基因敲除降低L-缬氨酸发酵中亮氨酸和异亮氨酸含量的研究

黄色短杆菌(Breviabacterium flavum)是L-缬氨酸生产的重要菌株,但缬氨酸发酵中常出现亮氨酸、异亮氨酸含量超标的问题.本研究敲除编码黄色短杆菌亮氨酸和异亮氨酸合成的关键基因,自主构建得到了工程菌株MH-1000-△ilvA、MH-1000-△leuA和MH-1000-△ilvA△leuA.对这些工程菌株进行摇瓶发酵和50 L罐发酵,结果表明,工程菌株有效地降低了L-缬氨酸发酵液中L-亮氨酸和L-异亮氨酸的含量,对于缬氨酸的高纯度生产具有一定的实际意义.     

L-缬氨酸高产菌诱变育种的研究

以黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)L-缬氨酸产生菌XQ-2为出发菌株,经硫酸二乙酯(DES)和亚硝基胍(NTG)逐级诱变处理,氨基酸结构类似物α-氨基丁酸(-αAB)、2-噻唑丙氨酸(2-TA)和α-氨基-β-羟基戊酸(AHV)定向筛选,获得一株L-缬氨酸高产菌XQ-8(Leul(-ABhr2-TAhrAHVhr)。在以135 g/L葡萄糖为碳源和50 g/L硫酸铵为氮源的培养基中摇瓶发酵72 h,产酸达64~66 g/L。     

L-苏氨酸产生菌的原生质体融合育种研究

采用原生质体融合等技术,以谷氨酸棒杆菌GY360 (Mer+ AECr+ AHVr)为亲株(A)与乳糖发酵短杆菌HS58 (Ala-+ AHVr )为亲株(B)进行原生质体融合,选育出一株产L-苏氨酸菌NRH66,该菌株遗传标记为Met-+ Ala-+ AEC+ AHVr,在摇瓶上发酵可产L-苏氨酸46.2g/L,比亲株A产酸提高了17.7%,比亲株B产酸提高64%.     

一株黄色短杆菌基因工程菌株的构建及其L- 缬氨酸积累

从谷氨酸棒杆菌模式菌株C. glutamicum ATCC13032 中克隆出L- 缬氨酸合成途径上的限速酶--乙酰羟酸合酶编码基因ilvBN。对ilvBN 进行定点突变,获得其抗反馈抑制突变型ilvBNr。以大肠杆菌- 黄色短杆菌穿梭表达载体pDXW-10 为基础,构建重组质粒pDXW-10-ilvBNr,并转化野生型黄色短杆菌B. flavum ATCC14067,获得工程菌株ATCC14067/pDXW-10-ilvBNr。3L 罐发酵实验结果显示：在野生型菌株发酵液中检测不到L- 缬氨酸积累,而工程菌株发酵液中L- 缬氨酸积累达5.0g/L。     

原生质体诱变选育L-缬氨酸生产菌的研究

采用紫外线对黄色短杆菌TV12的原生质体进行诱变 ,根据代谢控制发酵原理 ,定向筛选出具有目的遗传标记的高产缬氨酸突变株TV2 3 5 ,其L 缬氨酸的产量较出发菌株有较大幅度的提高 ,而且突变株继代遗传稳定 ,说明利用原生质体紫外诱变育种是获得L 缬氨酸高产菌的一种有效的方法     

原生质体融合选育L-亮氨酸高产菌的研究

以黄色短杆菌TQ5 35 1(Met- +Ile- + 2 TAr+SGr)和TQ5 35 6(Met- +Ile- +α ABr+ β HLr)为亲株 ,采用原生质体融合技术 ,定向选育出一株L 亮氨酸高产菌TQ980 6(Met- +IleL + 2 TAr+SGr+α ABr+ β HLr) ,该菌株经 5L罐分批发酵 64h产L 亮氨酸2 2 7g/L。     

L-缬氨酸发酵影响因素的研究

以黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）XV0505为生产菌株，研究了发酵培养基和发酵控制条件对L-缬氨酸的产量和糖酸转化率的影响。应用单因素实验确定发酵的工艺条件，利用纸层析-色班洗脱比色法测定发酵液中L-缬氨酸含量。在最优发酵条件下，通过10L罐流加发酵72h，产酸可达53．4s／L．糖酸转化率为26．7％，分别比补料分批发酵提高1l-9％和3．5％。     

灰褐链霉菌与黄色短杆菌属间原生质体融合提高ε-聚赖氨酸产量（英文）

为提高灰褐链霉菌(Streptomyces griseofuscus LS-6)的ε-聚赖氨酸(ε-poly-lysine,ε-PL)发酵水平,从增加内源性前体赖氨酸角度考虑,将S. griseofuscus LS-6与赖氨酸生产菌株黄色短杆菌(Brebvibacterium flavum S62)进行属间的原生质体融合。以S. griseofuscus LS-6产黑色素作为遗传标记挑选到1株融合子LS-32,其ε-PL摇瓶产量为2.82 g/L,是亲本菌株LS-6的1.73倍;LS-32在补料分批发酵中的ε-PL产量达到56.4 g/L,比亲本提高了38.9%。随机引物扩增多肽DNA技术显示融合子LS-32中确实有来自B. flavum S62的基因;融合子ε-PL代谢途径中关键酶的活力(己糖激酶、天冬氨酸激酶、ε-PL合成酶等)和胞内氨基酸含量(赖氨酸、谷氨酸、精氨酸等)均高于亲本,是LS-32高产ε-PL的重要原因。本研究明确了内源性赖氨酸对于提升ε-PL产量的重要性,且属间融合为ε-PL产生菌的育种研究提供了新的参考途径。     

灰褐链霉菌与黄色短杆菌属间原生质体融合提高ε-聚赖氨酸产量

为提高灰褐链霉菌（Streptomyces griseofuscus LS-6）的ε-聚赖氨酸（ε-poly-lysine,ε-PL）发酵水平,从增加内源性前体赖氨酸角度考虑,将S. griseofuscus LS-6与赖氨酸生产菌株黄色短杆菌（Brebvibacterium flavum S62）进行属间的原生质体融合。以S. griseofuscus LS-6产黑色素作为遗传标记挑选到1 株融合子LS-32,其ε-PL摇瓶产量为2.82 g/L,是亲本菌株LS-6的1.73 倍;LS-32在补料分批发酵中的ε-PL产量达到56.4 g/L,比亲本提高了38.9%。随机引物扩增多肽DNA技术显示融合子LS-32中确实有来自B. flavum S62的基因;融合子ε-PL代谢途径中关键酶的活力（己糖激酶、天冬氨酸激酶、ε-PL合成酶等）和胞内氨基酸含量（赖氨酸、谷氨酸、精氨酸等）均高于亲本,是LS-32高产ε-PL的重要原因。本研究明确了内源性赖氨酸对于提升ε-PL产量的重要性,且属间融合为ε-PL产生菌的育种研究提供了新的参考途径。     

L-谷氨酸生产菌的选育及其发酵条件的研究

采用黄色短杆菌（Brevibacterium flavum)T1为始发菌株，根据代谢控制发酵原理，利用紫外线、硫酸二乙酯进行诱变，定向选育出具有寡霉素抗性、谷氨酸氧肟酸盐抗性的温度敏感突变株TM106。然后，以温度敏感突变株TM106和产酸率高（10．5％以上）的天津短杆TG961为亲株。通过原生质体融合技术，成功地选育出了产酸率高的融合子CM021，并且该菌株系温度敏感型菌株，可用于谷氨酸强制发酵。在摇瓶条件下，产酸达13.6g/dI；在6m^3发酵罐上进行中试，产酸达14．6g/dI，转化率达62％。     

一株高产3-羟基丁酮枯草芽孢杆菌的构建

以产3-羟基丁酮枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TH-49(Val-)和产α-乙酰乳酸脱羧酶地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)AD-30为亲本菌株,以聚乙二醇为融合促进剂,进行原生质体融合获得融合子,融合子经再生、筛选等过程,最终获得高产3-羟基丁酮菌株HB-32,该菌株3-羟基丁酮产量高达49.64 g/L,比菌株TH-49(Val-)提高了61.8%,且遗传稳定性良好。进一步采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术,从分子水平上分析了高产3-羟基丁酮菌株HB-32与亲本菌株基因组的变化。结果表明,枯草芽孢杆菌(B. subtilis)TH-49(Val-)和地衣芽孢杆菌(B. licheniformis)AD-30原生质体融合成功,提高了融合子HB-32 3-羟基丁酮产量。     

利用生化方法鉴定灵芝原生质体融合子的研究

以美大灵芝和信州灵芝为出发菌株,采用化学融合法将两种灵芝原生质体进行融合,利用生化方法进行检测。结果表明:融合子胞外多糖含量与美大和信芝两亲本相比分别增加了332.80%和22.86%,胞内三萜含量与美大和信芝相比分别增加了36.21%和113.16%,胞外三萜含量与美大和信芝相比分别增加了23.17%和46.31%;采用琼脂糖凝胶电泳实验对融合子及亲本DNA进行检测,融合子DNA移动速度比亲本慢,说明融合子分子量大于两亲本,两亲本遗传物质发生重组。     

冬虫夏草与蛹虫草融合子菌丝体液体培养基筛选

以冬虫夏草与蛹虫草融合子菌丝体生物量为主要指标,采用正交设计方法对其菌丝体液体培养基进行筛选,比较3种培养方法对菌丝体的影响.结果表明其最适培养基配方为葡萄糖5.00g/L,蔗糖5.00g/L,酵母粉0.25g/L、黄豆粉5.00g/L(浸提液),KH2PO41.50g/L,MgSO4·7H2O 0.50g/L,VB1 4g/L,pH自然.25℃培养,周期156h,其菌丝体干重生物量可达3.51g/L.持续摇动培养法获得菌丝体生物量最多,利于菌体的规模发酵生产;动静相间法次之;静止法获得量较少.动静相间法所培养的菌丝体更有利于原生质体的制备和诱变育种.     

冬虫夏草与蛹虫草原生质体融合初探

采用正交设计和双灭活标记方法对冬虫夏草与蛹虫草进行原生质体融合研究,获得融合子。结果表明：最适融合条件为：40% PEG 与0.08mol/L Ca2+ 的混合溶液(pH7.0)助融,35℃融合20min,融合率为2.74 × 10-5;并用形态学、颉颃实验及分子生物学方法初步探讨了双亲和融合子三者之间的亲缘关系。     

提高衣康酸发酵产量的一种方法-原生质体融合

为了提高衣康酸发酵产量,我们制备了衣康酸土曲霉原生质体和柠檬酸黑曲霉原生质体,并进行了融合,以融合子为起点,进行诱变和筛选.实验结果表明,这种方法既简易又有效.     

双亲灭活原生质体融合选育高性能酒精酵母菌的研究

为了选育高性能的酒精酵母菌,利用双亲灭活和PEG诱导,对酿酒酵母GGFS16和GJ2008单倍体细胞进行了原生质体融合。从42株融合子中筛选得到了2株融合菌株RH3和RH5,分别适合于木薯粉和甘蔗汁酒精发酵,且较好的保持了亲本的特性。其中RH3在耐酸能力上,RH5在酒精耐受能力上要优于亲本,RH3的遗传稳定性要优于RH5。     

原生质体融合提高产谷氨酰胺转氨酶菌株产量

目的：研究并建立产谷氨酰胺转氨酶茂原链霉菌原生质体制备技术,通过原生质体融合技术筛选高产菌株。方法：以溶菌酶处理茂原链霉菌获得原生质体,采用原生质体融合技术,通过96 孔板高通量初筛、试管复筛、摇瓶验证选育高产菌株。结果：茂原链霉菌形成的原生质体再生出的菌落直径比较小,而菌丝生成的菌落直径比较大,两种形态的菌落96 孔板发酵后酶活力有显著性差异。不同的茂原链霉菌株制备原生质体,酶解程度、原生质体纯度、再生率有很大的差异,再生率最高可达1 804.25%,最低仅为12.76%。原生质融合后的高产菌株,选取96 孔板初筛酶活力前3%的菌株进行试管发酵,得到高产菌株比例为32.2%,酶活力比亲本高22.4%,经摇瓶验证产酶比对照提高16.28%。结论：利用基因组重排技术,可以初步对茂原链霉菌进行高产菌株选育。     

青岛啤酒酵母和高浓酵母原生质体融合选育高浓酿造菌株

以青岛啤酒酵母和高浓酵母为供试菌株,通过原生质体融合得到融合子。对融合子利用铜抗性初筛,利用耐压和发酵性能为指标进行实验室和100 L发酵复筛,并对融合子进行鉴定及遗传稳定性实验。结果表明：通过原生质体融合选育出的高浓菌株与青岛啤酒酵母菌株相比,表现出酵母数峰值高、降糖和还原双乙酰快的优势,且代谢风味物质组成与青岛啤酒酵母接近;经过连续使用8 代后,其总染色体DNA指纹图谱保持一致,证明该菌株的遗传稳定性高。     

Beer brewing using a fusant between a sake yeast and a brewer's yeast

Beer brewing using a fusant between a sake yeast (a lysine auxotrophic mutant of sake yeast K-14) and a brewer's yeast (a respiratory-deficient mutant of the top fermentation yeast NCYC1333) was performed to take advantage of the beneficial characteristics of sake yeasts, i.e., the high productivity of esters, high tolerance to ethanol, and high osmotolerance. The fusant (F-32) obtained was different from the parental yeasts regarding, for example, the assimilation of carbon sources and tolerance to ethanol. A brewing trial with the fusant was carried out using a 100-l pilot-scale plant. The fusant fermented wort more rapidly than the parental brewer's yeast. However, the sedimentation capacity of the fusant was relatively low. The beer brewed using the fusant contained more ethanol and esters compared to that brewed using the parental brewer's yeast. The fusant also obtained osmotolerance in the fermentation of maltose and fermented high-gravity wort well.     

保加利亚乳酸杆菌与整肠生菌进行原生质体融合的研究

利用有芽孢的整肠生菌株（Bacillus licheniformis）与无芽孢的保加利亚乳酸杆菌（Lactobacillus bulgaricus）作为亲本．进行原生质体融合，并对融合子的产乳酸、丁二醇能力以及酸奶发酵能力进行了研究。结果表明，在MM培养基内，融合子乳酸产量为10．104mg／L、丁二醇产量为46．13mg／L，乳酸和丁二醇产量高于两亲本菌株。在CM培养基内，融合子乳酸产量为12．85mg／L其产量高于两亲本；丁二醇产量为69．19mg／L其产量高于保加利亚酸杆菌。在细胞形态上，融合子也与亲本存在一定的差异。在酸奶发酵的过程中，乳酸产量和pH值与亲本保加利亚乳酸杆菌发酵的结果一致。经过10次传代培养后，其遗传稳定性保持在99％以上。