和灵敏度试验,与荧光定量PCR法进行比对;利用建立的IMSA法确定人工污染样本被检出的最短增菌时间和最低检测灵敏度;使用IMSA法和国标法对24份不同肉制品进行检验,评估两者的一致性。结果表明:该方法仅对肠出血性大肠杆菌O157:H7特异性扩增;IMSA法的灵敏度比qPCR法高,达8.9×102 CFU/mL;人工污染菌种样本最短增菌10 h可以被建立的IMSA法检出,检出限为9.1 CFU/25 g;24份肉制品样本的IMSA法与常规培养法结果一致性为100%。结论: IMSA技术检测肠出血性大肠杆菌O157:H7具有特异性强、灵敏度高、结果快速准确的特点,可在11 h内完成食品中O157:H7的检出,适用于食药监及基层检验部门进行肠出血性大肠杆菌O157:H7的快速检测。     

莴苣中两种致泻性大肠杆菌的富集及DNA提取方法的优化

本研究对人工接种肠出血性大肠杆菌O157∶H7和肠侵袭性大肠杆菌的莴苣样品中菌体的富集和DNA提取方法进行了优化。研究中比较了不同过滤膜组合对菌体的富集效果,筛选了莴苣样品中细菌DNA提取的最适方法,建立了多重PCR方法检测人工污染莴苣样品。结果表明,采用尼龙膜15μm+混合膜0.22μm的组合富集细菌、试剂盒法提取样品中细菌DNA,多重PCR检测的检出限降低10倍,检测时间节省1.5 h。本研究可快速、简便、灵敏的应用于莴苣检测中,具有很高的实际应用价值。     

食品中5种致病菌多重PCR快速检测技术的建立与应用

目的建立一种能同时检测食品中沙门氏菌、大肠杆菌O157∶H7、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌和蜡样芽胞杆菌的多重PCR快速检测方法。方法分别针对沙门氏菌侵袭基因invA、大肠杆菌O157∶H7肠溶血素A基因HlyA、金黄色葡萄球菌耐热性核酸酶基因nuc、单核细胞增生李斯特菌李氏溶血素O基因hlyA和蜡样芽孢杆菌肠毒素FM基因entFM序列设计引物,进行PCR扩增及电泳检测。同时优化反应体系,测定特异性和灵敏性。结果初步建立的多重PCR方法可简便、快速、灵敏地实现对5种致病菌的同时检测,整个检测过程少于30h,且检测灵敏度均可达102CFU/ml。结论这种方法是对传统检测方法的有效改进,为食源性致病菌的快速高通量检测提供了理想手段,有良好的应用前景。     

致泻性大肠杆菌基因芯片检测方法的建立

建立一种多重PCR技术结合基因芯片检测方法,实现多种致泻性大肠杆菌(EPEC、ETEC、EIEC、EHEC、EAEC和大肠杆菌O157)的快速、准确检测。筛选肠致病性大肠杆菌、产肠毒素大肠杆菌、侵袭性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠聚集性大肠杆菌及大肠杆菌O157的特异基因作为目的基因。设计9对引物和23条探针,进行多重PCR扩增,制备寡核苷酸芯片。将多重PCR扩增产物与带有特异探针的芯片杂交。用扫描仪扫描,判定细菌种类及型别。该基因芯片可特异性的检测EPEC、ETEC、EIEC、EHEC、EAEC和大肠杆菌O157,具有良好的特异性,致病菌检测灵敏度可达104cfu/mL。所建立的多种致泻性大肠杆菌基因芯片方法检测方法特异性好,灵敏度高,具有较好的实用性。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7的分子生物学检测及PCR检测

大肠杆菌一些特殊的血清型具有致病性,肠出血性大肠杆菌是大肠杆菌的一个亚型,主要致病菌株为O157:H7,可引起感染性腹泻,因能引起人类的出血性肠炎而得名。本文综述了分子生物学检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的研究进展。分子生物学检测是利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质的分析方法,主要包括酶联免疫吸附法(ELISA)、胶体免疫金层析法以及免疫磁珠分离法(IMS)。PCR技术检测肠出血性大肠杆菌O157:H7,主要包括常规PCR检测、多重PCR检测以及实时荧光定量PCR检测。这两种方法灵敏度高、特异性强、操作简便、结果准确等优点,是检测肠出血性大肠杆菌O157:H7的常用方法。     

三重PCR（聚合酶链式反应）检测鸡肉中常见病原菌的研究

建立鸡肉中常见3种致病菌即小肠耶尔森氏菌、大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌的多重PCR(聚合酶链式反应)检测方法。方法:分别选择小肠耶尔森氏菌、沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7基因组中高特异性的ail基因、inv A基因和ECs3032,设计并筛选具有高特异性的引物用于PCR(聚合酶链式反应)扩增。建立一种此3种致病菌的三重PCR检测方法,并通过人工污染实验对该法进行验证。结果:3对引物能特异地扩增出251、347、469 bp的目的条带;灵敏度:对这3种致病菌的单菌培养物检测灵敏度均为101CFU/m L。同时检测3种菌的灵敏度为103 CFU/m L。结论:该检测方法高效、精确、特异性强、灵敏度高,6 h~8 h内可同时快速检测多种致病菌,节省了大量时间。在实际检测中具有很好的实用价值和开发前景,可在食品检测和临床检验等领域大力推广。     

多重荧光定量聚合酶链反应法检测肉制品中的3种食源性致病菌

摘要：目的 建立多重荧光定量聚合酶链反应法（quantitative polymerase chain reaction,qPCR）快速检测肉制品中沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7 3种食源性致病菌的方法。方法 根据沙门氏菌的invA基因、单增李斯特菌的hemolysin基因、大肠杆菌O157:H7的rfbE基因序列分别设计特异性引物及探针,通过优化反应体系,测定其灵敏度、特异性和重复性,建立了可同时检测上述3种食源性致病菌多重qPCR方法。结果 该方法只扩增3种靶细菌,对其他供试菌不扩增;沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157:H7的检出限分别为101、102、102拷贝数/μL,并且拥有良好的重复性和特异性。人工污染的猪肉样品经SLE（Salmonella、Listeria monocytogenes and Escherichia coli 3种菌株的共增菌培养基）培养基富集8 h后,分别可以检测到初始菌液浓度为1.56×102 CFU/25 g的沙门氏菌,2.13×102 CFU/25 g的单增李斯特菌,2.32×102 CFU/25 g的大肠杆菌O157:H7。结论 所建立的多重qPCR灵敏度高、特异性强、重复性好,可同时检测肉制品中沙门氏菌、单增李斯特菌和大肠杆菌O157:H7 3种食源性致病菌,在提高食品安全和保护人类健康方面有重要意义。     

应用DPO-PCR技术检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7

利用双启动寡核苷酸引物（dual-priming oligonucleotide,DPO）聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7。根据DPO引物设计原则,以肠出血性大肠杆菌O157∶H7 rfbE 基因为靶基因设计一对DPO引物,经过反应体系的优化,建立了肠出血性大肠杆菌O157∶H7 DPO-PCR检测方法, 其检测灵敏度约为94 CFU/mL。与常规PCR方法相比,所建立的DPO-PCR方法对退火温度不敏感,在引物设计和实 验过程中不需要对引物及其退火温度反复优化,同时基于DPO引物的特殊结构又增强了其特异性。DPO-PCR方法 设计简易、特异性强,为致病性微生物的快速准确检测提供了新途径。     

使用环介导等温扩增技术快速检测食品中肠出血性大肠杆菌O157:H7的初步研究

目的探索建立一种快速、简单的食品中肠出血性大肠杆菌O157∶H7的检测方法。方法针对编码O157∶H7脂多糖的rfbE基因(GenBank S83460)和编码H7鞭毛抗原的fliC基因(GenBank L07388)特征性保守序列,利用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)核酸扩增基因技术,对21株O157∶H7和非O157∶H7菌株进行特异性检测,并与聚合酶链式反应方法进行比较。同时使用部分食品样品对LAMP法检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7的实际运用价值进行评估。结果LAMP法可以在1h内完成检测工作。LAMP法检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7的灵敏度为96.72%,特异度为85.71%,准确性为93.26%。结论LAMP检测技术的灵敏度较聚合酶链式反应技术高。LAMP是一种简单、快速的检测技术,适用于筛选可疑大肠杆菌O157∶H7样本。     

PCR-免疫胶体金试纸条方法检测食品中 肠出血性大肠杆菌O157:H7

目的建立PCR-免疫胶体金试纸条法快速检测食品中肠出血性大肠杆菌O157:H7的分析方法。方法通过设计特异性引物建立肠出血性大肠杆菌O157:H7 PCR检测方法并使用免疫胶体金技术以及双抗体夹心法建立PCR产物快速检测试纸条并设计核酸检测展开液;将1株大肠杆菌O157:H7标准菌株和7株其他常见食源性致病菌作为试验菌株,用试验菌株检测PCR-免疫胶体金试纸条方法的检测特异度,并比较PCR-免疫胶体金试纸条法和PCR-琼脂糖凝胶电泳法的检测敏感度。结果 PCR-免疫胶体金法具有良好的特异度,灵敏度比标准琼脂糖凝胶电泳法高100倍。结论本文建立的肠出血性大肠杆菌O157:H7检测PCR-免疫胶体金试纸条法特异度好,灵敏度高,价格低廉,适用于食品中肠出血性大肠杆菌O157:H7的检测。     

鲜切果蔬中4 种病原微生物多重PCR检测技术

研发可同时检测鲜切果蔬中的单核细胞性李斯特菌、鼠伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157:H7的多重聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测方法。根据单核细胞性李斯特菌inlA基因、鼠伤寒沙门菌invA基因、大肠杆菌O157:H7 wzy基因、金黄色葡萄球菌nuc基因设计及筛选出4?对引物。对多重PCR体系及条件进行优化。该方法对单核细胞性李斯特菌、鼠伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157:H7的检出限分别为3.5×106、1.6×105、2.4×105、4.8×105?CFU/mL。将优化的多重PCR方法对不同接种量富集后验证,结果表明,经过9?h富集后,该方法检出限为1?CFU/mL。该方法在鲜切莴苣、鲜切黄瓜、鲜切木瓜、鲜切哈密瓜中应用同样可扩增出4?条目标菌。因此,利用所建立的多重PCR方法对鲜切果蔬中侵染的病原菌检出限可达到1?CFU/g。该方法相较于传统的培养检测方法具有节约大量的劳力、试剂、时间等优点,检测时间也由原来的5～7?d缩短至9～11?h,对于企业或分析检验中心大批量样品的监测具有指导意义。     

TaqMan多重实时定量PCR快速检测3种常见食源性病原菌

建立一种可同时快速检测大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌和蜡样芽孢杆菌的多重实时定量PCR(qPCR)方法。依据大肠杆菌O157:H7 tir基因、单增李斯特菌mpl基因和蜡样芽孢杆菌entFM基因的保守序列分别设计特异性引物和TaqMan探针,建立多重qPCR反应体系,进行灵敏度、特异性和稳定性试验,同步检测人工染菌牛奶样品中的病原菌并与国家标准方法作对比。结果表明,建立的多重qPCR方法灵敏度高,最低检出限为12 CFU/mL;特异性强,只对3种目标菌进行PCR扩增;稳定性好,各重复性试验中Ct值的变异系数<1%;所有受污染样品阳性检出率均为100%,与国家标准方法检测结果一致,且检测周期缩短至6 h。本研究建立的TaqMan多重qPCR方法能同时快速、准确地检测乳品中的大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌和蜡样芽孢杆菌,为食品安全提供技术支撑。     

五种食源性致病菌多重PCR的条件优化和检出限分析

对沙门菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157∶H7、单核增生李斯特菌和福氏志贺菌5种食源性致病菌的多重PCR反应条件进行优化并分析方法的DNA检测限。方法 根据沙门菌的invA基因、金黄色葡萄球菌的16S rDNA基因、大肠杆菌O157∶H7的eaeA基因、单核增生李斯特菌的hlyA基因和福氏志贺菌的ipaH基因设计5对特异性引物进行多重PCR,对反应条件包括镁离子浓度、引物浓度和退火温度进行优化试验,并确定该检测方法的检出限。结果 最佳反应条件为金黄色葡萄球菌、沙门菌和福氏志贺菌引物浓度为0.25μmol/L,单核增生李斯特菌引物浓度为0.4μmol/L,大肠杆菌O157∶H7引物浓度为0.3μmol/L,Mg²⁺浓度为2.25mmol/L,退火温度为60℃;在此条件下金黄色葡萄球菌、肠炎沙门菌、大肠杆菌O157∶H7、单核增生李斯特菌、福氏志贺菌的多重PCR的DNA检出限分别为6.4、32、32、800和160pg。结论 通过对5种引物的PCR条件进行优化和检出限的分析,为食品中该5种致病菌的快速检测奠定基础,对实际应用具有指导意义。     

多重PCR同时检测食品中4 种细菌与常见霉菌

建立一种同时检测食品中金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7以及霉菌的多重聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测方法。根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因（nuc）、沙门氏菌的侵袭正调节蛋白基因（hilA）、大肠杆菌O157:H7鞭毛基因（flic）、单核细胞增生李斯特氏菌的毒力调控蛋白基因（prfA）及霉菌18S?rRNA基因V5区分别设计5?对特异性引物,并对PCR扩增反应体系和扩增条件进行优化,确定获得特异性良好的PCR扩增产物。而后在37?℃对人工污染致病菌的香肠、面包和豆腐进行增菌培养,5?种致病微生物在20?h内的检出限均可达到100?CFU/25?g。本实验建立的多重PCR检测方法适用于食品中4?种细菌与常见霉菌的同时检测,相较于传统检测方法,具有快速、简便、特异性高的优点。     

实时荧光单引物等温扩增(SPIA)技术检测大肠杆菌O157的方法研究

建立一种快速、灵敏的食品中肠出血性大肠杆菌O157的检测方法。以大肠杆菌O157的特异性基因(rfbE)为靶序列,设计相应的RNA/DNA组合引物和链终止序列,优化引物浓度、Mg2+浓度、温度等反应条件,建立实时荧光单引物等温扩增(Real Time Fluorescence Single Primer Isothermal Amplification,实时荧光SPIA)检测大肠杆菌O157的方法,并对该方法的特异性、灵敏度以及人工污染检出限进行检测。确定了实时荧光SPIA法的最适反应条件,该方法可以在55 min内完成检测工作,除大肠杆菌O157外,其他细菌均未产生特异性荧光扩增曲线,而且实时荧光SPIA检测大肠杆菌O157的灵敏度为2.0 CFU/m L,对猪肉人工污染样品中大肠杆菌O157的检出限是4.0 CFU/g。实时荧光SPIA方法检测大肠杆菌O157具有耗时短,灵敏度高,特异性强,方法简便的优越性,为检测食源性致病菌构建了一个技术平台。     

大肠杆菌O157:H7特异基因的实时荧光定量PCR检测

为建立快速、特异的检测大肠杆菌O157:H7的实时荧光定量聚合酶链式反应(real time polymerase chainreaction,RT-PCR)方法,针对大肠杆菌O157:H7的特异基因rfbE设计一对特异引物,建立SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法,并进行灵敏度、重复性和特异性实验,同时与常规PCR方法进行比较。结果显示所建立的SYBRGreenⅠ实时定量PCR方法可以快速、特异地检测出大肠杆菌O157:H7,细菌纯培养物中其灵敏度可达2×101CFU/mL,临床模拟污染肉样中能最低能检测到1×102CFU/mL的大肠杆菌O157:H7。与常规PCR方法相比,SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法对临床样品中大肠杆菌O157:H7的检出率大大提高。本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR技术能快速准确、特异、敏感地检测大肠杆菌O157:H7。     

十种食源性致病菌的多重PCR快速检测方法

为建立能够同时检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌属、克罗诺杆菌属、志贺氏菌属、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7、铜绿假单胞菌、粪链球菌、产气荚膜梭菌等10种食源性致病菌的多重PCR方法,通过特异性引物的设计、引物特异性验证、引物灵敏度验证和多重PCR检测体系主要反应条件优化,建立多重PCR检测体系,并对其特异性、灵敏度以及人工感染样品应用进行评价。结果表明,建立的多重PCR检测体系可以扩增出10种食源性致病菌的特异目标条带,无非特异扩增。测序结果与目的基因序列进行比对,其序列同源性高达98%,体系灵敏度可达10^-1 ng/μL。人工污染样品应用结果表明,采用多重PCR方法简单快速,仅需简单增菌,检出限可达10 CFU/mL,整个检测时间在48 h以内。建立的多重PCR检测体系特异性强、灵敏度较高,与检验机构实际检测工作联系紧密,具有推广应用价值。     

大肠杆菌O157:H7的免疫捕获PCR快速检测

研究用特异性的出血性大肠杆菌O157:H7单克隆抗体包被处理的PCR管,对样品中的病原菌进行特异性免疫富集,以免疫捕获-PCR(Immunocaptured PCR,IC-PCR)管中捕获到的病原菌作为模板进行PCR扩增。结果显示免疫捕获-PCR对病原菌出血性大肠杆菌O157:H7检测灵敏度达到102CFU/mL,比直接PCR和ELISA提高了103倍;特异性验证实验证实,对其他10株食源性致病菌进行检测均无目标条带。该方法将免疫学和分子生物学检测结合起来,灵敏度高,特异性强,检测周期短,检测迅速,是适合检测一线进行快速检测的新方法。