重组短小芽孢杆菌CotA漆酶的酶学性质及发酵优化研究

细菌漆酶具有良好的热稳定性和抗碱性环境能力,在工业废水处理和染料脱色方面具有很大的潜力。通过研究短小芽孢杆菌W3菌株的CotA漆酶基因在大肠杆菌中重组表达的酶学性质,对其发酵培养基进行优化,以提高产量。利用分子手段实现CotA漆酶基因在大肠杆菌中的重组表达,并利用BP神经网络建模和萤火虫算法寻优对CotA漆酶发酵培养基进行优化,最后重组表达的CotA漆酶进行染料脱色研究。结果表明,重组菌株表达的CotA漆酶具有良好的热稳定性和耐碱能力,最适反应pH值为3.5,最适反应温度为80 ℃。重组CotA漆酶对底物ABTS具有良好的亲和能力,Km为0.247 mmol/L,Kcat为41.32 s ^-1。在适宜条件下的重组CotA漆酶的表达量为1 915.3 U/L,使用BP神经网络和萤火虫算法优化培养基获得最佳的发酵培养基配方为：蛋白胨1.16 g/dL、酵母粉0.428 g/dL、NaCl 1.06 g/dL、CuSO ₄ 0.274 mol/L和甘油（体积分数）0.931%。优化过的培养基产CotA漆酶酶活为3 088.68 U/L,相比未优化之前提高了61.26%。重组表达的CotA漆酶对孔雀石绿和酸性蓝129脱色效果明显,达到90%脱色率。短小芽孢杆菌W3来源的CotA漆酶具有良好的酶学性质和工业应用前景。利用BP神经网络偶联萤火虫算法寻优是CotA漆酶发酵培养基优化的有效手段。     

木聚糖酶产生菌Gh-5培养基配方及发酵条件的优化

研究培养基组分与发酵工艺条件对试验菌株Gh-5产木聚糖酶的发酵影响,并对木聚糖酶的酶学性质进行初步研究。结果表明,该菌最适发酵产酶培养基组分为甘露糖15 g/L,氯化铵10 g/L,ZnSO4 0.3 g/L,KH2PO4 0.5 g/L;最适发酵条件为温度37 ℃;pH值为8.0;接种量14 %;发酵培养生长周期36 h。木聚糖酶产生菌株Gh-5发酵优化后的酶活力为114.64 U/mL,较优化前38.02 U/mL提高了201.53%。木聚糖酶酶学性质研究结果表明,木聚糖酶酶活最适pH值为8.0;最适温度为65 ℃;Zn2+对木聚糖酶酶活有较好促进作用。     

一株产柚苷酶菌株的ARTP诱变育种及培养基的优化

利用常温室压等离子体技术对一株产柚苷酶菌株互隔交链孢霉(A. alternate)SK.37001进行快速诱变处理,获得一株高产柚苷酶菌株A. alternate SK.37002,与野生菌株相比,该菌株发酵酶活提高了208%。通过单因素实验确定发酵产柚苷酶的最适碳源为蔗糖,最适诱导物为柚皮苷,最适氮源为硝酸钠,利用Plackett-Burman试验筛选出影响液态摇瓶发酵酶产量的3个重要因素:硝酸钠、氯化钙、磷酸氢二钾,在此基础上运用最陡爬坡实验逼近最大响应值区域,再利用Box-Behnken设计及响应面分析法进行回归分析,获得最佳培养基配方为:1 g/L柚皮苷,5 g/L蔗糖,5 g/L硝酸钠,0.8 g/L磷酸氢二钾,0.7 g/L氯化钙,0.5 g/L氯化钾,0.5 g/L硫酸镁。采用优化后的培养基进行摇瓶发酵产柚苷酶酶活为624.73 U/mL,与模型预测接近,发酵产酶量比优化前提高了90%。     

产磷脂酶D工程菌构建及发酵条件优化

该研究构建产磷脂酶D(phospholipase D,PLD)的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)工程菌,比较4个单启动子(P_HpaⅡ、P₍ylb(F4))、P_2069m、P₄₃)对PLD酶活的影响,摇瓶发酵表明启动子PHpa Ⅱ酶活最高,为0.32 U/mL。进一步以此工程菌作为发酵菌株,通过单因素试验和响应面试验,对该菌株产PLD的发酵条件进行优化。结果表明最佳产酶条件为接种量2.5 mL/dL、发酵温度37℃、硫酸铵质量浓度0.8 g/dL、甘油质量浓度1.94 g/dL、酵母粉质量浓度1.93 g/dL,在此发酵条件下发酵12.5 h,PLD的酶活达到0.85 U/mL,比出发菌株提高62.5%。同时,以环戊基甲醚作为有机相,柠檬酸-柠檬酸钠为水相,利用双相反应体系合成磷脂酰葡萄糖苷(phosphatidyl-glucose,PtdGlc)、磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)和磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol,PG),转化率分别为9...     

中性纤维素酶高产菌株的诱变选育及产酶条件

通过紫外线和γ射线交替诱变,筛选得到一株高产纤维素酶的突变菌株BE40 39.与出发株相比,其产酶能力提高1.3倍,发酵性状与出发菌株也有明显的差异.突变菌株发酵试验发现,Avicel是突变菌株产酶最合适的纤维素质碳源.通过对发酵培养条件的试验,得出最佳培养条件是:Avicel质量浓度为0.1g/dL,胰蛋白胨质量浓度为0.3g/dL,最适发酵温度为30℃,最佳培养基初始pH4.2,发酵5d达到产酶高峰.     

产褐藻胶裂解酶菌株Cobetia sp. WG-007的筛选及发酵优化

以褐藻酸钠为唯一碳源,从腐烂的海带中筛选出一株高效降解褐藻胶的菌株,经形态、生理生化和16S rDNA测序鉴定,将其命名为Cobetia sp.WG-007。采用单因素和正交试验优化,确定该菌株摇瓶发酵最适产酶条件为褐藻酸钠6.0 g/L,蛋白胨5.0 g/L,NaCl 20 g/L、K2HPO40.25 g/L,菌株在25℃条件下发酵培养30 h达到最高酶活,为160.7 U/mL,相比优化前酶活力提高了3.52倍。     

发光杆菌产几丁质酶的工艺优化

为提高海洋发光杆菌Photobacterium sp.LG-1产低温几丁质酶的酶活性,利用响应面法对其发酵产酶条件进行了优化。Plackett-Burman实验结果表明,影响菌株产酶的三个主要因素分别为发酵温度、发酵时间和酵母膏含量。菌株产酶的最适条件为：胶体几丁质浓度12.0 g/L、酵母膏浓度4.5 g/L、转速220 r/min、发酵温度20℃、装液量75 mL/250 mL、接种量1%、初始pH7.0、发酵时间120 h,几丁质酶的最大酶活为5.10 U/mL。实际平均酶活经验证与预测酶活相近,几丁质酶活比优化前提高了11.50%。为下一步低温几丁质酶的降解机制研究及在工业中的应用提供参考。     

谷氨酸脱羧酶发酵工艺的优化

用大肠杆菌AS1.505进行液态发酵生产谷氨酸脱羧酶并优化培养基,考察了碳源、氮源、复合营养物质、起始pH及发酵时间对酶活的影响,确定最佳产酶培养基组成为:葡萄糖1.0 g/dL,蛋白胨3.0 g/dL,氯化钠0.3 g/dL,磷酸氢二钾0.1 g/dL,硫酸镁0.02 g/dL,L-谷氨酸0.01g/dL,玉米浆1.5 g/dL,生物素30 t,g/L,麸皮4 g/dL;pH 6.5.在此基础上,设计发酵条件的优化实验.实验结果表明为:250 mL的三角瓶装液量25 mL,37℃,起始pH 6.5,培养18 h达到产酶高峰,产酶活力可达1 290 U/mL.     

米曲霉ASP-m21产果胶酶及其酶学性质

以产果胶酶PG为主的米曲霉(Aspergillus oryzae)为出发菌株进行固态发酵研究.确定最适合发酵条件为:以30 g/dL麸皮,8 g/dL橘皮粉,添加2 g/dL的泡沫材料作为透气支撑载体,每千克原料添加8 g硫酸铵,10 g葡萄糖,接种体积分数为10%,经过42 h发酵,最终果胶酶酶活可达807 U/g(干曲计).果胶酶的最适反应温度为50 ℃,最适pH范围在3.0～3.6之间.试验结果表明:果胶酶在3.0～7.0的pH的范围内,适合产物生成速度最大的pH点在3.6左右,产物生成速度为0.3 mmol/(Lmin);50 ℃是酶促反应的最适温度,在30 min条件下生成的产物最高可达9 mmol/L.在桔子澄清实验中,向含有体积分数30%的橙汁中添加酶活为1 U/mL的果胶酶,分解果胶为半乳糖醛酸,并且随着半乳糖醛酸量的增加,橙子浆的黏度降低,透光率增加.反应7 h后,透光率可高达91.1%.     

LiCl-ARTP复合诱变选育高产碱性蛋白酶菌株及其发酵条件优化

以地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis）E-417为出发菌株,采用氯化锂（LiCl）-常压室温等离子体（ARTP）复合诱变法对其进行诱变,通过酪蛋白平板初筛、摇瓶复筛、遗传稳定性验证筛选高产碱性蛋白酶的优良菌株,并通过单因素及响应面试验对其发酵产酶条件进行优化。结果表明,在氯化锂添加量为1.5%、ARTP照射时间为45 s的最适复合诱变条件下筛选得到1株高产碱性蛋白酶的优良菌株F-3,酶活达到12 147 U/mL,且该菌株传代8次后仍具有良好的遗传稳定性,其最适发酵培养基成分为玉米粉41 g/L、豆饼粉40 g/L、碳酸钠2.1 g/L、磷酸氢二钠2.0 g/L;最适发酵条件为发酵温度37 ℃、初始pH值7.0、接种量8%。在此优化条件下,碱性蛋白酶酶活达到16 156 U/mL,较原始菌株提高75%。     

竹黄分离菌液态发酵条件及生物学活性研究

以竹黄分离菌株sh-3为试验材料,以生物量和红色素产量为评价指标,采用单因素试验和正交试验优化发酵条件,并对发酵液的生物活性进行研究。结果表明,较优发酵培养条件是20%马铃薯、0.03%MgSO4·7H2O、果糖3%、初始pH值为4、温度28 ℃、装液量120 mL/250 mL、摇床转速180 r/min,培养时间6 d。在此最佳发酵条件下红色素含量（OD529 nm）为0.853。红色素具有广谱抑菌活性,对大肠杆菌（Escherichia coli）最低抑菌浓度（MIC）0.158 mg/mL,发酵液的正丁醇提取物具有较好的抗氧化活性和较强的抑制酪氨酸酶活性。     

药用真菌——竹黄成分的分析测定

对市售竹黄干品的十种营养成分进行了分析测定,并与香菇、杏鲍菇、银耳和黑木耳进行了比较,结果表明其水分、灰分、总糖含量比较低,脂肪、甘露醇、游离氨基酸的含量比较高。蛋白质含量低于香菇和杏鲍菇,高于银耳和黑木耳。总碳水化合物低于银耳和黑木耳、高于香菇和杏鲍菇。     

竹红菌素

竹红菌素是竹黄菌中的主要成分。本文概述了竹黄菌的生物学特性及自然分布、竹红菌素的生理功能及其生产应用。     

培养基及培养条件对Pycnoporus sp. SYBC-L1分泌漆酶的影响

从作者所在实验室保存的3株白腐真菌中筛选到一株液态发酵产漆酶的密孔菌Pycnop-orus sp.SYBC-L1,以漆酶活力为指标,采用正交试验法,优化了Pycnoporus sp.SYBC-L1分泌漆酶的培养基:麸皮水煮液60 g/L,葡萄糖60 g/L,豆粕粉15 g/L,CuSO_4·5H_2O 1.0 mmol/L;培养条件:初始pH 3.0,装液量50 mL/250 mL,30℃、200 r/min培养13 d,漆酶活力达24.95 U/mL,为优化前的36.16倍.     

麦草浆的木聚糖酶和漆酶/介体体系协同生物漂白研究

用产自黑曲霉(Aspergillus niger)的木聚糖酶和产自担子菌(Basidiomycete sp.)的漆酶进行了麦草浆次氯酸盐漂前预处理的研究。找出了木聚糖酶和漆酶不同处理程序对麦草浆硬度和漂白白度的影响，并对漆酶、介体用量和酶处理时间进行了优化。结果表明，漆酶用量为5．0U／g，介体ABTS用量为0．1％，酶处理时间为120min；用LMS在0．1MPa氧压下处理麦草浆，纸浆硬度降低率比常压LMS处理浆提高21个百分点，即由10．5％提高到31．6％；经L-X处理的纸浆硬度比X-L低，漂白后纸浆白度分别比对照浆高3．9％ISO和3．0％ISO。     

响应面法优化中性蛋白酶提取苦竹花多糖及多糖性质分析

目的:采用响应面法优化中性蛋白酶辅助提取苦竹花多糖的最优条件,并对提取得到的粗多糖进行分离纯化、理化性质及体外抗氧化性测定。方法:在单因素试验基础上,考察提取时间、酶添加量、提取温度对苦竹花粗多糖得率的影响。利用响应面试验建立数学模型,确定最佳提取条件。苦竹花粗多糖经分离纯化,获取2个组分,分别命名为SBH-1和SBH-2,其中以SBH-1为主要组分。通过高效凝胶渗透色谱和红外光谱对SBH-1组分进行单糖组成、分子质量及初步的结构研究。通过与VC对比,研究苦竹花粗多糖SBH-1的体外抗氧化活性,即1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率及抗脂质过氧化能力的测定。结果:在中性蛋白酶添加量0.83%,提取温度46.68℃,提取时间115.95 min条件下,粗多糖得率为7.63%。经检测苦竹花粗多糖SBH-1组分分子质量为18.3 k D,主要由甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)3种单糖组成比例为1.3∶2.3∶1.2。SBH-1对DPPH自由基和超氧阴离子自由基清除EC_(50)分别为2.03 mg/mL和1.038 mg/mL。结论:采用中性蛋白酶辅助提取得到的苦竹花粗多糖简单易行,纯化得到的中性杂多糖SBH-1具有很好的活性,为进一步研究和开发提供理论基础。     

液体发酵竹红菌素的稳定性及抗肿瘤活性

研究竹黄无性型菌株ZH-5-1液体发酵菌丝体中竹红菌素的稳定性及抗肿瘤活性。采用分光光度法测定竹红菌素溶液的吸光度以考察竹红菌素稳定性;以中国仓鼠卵巢肿瘤细胞(CHO细胞)株、人子宫颈癌细胞HeLa、HL-60人白血病细胞株和A-549人肺腺癌细胞株为模型,用Resazurin法检测液体发酵竹红菌素的抗肿瘤活性。结果显示:液体发酵竹红菌素在酸性条件下表现稳定;对热、光、H2O2、亚硫酸钠的稳定性良好;低浓度的金属离子不会影响竹红菌素稳定性,在所有供试离子中Mn2+、Cu2+、Fe2+对竹红菌素稳定性的破坏作用较大。液体发酵竹红菌素样品对4种供试肿瘤细胞株均具有生长抑制活性,对CHO、HL-60、A-549肿瘤细胞的抑制作用表现出良好的剂量-效应关系,其IC50分别为0.47、0.11、0.22mg/mL。总之,液体发酵竹红菌素是一种稳定的且具有抗肿瘤活性的天然产物,具有广阔的应用空间。     

淀粉酶对竹黄菌固态发酵产竹红菌素的影响

研究了竹黄菌在固态发酵产竹红菌素的过程中,搅拌(初始搅拌和搅拌间隔时间)和外加淀粉酶对竹红菌素产量的影响。研究表明,优化后的最佳方案为:初始搅拌在发酵第3天进行,此后的搅拌间隔时间为36 h,外加淀粉酶以细菌中温α淀粉酶和糖化酶的复合添加为最佳,其中细菌中温α淀粉酶在固态发酵初始阶段加入,添加量为2.85 U/g,糖化酶在发酵第3天加入,添加量为29.78 U/g。经过搅拌和外加淀粉酶的研究后,竹红菌素的产量到达了60.74 mg/g,是先前竹红菌素产量报道的3.66倍,并且固态发酵的周期由15 d缩减到了13 d。本研究首次报道了淀粉酶添加应用于固态发酵的研究,并且对竹红菌素产量的提高起到了显著的作用。     

多拷贝脂肪酶基因在黑曲霉中表达研究

前期通过分泌蛋白质谱分析和转录组测序,确定了一株高产漆酶的白腐菌为灵芝,其分泌漆酶的编码基因为lcc1。本研究PCR扩增lcc1基因的基因组序列（lcc1-D）和cDNA序列（lcc1-C）,分别构建表达载体（pSZH6R-lcc1-D、pSZH6R-lcc1-C）。通过农杆菌介导法转化黑曲霉TH-2,筛选出在糖化酶基因glaA位点发生同源重组的纯合黑曲霉转化子。摇瓶发酵后取发酵液上清进行Native-PAGE检测和酶活测定,结果表明,重组菌株lcc1-C的漆酶表达量和酶活力高于lcc1-D,酶活力最高值分别为431.94 U/L和218.06 U/L。Real-time PCR结果表明,lcc1-C中的漆酶mRNA水平是lcc1-D的3.38倍。对重组漆酶进行酶学性质分析,发现其最适反应温度为60 ℃、最适pH为3.5。在染料脱色实验中发现重组漆酶对孔雀石绿、中性红、甲基橙具有明显脱色作用,介体存在时能增强漆酶对染料的脱色效果,对中性红脱色效率最强,48 h脱色率可达到91.21%。为改善重组漆酶的折叠,向重组菌株lcc1-C的发酵培养基中添加渗透调节剂,结果显示,在添加0.4 mol/L TMAO时酶活力达到1301.67 U/L,提高了1.97倍;在添加0.5 mol/L脯氨酸时酶活力达到2037.22 U/L,提高了3.64倍;在添加0.5 mol/L甘氨酸时酶活力达到1434.03 U/L,酶活力提高了2.27倍。     

漆酶对普拉红B的脱色性能研究

从温度、pH值、酶质量浓度、盐、金属离子等因素探讨了漆酶对普拉红B的脱色条件,分析了漆酶的脱色动力学性能。结果表明:在温度60℃,pH值5.5及酶质量浓度0.2 g/L的条件下,漆酶对普拉红B的脱色率达95.5%以上。元明粉对漆酶脱色的影响不大;随醋酸钠和氯化钠浓度的增加,脱色效果下降;PO34-、CO23-、Fe2+、Fe3+对漆酶脱色有一定的抑制作用,漆酶催化染料脱色反应的米氏常数Km值为846.82 mg/L。