与特定乳酸菌共培养对植物乳杆菌KLDS1.0391细菌素合成的诱导作用

植物乳杆菌KLDS1.0391与76株乳酸菌分别共培养后,测定培养物的抑菌活性和活菌数,判断与乳酸菌共培养对植物乳杆菌细菌素合成的影响及细菌素合成与菌体密度的关系。结果表明：植物乳杆菌KLDS1.0706、KLDS4.0315、KLDS4.0351、罗伊氏乳杆菌KLDS1.0736这4株菌与植物乳杆菌KLDS1.0391共培养后,抑菌活性显著增加(P＜0.01)。与罗伊氏乳杆菌共培养过程中细菌素的抑菌活性与植物乳杆菌KLDS1.0391的细胞密度呈现明显的正相关性,并且发现只有活的诱导菌与植物乳杆菌KLDS1.0391共培养才能够诱导细菌素的合成。     

植物乳杆菌KLDS1.0391在酸奶体系中的细菌素产生特点

植物乳杆菌KLDS1.0391能够合成细菌素,也是益生菌,在食品中既可作为益生菌使用,也可作为辅助发酵剂用于生物防控,该研究主要考察了KLDS1.0391菌株在酸奶体系中细菌素的产生特点。研究结果表明,在发酵的6 h期间,抑菌活性随发酵时间延长而增强,发酵结束时,添加植物乳杆菌KLDS1.0391酸奶组的抑菌活性显著高于仅使用酸奶发酵剂的对照组(P<0.01)。与对照组相比,加入辅助发酵剂的实验组的感官品质未发生明显的变化。植物乳杆菌KLDS1.0391具备开发益生酸奶的潜力。     

luxS基因对盐胁迫下植物乳杆菌生长及细菌素合成的影响

以植物乳杆菌KLDS1.0391野生株及其luxS基因缺失突变株为研究对象,探究luxS基因对该菌盐耐受能力的影响,并测定在0%、2%、3%、4%和6%质量分数NaCl胁迫条件下,luxS基因缺失对该菌生长及细菌素合成的影响,采用实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术在转录水平上测定该菌细菌素合成相关基因的表达水平。结果表明：随NaCl质量分数的升高,2 株菌的存活率均逐渐下降,当NaCl质量分数大于3%时,相同条件下野生株对盐的耐受能力显著强于突变株（P＜0.05）;除此之外,NaCl质量分数越高,菌株进入稳定期的时间越向后延迟,luxS基因缺失突变株在各NaCl质量分数下生长及细菌素合成能力均显著弱于野生株（P＜0.05）。实时荧光定量PCR结果显示,当培养至稳定期24 h时,细菌素结构基因plnEF以及双组分调节基因plnD和plNC8HK均因luxS基因的缺失,表达显著下调（P＜0.05）。因此,luxS基因缺失显著降低植物乳杆菌KLDS1.0391盐耐受能力,并且在NaCl胁迫条件下,该菌生长及细菌素合成能力也因luxS基因缺失而显著下降。     

植物乳杆菌KLDS1.0391 PurR和PurL蛋白的原核表达、纯化及其与细菌素合成启动子的相互作用

通过体外实验探究purR、purL基因对植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）KLDS1.0391细菌素合成是否具有直接调控作用。基于植物乳杆菌KLDS1.0391全基因组序列,通过聚合酶链式反应扩增得到PurR和PurL蛋白的编码基因,构建原核表达载体,将重组质粒导入大肠杆菌M15中进行诱导表达,采用镍柱亲和层析法纯化得到目的蛋白,透析后超滤浓缩,通过凝胶阻滞实验以及生物膜干涉技术研究两种蛋白与菌株细菌素合成调控区域是否具有结合作用。结果表明,PurR蛋白以可溶性蛋白形式存在,PurL蛋白以包涵体蛋白形式存在,纯化后经聚丙烯酰胺凝胶电泳显示条带单一,达到电泳纯,经过浓缩后PurR蛋白质量浓度为0.74 mg/mL,PurL蛋白质量浓度为3.8 mg/mL。凝胶阻滞实验以及生物膜干涉技术结果表明,2 个重组蛋白与菌株细菌素合成基因的启动子在菌体外无直接的结合作用,对于两种蛋白对细菌素合成的调控是否属于间接调控作用以及在菌体内的调控情况,需进一步研究。     

氨基酸对植物乳杆菌KLDS1.0391生长及细菌素合成的影响

为探究氨基酸对植物乳杆菌生长及细菌素合成的影响，调节化学成分确定培养基中的氨基酸组成，培养植物乳杆菌KLDS1.0391，采用高效液相色谱法测定乳酸含量，通过实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）分析细菌素和氨基酸合成相关基因的表达。结果表明，天冬氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺及谷氨酰胺的缺失导致该菌生长能力和细菌素合成量均显著降低（P＜0.05）；谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、色氨酸及缬氨酸的缺失仅影响菌体生长，对细菌素合成无明显影响；而赖氨酸胁迫（缺失及过量）对菌体的生长影响很小，但却显著影响细菌素的合成。色谱结果显示，赖氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、脯氨酸及苏氨酸单缺失后乳酸含量升高。real-time PCR结果表明，细菌素合成相关基因plnEF、plnD及plNC8HK因赖氨酸的缺失表达显著下调（P＜0.05），而上述基因在外源赖氨酸质量浓度达到2.0 g/L前，上调水平随赖氨酸添加量的增大而增大。氨基酸合成关键基因dapG、yclM 因赖氨酸缺失表达显著上调，相反，上述基因在赖氨酸质量浓度为2.0 g/L时表达量显著下调（P＜0.05）。由上述研究结果推测，当赖氨酸缺失时，菌体通过上调基因dapG 和yclM 的表达以合成多种蛋白质保证其正常生长代谢，赖氨酸可正向诱导该菌细菌素合成，其可能作为细菌素合成底物发挥作用。     

一株产细菌素植物乳杆菌高密度发酵培养基的筛选及其在酸奶中的应用

目的:优化用于高密度发酵产细菌素的植物乳杆菌KLDS 1.0391的经济有效培养基,旨在生产具有益生作用的辅助发酵剂。方法:以发酵液中活菌数量和抑菌效果为指标,比较不同水解度的脱脂乳粉、乳清粉、麦麸,以及玉米浆粉的发酵效果,制备冻干形式的植物乳杆菌直投式发酵剂,将其添加至酸奶中,评价其对酸奶发酵时间、pH、滴定酸度、粘度和感官评价的影响,进而确定其在酸奶中应用的可行性。结果:确定脱脂乳粉、乳清粉和麦麸培养基的最佳水解度分别为15%、15%和20%;植物乳杆菌KLDS 1.0391在玉米浆粉培养基中获得的发酵效果最佳,活菌数量达到9.53 lg CFU/mL,抑菌圈直径达到12.69 mm。植物乳杆菌直投式菌种的添加对酸奶发酵时间和感官评价无显著影响(P>0.05),酸奶粘度下降,但可以缓解酸奶的后酸化程度。通过优化得到植物乳杆菌KLDS 1.0391高密度发酵的廉价培养基为:4%玉米浆粉,同时补充2%葡萄糖和0.1% Tween-80。结论:制得的植物乳杆菌直投式发酵剂可应用于酸奶生产中。     

胆盐胁迫对植物乳杆菌KLDS1.0391葡萄糖代谢和细菌素合成的影响

为研究胆盐胁迫是否显著影响植物乳杆菌KLDS1.0391的葡萄糖代谢和细菌素合成能力,将菌株在不同浓度的胆盐中胁迫一定时间,重新接种于MRS培养基中继续培养24 h后,测定活菌数量、残糖量、乳酸产量、乳酸脱氢酶活性及其上清液的抑菌能力。结果表明:植物乳杆菌KLDS1.0391在含0.1%和0.2%胆盐的MRS培养基中胁迫0.5 h和2.0 h,再培养24 h后,活菌数量、葡萄糖利用率、代谢产物乳酸产量和乳酸脱氢酶活性均显著提高,抑菌圈直径无明显变化;而在含0.5%胆盐的MRS培养基中胁迫2.0 h,再培养24 h后,所有检测值均较对照组显著下降。菌株经低含量胆盐(≤0.2%)胁迫,再培养后的活菌数量和葡萄糖代谢能力提高,而经高含量胆盐(≥0.4%)胁迫后,活菌数量、葡萄糖代谢和细菌素合成能力均下降。     

LuxS/AI-2群体感应系统对植物乳杆菌抵御环境胁迫的作用

LuxS/AI-2群体感应系统可介导乳酸菌种内和种间信号,其中自诱导因子-2(autoinducer-2,AI-2)对乳酸菌的益生菌活性(环境胁迫耐受、黏附和定植能力等)至关重要。然而,目前对于LuxS/AI-2群体感应系统在植物乳杆菌抵御多种环境胁迫中的调控作用仍有待系统研究。通过群体感应信号分子研究及实时荧光定量聚合酶链式反应,分析了环境胁迫下植物乳杆菌KLDS 1.0328信号分子AI-2产量及群体感应关键基因luxS和pfs的转录情况。结果表明:酸胁迫可诱导信号分子AI-2的产生,强酸及强碱胁迫下可显著促进luxS及pfs的转录(P<0.05)。低温25℃、高温50℃、质量分数6.0%NaCl及质量分数3.0% NaCl+3.0% KCl诱导的高渗透压胁迫均会显著抑制菌体的增殖和代谢产酸,并抑制信号分子AI-2的产生;25℃低温胁迫会上调luxS及pfs基因的转录。随着高渗胁迫程度的增强,luxS及pfs基因的转录水平均逐步上调。营养胁迫诱导植物乳杆菌KLDS 1.0328产生更多的信号分子AI-2;随营养胁迫程度的加剧,luxS的转录水平显著上调,在营养物质体积分数为20%时,luxS及pfs基因的转录均达到最高水平,而pfs基因的转录在营养物质被稀释至体积分数为40%~60%时被显著抑制(P<0.05)。研究结果表明,多种环境胁迫下LuxS/AI-2群体感应系统具有不同的变化规律,且在植物乳杆菌KLDS 1.0328的抗逆过程中发挥重要作用。     

超滤法分离植物乳杆菌KLDS1.0391发酵液中的细菌素

采用截留分子质量1kD和3kD的超滤膜分离植物乳杆菌KLDS1.0391发酵液中的细菌素,研究主要超滤操作参数对膜通量和细菌素效价的影响,确定超滤法分离细菌素的条件。结果表明：超滤法分离物乳杆菌KLDS1.0391发酵液中细菌素的最适条件为：采用截留分子质量为3kD的超滤膜进行分离,超滤温度30℃,操作压力0.140MPa,超滤时间120min,细菌素的效价由574.99IU/mL提高到1849.40IU/mL,比活力为185.96IU/mg,纯化倍数为8.0,浓缩倍数为3.0。     

微生物共培养促进植物乳杆菌RX-8高效合成细菌素的调控机制

目的:植物乳杆菌RX-8是一株分离自中国传统泡菜的益生菌,该菌株具有产Ⅱb类细菌素植物乳杆菌素(Plantaricin)EF的优良特性,然而产量较低。目前采用与外源微生物共培养的方式提高细菌素产量,然而共培养体系中具体的调控机制尚不清楚。本研究通过敲除种内群体感应信号分子的关键基因plnA,构建种内群体感应缺失的共培养体系,探究微生物共培养对于细菌素高效合成的内在机制。方法:构建基因缺失突变菌株植物乳杆菌ΔRX-8,通过突变菌株和野生菌株与枯草芽孢杆菌1.8715在共培养过程中的生长差异、信号分子分泌量变化以及相关基因的表达量,探究种间群体感应系统促进细菌素高效合成的作用机制。结果:在敲除关键基因plnA后,共培养中突变菌株生长曲线上与野生菌株并无明显差异,而细菌素产量有所下降。与纯培养相比,共培养体系中群体感应信号分子AI-2的分泌量在前期显著增加,而后趋于一致,从菌株水平上看并无明显差异。纯培养体系中,突变菌株的双组分系统plnBCD基因表达量略低于野生菌株,细菌素合成基因plnEF的表达量同样有所下降,然而,并不影响种间信号分子AI-2合成的基因LuxS和pfs的相对表达量。结论:在种内信号分子缺失的共培养体系中,种间信号分子可以正常分泌,种间群体感应系统可以发挥作用,推测可能存在共用双组分系统,共同促进细菌素的高效合成。     

乳杆菌AI-2/LuxS系统介导的生理代谢对环境胁迫的响应及其人工调控

乳酸菌在自然发酵过程中受到多种环境胁迫的影响。群体感应系统能够介导细菌生物膜的形成从而提高其环境耐受性,这可能是提高乳酸菌发酵性能的潜在调控靶点。该研究比较了1株植物乳杆菌逆境驯化前后的AI-2/LuxS系统差异,进而解析外源群体感应干扰物质对菌株生理代谢的影响。结果显示,柠檬酸驯化后的植物乳杆菌D-840生物膜形成能力提高了485%(P<0.05)。2株菌均能产生群体感应信号分子AI-2,驯化后植物乳杆菌D-840在柠檬酸胁迫下单位菌体所产AI-2显著低于出发菌株(P<0.05)。在15 g/L柠檬酸质量浓度下,植物乳杆菌D和植物乳杆菌D-840中的luxS基因表达量均下调,pfs基因表达量则分别提高了71.4%和49.3%(P<0.05)。AI-2前体(S)-4,5-二羟基-2,3-戊二酮的添加对菌株生理代谢的影响并未呈现浓度依赖性。S-腺苷甲硫氨酸在添加量为1 g/L时植物乳杆菌D和植物乳杆菌D-840苯乳酸产量分别提高了12.2%和25.5%(P<0.05)。研究表明,AI-2/LuxS系统与植物乳杆菌抗逆性及代谢性能具有显著的相关性,并且通过添加AI-...     

产细菌素乳酸菌的筛选及对农家干酪保质期的影响

从实验室保存的7 株乳酸菌中,经分离纯化,以金黄色葡萄球菌为指示菌,筛选获得1 株高产细菌素的菌株KLDS 1.0338,排除有机酸和过氧化氢的干扰以及蛋白酶敏感性实验,确定抑菌作用是由细菌素产生的。通过菌株形态学分析,生理生化及16S rDNA分析鉴定菌株KLDS 1.0338为干酪乳杆菌ATCC 334。进一步利用该菌株制作农家干酪,考察4 ℃贮藏期间干酪的变化,添加KLDS 1.0338干酪乳杆菌的实验组抑菌活性显著大于未添加KLDS 1.0338干酪乳杆菌组（P＜0.01）,实验组的pH值下降平缓,可以有效延长农家干酪的货架期,并保持产品原有的色泽、风味、质构等感官特性。     

三株乳酸杆菌益生及免疫特性研究

试验以副干酪乳杆菌KLDS1.0351、植物乳杆菌KLDS1.0985及KLDS1.0986为对象,探究其耐人工胃液、肠液、耐胆盐能力及三株菌株对脾淋巴细胞增殖的影响。结果表明,三株菌株耐人工胃液、耐人工肠液和耐胆盐能力良好,副干酪乳杆菌KLDS1.0351强于植物乳杆菌KLDS1.0985和KLDS1.0986。乳酸杆菌对脾淋巴细胞活性的影响随活菌数量的增加而增大。活菌数为107 CFU/m L时,对脾淋巴细胞活性的影响为KLDS1.0986KLDS1.0351KLDS1.0985;KLDS1.0351对脾淋巴细胞的增殖具有较好的促进作用,而KLDS1.0985和KLDS1.0986两株菌株只有活菌数达到107 CFU/m L时才有促进作用。     

植物乳杆菌HE-1由AI-2/LuxS介导的群体感应与生物膜形成关系的研究

本研究从AI-2/LuxS群体感应出发,研究植物乳杆菌HE-1的AI-2信号分子生成与生物膜形成的关系,同时对luxS基因进行扩增,从分子生物学角度验证菌株HE-1的AI-2信号分子产生。研究使用生物发光的方法检测植物乳杆菌HE-1不同培养时间AI-2的产生量;使用微孔板法确定不同时间点生物膜的生成量;之后使用PCR的方法扩增其luxS基因片段,对扩增片段进行同源性和系统发育分析。结果显示植物乳杆菌HE-1的生物膜生成时间和生成量与AI-2信号分子的产生时间和产生量非常吻合,luxS基因成功扩增,同源性分析显示植物乳杆菌HE-1与已知植物乳杆菌luxS基因同源性高达99%以上。分析实验结果得出植物乳杆菌HE-1生物膜生成与AI-2/LuxS群体感应系统二者之间有密切的关系,并且luxS基因的扩增成功和同源性分析从分子生物学上验证了植物乳杆菌HE-1具有产生AI-2信号分子的关键基因。     

pfs基因原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化

以植物乳杆菌KLDS1.0391的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增得到pfs基因,与Gen Bank中的序列对比发现同源性为99%。将目的基因与表达载体p QE-30连接,并将重组质粒p QE-30-pfs转化到E.coli M15中。异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达重组蛋白,经SDS-PAGE分析,在全菌体蛋白中含有一条明显的特异性蛋白条带,大小约为27.4ku。经Ni-NTA纯化系统纯化后,在SDS-PAGE凝胶电泳图上获得纯化产物的条带。结果表明,原核表达载体p QE-30-pfs构建成功,且Pfs蛋白在大肠杆菌中成功表达,采用Ni-NTA纯化系统成功纯化了重组蛋白Pfs,为体外合成AI-2（Autoinducer-2）奠定了基础。      

植物乳杆菌KLDS1.0391所产细菌素的纯化

植物乳杆菌KLDS1.0391的无细胞上清液首先经过饱和度为70%的硫酸铵沉淀,收集的沉淀溶于1/40体积0.02mol/L的乙酸钠缓冲液(pH 6.5),复溶后的样品采用填充SP SepharoseTMFast Flow的COLUMN XK 16/20层析柱进行阳离子交换纯化,之后采用SOURCE 5RPC ST 4.6/100层析柱进行反相纯化。结果表明,具有抑菌活性的细菌素纯化样品经高效液相色谱检测,显示为单峰,说明其基本得到纯化,经Tricine-SDS-PAGE分析和MALDI-TOF质谱,判定该细菌素的分子质量约为1770D。     

重组原核表达载体pQE-30-luxS的构建与表达

构建原核表达载体pQE-30-luxS,并在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白。以植物乳杆菌KLDS1.0391的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增luxS基因,同时克隆到pMD18-T simple中,经鉴定正确后与表达载体pQE-30连接,将重组质粒pQE-30-luxS转化到E.coli M15中,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE鉴定。结果表明原核表达载体pQE-30-luxS构建成功,测序证实插入的目的片段与已知luxS基因序列一致,且LuxS蛋白在大肠杆菌中成功表达。该结果为体外合成信号分子AI-2奠定了基础。      

低聚半乳糖对植物乳杆菌生长及部分代谢的影响

以一株能产细菌素的植物乳杆菌KLDS1.0391为研究对象,将MRS培养基中的葡萄糖用等量的低聚半乳糖替代,采用体外发酵方式,研究37℃培养36 h过程中活菌数、p H和滴定酸度的变化,同时分别测定培养28 h和24 h时有机酸和细菌素的产量。结果表明:随培养时间的延长,培养物的p H先迅速下降,至12 h后下降速度逐步平稳,以低聚半乳糖作为碳源时促生长作用显著高于葡萄糖(p<0.05),且菌体衰退较为缓慢。而且该菌株代谢低聚半乳糖时所产生的有机酸及抑菌活性均更高,其中有机酸主要为乳酸、乙酸和丙酸。      

微生物共培养对植物乳杆菌RX-8合成细菌素的诱导作用

目的:植物乳杆菌RX-8分离自中国传统泡菜,可代谢合成Ⅱb类细菌素plantaricin EF.该细菌素抑菌谱广,加工应用特性良好,有作为天然食品生物防腐剂的巨大潜力,然而,其合成水平较低,工业化生产及应用严重受限.本研究探讨外源微生物共培养作为环境刺激因子,诱导菌株RX-8高效合成plantaricin EF的可行性...     

乳酸菌产细菌素生物学特性的研究及培养条件的优化

目的研究乳酸菌产细菌素的生物学特性并优化培养条件。方法将实验室保藏的EF2(植物乳杆菌)和PP2(嗜酸乳杆菌)2株乳酸菌进行混合发酵,采用牛津杯法分析细菌素的生物学特性,并通过单因素实验和正交实验优化了EF2和PP2混合发酵产细菌素的培养条件。结果细菌素在酸性、中性、弱碱性条件下活性较强;耐高温,属于热稳定性物质,它对胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K和中性蛋白酶敏感,对α-淀粉酶和木瓜蛋白酶不敏感,是广谱细菌素。EF2、PP2混合发酵产细菌素的最佳培养基成分为葡萄糖20g/L、蛋白胨12.5 g/L、牛肉膏15 g/L、酵母膏5 g/L、K2HPO4·3H2O 2 g/L、无水乙酸钠5 g/L、柠檬酸三铵2 g/L、MgSO40.2 g/L、MnSO4 0.05 g/L、Tween-80 2 mL/L、蒸馏水1 L。最佳培养条件为:初始pH为6.5、接种量4%,装液量100 mL/250 mL,发酵温度35℃,在此条件下,细菌素抑菌活性比优化前提高了1.36倍。结论乳酸菌EF2和PP2混合培养得到的细菌素为具有较好抗性的广谱细菌素,并通过单因素实验和正交实验确定了2株乳酸菌混合培养产细菌素的优化条件。