Ⅲ型登革病毒在C6/36及Vero细胞中复制对其毒力的影响

目的探讨Ⅲ型登革病毒(dengue virus,DENV)在C6/36和Vero细胞中复制对其毒力的影响。方法将DV3-1及DV3-2两株Ⅲ型DENV在C6/36细胞上接种传代培养,待其毒力稳定再接种至Vero细胞连续传代培养。用Ⅲ型DENV标准质粒检测不同代次病毒拷贝数,PCR扩增获得传代毒种全长基因序列,并与原代病毒基因序列进行比对。结果 DV3-1在C6/36细胞上传代至第17代次(P17-C6/36)时毒力保持稳定,DV3-2在盲传过程中均未见明显的细胞病变;将DV3-1和DV3-2第17代次病毒在Vero细胞上继续传代,DV3-1传至第10代次(P10-Vero)CPE为40%,DV3-2传至第4代次CPE达30%。DV3-1在P17-C6/36时具有较高的病毒拷贝数,在P0(原代病毒)及P10-Vero时病毒拷贝数偏低。与P0比较,P17-C6/36及P10-Vero全长碱基共16处发生突变,导致12个氨基酸的非同义突变,其中P0和P10-Vero在第5 826、6 251、7 907位点碱基相同,P17-C6/36相应的氨基酸位点(第1 942、2 084、2 636位点)均发生非同义突变。结论传代细胞更换可对Ⅲ型DENV的毒力造成影响,多次传代及更换细胞传代后仍可能发生回复突变。本研究为后续DENV减毒策略的研究提供了实验依据。     

Ⅱ型登革病毒前膜抗体对该病毒在THP-1细胞中复制能力的影响

目的探讨Ⅱ型登革病毒(dengue virusⅡ,DENVⅡ)前膜(presynaptic membrane,prM)抗体对DENVⅡ在THP-1细胞中复制能力的影响。方法采用不同稀释度(1/4~1/16 384)的DENVⅡanti-pr M单克隆抗体分别与不同MOI的DENVⅡ(MOI分别为3、0.75及0.19)复合感染THP-1细胞。建立DENVⅡ荧光定量PCR检测标准曲线,检测THP-1细胞培养上清液的病毒拷贝数。结果 DENVⅡ按MOI=3感染THP-1细胞,当prM稀释度为1/16和1/16 384时诱发THP-1细胞产生病毒的载量较高,prM稀释度为1/64和1/256时抑制病毒生长;DENVⅡ按MOI=0.75感染THP-1细胞,当prM稀释度1/16时可诱发更高浓度病毒载量;DENVⅡ按MOI=0.19感染THP-1细胞时,不会诱导产生高浓度的病毒载量。结论中浓度pr M抗体可抑制DENVⅡ在THP-1细胞中的复制能力,而高及低浓度prM抗体可促进DENVⅡ在THP-1细胞中的复制能力。     

BHK-21细胞悬浮培养狂犬病病毒(rCVS-11-dG株)工艺的建立及病毒免疫原性评价

目的 优化生物反应器悬浮批次培养狂犬病病毒(rCVS-11-dG株)工艺,制备灭活免疫原,并检测其免疫原性.方法 摇瓶培养BHK-21细胞,优化rCVS-11-dG株病毒培养温度、接种MOI及接毒时初始细胞密度等病毒培养条件,使病毒与细胞相互适应,提高病毒滴度,为生物反应器培养病毒提供参数.在5L体积的生物反应器中,低...     

无血清微载体培养Vero细胞和H1N1流感病毒条件的优化

目的优化无血清微载体培养Vero细胞和H1N1流感病毒的条件,为Vero细胞流感疫苗的开发奠定基础。方法在搅拌瓶中采用不同的细胞接种量和不同的微载体浓度培养Vero细胞,制备流感病毒,并检测不同的pH值、TPCK-胰酶含量、病毒接种量及病毒收获时间对流感病毒血凝滴度的影响。结果以(1.0～5.0)×105个/ml的Vero细胞接种至浓度为3mg/ml的无血清微载体中,病毒培养液pH值为7.2～7.4,TPCK-胰酶含量为1.0μg/ml,病毒接种量为1.0MOI,并在感染48h后补加TPCK-胰酶,培养72h后收获上清与细胞内病毒,血凝滴度可达1:512。结论已获得了无血清微载体培养Vero细胞和H1N1流感病毒的适宜条件,为应用生物反应器大规模制备流感病毒奠定了基础。     

细胞外调节蛋白激酶1/2磷酸化对嗜心性柯萨奇病毒B3型感染心肌细胞H9C2能力的影响

目的探讨细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases 1/2,ERK1/2)磷酸化对嗜心性柯萨奇病毒B3型(coxsackie virus B3,CVB3)感染心肌细胞H9C2能力的影响。方法通过检测CVB3对心肌细胞H9C2的半数感染量(TCID_(50))确定病毒的作用浓度,用该浓度CVB3分别作用心肌细胞H9C2 0、20、40和60 min,检测细胞中ERK1/2的磷酸化情况。将ERK1/2的磷酸化激动剂Ceramide C6作用于H9C2细胞,同时加入CVB3,检测TCID_(50)。结果确定CVB3对H9C2细胞的TCID_(50)为10~(-7.1),该浓度CVB3作用心肌细胞H9C2 40和60 min时,细胞中磷酸化ERK1/2表达量最低,明显低于0 min(P0.01)。加入激动剂Ceramide C6后,CVB3感染心肌细胞H9C2的TCID_(50)为10~(-6.47)。结论 ERK1/2磷酸化可抑制CVB3感染心肌细胞H9C2的能力,本实验为病毒性心肌炎发病机制的研究奠定了基础。     

黄芪多糖对脂多糖诱导的急性肺损伤大鼠的保护作用及肿瘤坏死因子-α、细胞间黏附分子-1、白细胞介素-6表达的影响

目的探讨黄芪多糖(astragalus polysaccharide,APS)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的急性肺损伤(acute lung injury,ALI)大鼠的保护作用及血清和肺组织中肿瘤坏死因子-α(tumor narcosis factor-α,TNF-α)、细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)表达的影响。方法将Wistar大鼠随机分为对照组、ALI模型组和APS干预组,每组30只,ALI模型组和APS干预组均经腹腔注射LPS 5 mg/kg;对照组经腹腔注射生理盐水5 ml/kg。造模6 h后,APS干预组经尾静脉注射APS 20 mg/kg,对照组和ALI模型组给予等量生理盐水。分别于造模后0、6、12、24和48 h每组各取5只大鼠,计算肺组织湿重/干重比值(W/D),HE染色观察肺组织病理学形态,ELISA法检测血清中细胞因子TNF-α、ICAM-1和IL-6的水平;造模后24 h,每组各取5只大鼠,Western blot法检测肺组织中TNF-α、ICAM-1和IL-6蛋白的表达水平。结果造模后12、24和48 h,对照组W/D比值明显低于ALI模型组和APS干预组(P0.01);APS干预组W/D比值在各时点均明显低于ALI模型组(P0.01)。造模后12 h,与对照组比较,ALI模型组和APS干预组大鼠肺组织均出现较重度的炎性反应,但APS干预组较ALI模型组轻;造模后48 h,ALI模型组大鼠肺组织的炎性反应达高峰,而APS干预组逐渐消退。对照组大鼠血清TNF-α、ICAM-1和IL-6均维持在较低水平;ALI模型组和APS干预组大鼠血清TNF-α、ICAM-1和IL-6水平在造模后12 h开始明显升高,而APS干预组在12 h后各时点浓度均低于ALI模型组,且同一时点与ALI模型组比较,差异均有统计学意义(P0.01)。造模后24 h,ALI模型组和APS干预组大鼠肺组织中TNF-α、ICAM-1、IL-6蛋白的表达水平均较对照组明显上升(P0.01);而APS干预组与ALI模型组相比,明显下降(P0.01)。结论 APS能有效减轻LPS所致的ALI,此作用与抑制TNF-α、ICAM-1和IL-6的过度表达,减轻炎症级联反应有关。     

HPLC法测定复方利血平片中氢氯噻嗪、硫酸双肼屈嗪、维生素B1和维生素B6的含量

采用HPLC法测定复方利血平片中氢氯噻嗪、硫酸双肼屈嗪、维生素B1和维生素B6的含量。Kromasil C-18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),检测波长210 nm,以0.2%己烷磺酸钠(用冰醋酸调节pH=3.5)-甲醇-乙腈(75∶20∶5)为流动相,流速1.0 mL/min,进样量20μL,柱温30℃。结果表明,氢氯噻嗪的线性范围为49.6～496.0μg/mL(R2=0.999 4),精密度RSD为0.12%(n=6),重复性RSD为0.45%(n=6),平均回收率为99.74%(RSD=0.78%,n=9);硫酸双肼屈嗪的线性范围为16.8～336.0μg/mL(R2=0.999 3),精密度RSD为0.06%(n=6),重复性RSD为0.21%(n=6),平均回收率为99.83%(RSD=0.08%,n=9);维生素B1的线性范围为4.0～80.0μg/mL(R2=0.998 7),精密度RSD为0.56%(n=6),重复性RSD为0.96%(n=6),平均回收率为99.02%(RSD=1.13%,n=9);维生素B6的线性范围为4.0～80.0μg/mL(R2=0.999 1),精密度RSD为0.23%(n=6),重复性RSD为0.78%(n=6),平均回收率为99.56%(RSD=0.48%,n=9)。此法分离度好,峰形对称,分析周期短,重复性好,简单易行,可同时测定复方利血平片中氢氯噻嗪、硫酸双肼屈嗪、维生素B1和维生素B6的含量。     

生物反应器培养Vero细胞和H1N1流感病毒

目的建立利用生物反应器制备Vero细胞流感H1N1全病毒灭活疫苗的新工艺。方法利用Vero细胞作为流感病毒增殖的细胞基质,分别以无血清培养液Pro VERO和含血清DMEM培养液,利用5 g/L微载体cytodex-1在3 L硅化生物反应器中进行培养,培养温度(37±0.5)℃,溶解氧(50±20)%,p H 7.2±0.2,搅拌速度(50±20)r/min,待细胞在微载体上长成单层后,以0.1 MOI接种流感病毒Vero细胞高产适应株H1N1/JD/Va,将收获的病毒液经Sepharose 4FF和Capto Q两级纯化,灭活后制备疫苗原液及成品,按照《中国药典》三部(2015版)方法对其进行检定。结果使用无血清细胞培养液培养Vero细胞24 h贴壁率约83%,含血清细胞培养液培养24 h贴壁率为112%;灌流培养方式培养至第6天时,细胞均长至单层,无血清细胞培养液最终细胞数达到(133.4±2.0)×10~4个/m L,含血清细胞培养液最终细胞数达到(353.4±5.9)×10~4个/m L。无血清病毒维持液培养,第66 h收获病毒液血凝效价为388,单位细胞产毒比例为2.9;含血清病毒维持液培养,第66 h收获病毒液血凝效价为891,单位细胞产毒比例为2.5。用含血清细胞培养液培养Vero细胞接种病毒,收获病毒液制备的疫苗原液及成品经检测,各项指标均符合《中国药典》三部(2015版)相关要求。结论建立了3 L生物反应器含血清细胞培养液培养Vero细胞和H1N1流感病毒的新工艺,为进一步放大生产规模奠定了基础。     

用无血清适应的Vero细胞培养H5N1型流感病毒条件的优化

目的优化无血清适应的Vero细胞(SFM-Vero细胞)培养H5N1型流感病毒的条件。方法将H5N1型流感病毒接种于SFM-Vero细胞,于免疫荧光显微镜下观察病毒感染情况。对病毒无血清培养条件MOI(0.05、0.10、0.15、0.20)、细胞培养时间(12、24、36、48 h)、培养液基础培养基(DMEM/F12、M199、RPMI1640及MEM:DMEM/F12混合液)、培养温度(33、33.5、34、34.5、35和37℃)、收获时间(24、36、48、60和72 h)、培养液p H值(6.8、7.1、7.4、7.7、8.0和8.3)和TPCK胰酶浓度(0.5、1.0、1.5μg/ml)进行优化,并检测最佳条件无血清培养的H5N1型流感病毒的血凝效价及形态。结果 H5N1型流感病毒对SFM-Vero细胞具有感染性。最佳无血清培养条件为:MOI=0.1和0.15,细胞培养时间36 h,以DMEM/F12为基础培养基,病毒培养温度33.5和34.5℃,病毒收获时间60 h,培养液p H 7.7,TPCK胰酶浓度为1.0μg/ml。最佳条件无血清培养的H5N1型流感病毒的血凝效价为1∶512,电镜下观察病毒形态完整。结论确定了H5N1型流感病毒对SFM-Vero细胞具有感染性,并优化了SFMVero细胞培养流感病毒的适宜条件,为更具有生物安全性流感疫苗的研发奠定了基础。     

水痘-带状疱疹病毒在Vero细胞中的传代培养及抗水痘血清的制备

目的在Vero细胞中传代培养水痘-带状疱疹病毒(varicella-herpes zoster virus,VZV),并制备抗水痘血清。方法将VZV(北京株VZV84-2)在Vero细胞中传代培养,待细胞病变(CPE)稳定后制备抗原,分别免疫家兔(分为1组和2组)和豚鼠(仅1组),均免疫4次,每次间隔14 d,其中除家兔1组第3、4次免疫经耳静脉注射不含佐剂的免疫原外,其他均经背部皮下免疫含弗氏完全佐剂的免疫原。于末次免疫后2周经颈动脉采血,分离血清,进行无菌试验、中和抗体效价检测及特异性干扰试验。结果 VZV(北京株84-2)在Vero细胞中传至第5代时,CPE可达80%~90%,传至第10代时,CPE稳定。用含兔及豚鼠血清培养基制备的免疫原的蛋白含量分别为2.1和1.7 mg/ml。抗血清无菌检测合格;家兔1组、豚鼠组、家兔2组的血清中和抗体效价分别为1∶128、1∶256、1∶64;抗水痘血清对麻疹(沪191株)、腮腺炎(S79株)、风疹(BRDⅡ株)疫苗的滴定无干扰。结论成功将VZV在Vero细胞中进行传代培养,并制备了抗水痘血清,但效价较低,有待进一步提高。     

乙型脑炎病毒在Vero细胞上的传代适应性及毒种库的建立

目的分析乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)在Vero细胞上的传代适应性,进行培养条件及接种方式的优化,并建立毒种库。方法将JEV P3株在Vero细胞上连续适应性传至20代(P3V1~P3V20),采用小鼠法检测P3V2、P3V3、P3V4的病毒滴度。优化JEV静置培养条件(维持液p H值、培养温度、MOI)及接种方式(单层接种法、混合接种法),并进行培养规模的放大。采用RT-PCR法扩增P3V0、P3V1、P3V5、P3V10、P3V15及P3V20代病毒的E基因片段,并进行测序分析。建立JEV毒种库,并进行全面检定。结果 JEV在Vero细胞上传代适应性良好,各代次病毒滴度均大于8.5 lg LD50/ml。最适培养条件为:病毒维持液p H值为7.6,培养温度为34℃,病毒MOI为0.1;最佳接种方式为:单层接种法。在不同培养规模时,病毒滴度变化较小,且均维持在较高水平。P3V0、P3V1、P3V5、P3V10、P3V15及P3V20各代次间E基因片段同源性为100%,传代稳定性良好。建立的毒种库的鉴别试验、无菌检查、支原体检查、病毒滴定、病毒外源因子检查及免疫原性检查结果均符合《中国药典》三部(2010版)相关要求。结论已完成JEV在Vero细胞上的适应性传代培养,并成功建立毒种库,为实现以Vero细胞为基质的JEV疫苗的研发奠定了基础。     

流感病毒H5N1在Vero细胞上培养条件的优化

目的优化流感病毒H5N1在Vero细胞上的培养条件。方法在Vero细胞上,用不同维持液[M199、M199+表皮细胞生长因子(epidermal growth factor,EGF)、MEM、MEM+EGF、无血清培养基(serum-free medium,SFM)]及含不同胰酶浓度(3、5、7μg/ml)的M199维持液培养流感病毒H5N1,收获培养上清,检测血凝滴度,确定最适维持液及胰酶浓度;用流感病毒H5N1感染细胞上清于冻融前后分别感染Vero细胞,连续传代,收获培养上清,检测血凝滴度,比较冻融对病毒增殖的影响。将流感病毒H5N1以0.01 MOI感染对数生长期Vero细胞,以优化后的培养条件培养,收获培养上清,检测血凝滴度及病毒感染性滴度,确定H5N1在Vero细胞上连续传代的稳定性。结果当维持液培养基为SFM、胰酶浓度为5μg/ml时,利用病毒收获液直接感染2代后,再将维持液培养基更换为M199时,血凝滴度最高。利用优化后的培养条件在Vero细胞上连续传代培养流感病毒H5N1,血凝滴度和感染性病毒滴度均较稳定。结论优化后的培养条件在Vero细胞上可连续稳定传代培养流感病毒H5N1,为建立工作种子批,用于大流感疫苗的制备奠定了基础。     

无血清培养基培养Vero细胞制备狂犬病病毒工艺的建立

目的建立无血清培养基(virus production-serum-free medium,VP-SFM)培养Vero细胞制备狂犬病病毒CTN-1V株的工艺。方法分别采用VP-SFM和含5%牛血清DMEM于方瓶中培养Vero细胞制备狂犬病病毒CTN-1V株,比较无血清培养基培养不同代次Vero细胞间及无血清与含血清培养基培养Vero细胞间制备的狂犬病病毒滴度及效力。将2 g/L微载体cytodex-1加至250 ml spinner flask中,加入Vero细胞,37℃培养3 d,按MOI=0.02接种狂犬病病毒CTN-1V株,检测病毒收获液的病毒滴度及效力,每天显微镜下观察细胞生长情况,计算细胞比生长速率。结果无血清培养基培养不同代次Vero细胞制备狂犬病病毒的滴度和效力差异无统计学意义(P0.05);无血清和含血清培养基培养Vero细胞制备狂犬病病毒的滴度差异无统计学意义(P0.05),但无血清培养基培养Vero细胞制备狂犬病病毒效力明显高于含血清的培养基(P0.05)。搅拌瓶微载体系统培养Vero细胞制备狂犬病病毒,细胞贴壁均匀,生长良好,收获病毒液的平均病毒滴度为6.50 lg FFU/ml,平均病毒效力为6.77 IU/ml。结论初步建立了微载体系统无血清培养Vero细胞制备狂犬病病毒的工艺,为无血清规模化制备狂犬病疫苗奠定了基础。     

Vero细胞无血清培养基的筛选及其培养流感病毒H5N1条件的优化

目的筛选适宜Vero细胞培养的无血清培养基,并优化其培养流感病毒H5N1的条件。方法取VP-SFM培养的Vero细胞(SFM-Vero),以增殖速率为指标,筛选无血清培养基[VP-SFM、EX-CELL~(TM) VERO、Virus Pro ~(TM) VERO、自制无血清培养基1(SFM-1)和2(SFM-2)];采用中心组合实验(Box-Behnken)优化SFM-Vero培养流感病毒H5N1的pH、TPCK-Trypsin浓度和病毒接种MOI。结果 Vero细胞在VP-SFM和自制SFM-1培养基中生长情况好于其他无血清培养基;H5N1病毒株能够感染无血清适应的Vero细胞;SFM-Vero培养流感病毒H5N1较优条件为:p H 7.64,TPCK-Trypsin浓度0.68μg/ml,MOI 0.01。在该条件下培养的流感病毒HA滴度可达768 HAU/50μl,为正常培养基培养的Vero细胞的2.33倍。结论筛选出适宜Vero细胞生长的无血清培养基,优化了流感病毒H5N1 Vero细胞适应株无血清培养的条件。     

ANP and BNP Exert Anti-Inflammatory Action via NPR-1/cGMP Axis by Interfering with Canonical,Non-Canonical,and Alternative Routes of Inflammasome Activation in Human THP1 Cells

Dysregulated inflammasome activation and interleukin (IL)-1β production are associated with several inflammatory disorders. Three different routes can lead to inflammasome activation: a canonical two-step, a non-canonical Caspase-4/5- and Gasdermin D-dependent, and an alternative Caspase-8-mediated pathway. Natriuretic Peptides (NPs), Atrial Natriuretic Peptide (ANP) and B-type Natriuretic Peptide (BNP), binding to Natriuretic Peptide Receptor-1 (NPR-1), signal by increasing cGMP (cyclic guanosine monophosphate) levels that, in turn, stimulate cGMP-dependent protein kinase-I (PKG-I). We previously demonstrated that, by counteracting inflammasome activation, NPs inhibit IL-1β secretion. Here we aimed to decipher the molecular mechanism underlying NPs effects on THP-1 cells stimulated with lipopolysaccharide (LPS) + ATP. Involvement of cGMP and PKG-I were assessed pre-treating THP-1 cells with the membrane-permeable analogue, 8-Br-cGMP, and the specific inhibitor KT-5823, respectively. We found that NPs, by activating NPR-1/cGMP/PKG-I axis, lead to phosphorylation of NLRP3 at Ser295 and to inflammasome platform disassembly. Moreover, by increasing intracellular cGMP levels and activating phosphodiesterases, NPs interfere with both Gasdermin D and Caspase-8 cleavage, indicating that they disturb non-canonical and alternative routes of inflammasome activation. These results showed that ANP and BNP anti-inflammatory and immunomodulatory actions may involve the inhibition of all the known routes of inflammasome activation. Thus, NPs might be proposed for the treatment of the plethora of diseases caused by a dysregulated inflammasome activation.     

Crystallization and phase evolution in novel (Gd1/6Tb1/6Dy1/6Tm1/6Yb1/6Lu1/6)2Si2O7 environmental barrier coating

Design of multiple rare-earth (RE) principal elements is a practical strategy to optimize key property of RE disilicate environmental barrier coating (EBC). However, multi-RE component in the feedstocks may also introduce critical fabrication problems due to the different evaporating and crystallizing behaviors of the EBC containing various RE composition. We herein report the preparation of a novel multi-RE disilicate (Gd_1/6Tb_1/6Dy_1/6Tm_1/6Yb_1/6Lu_1/6)₂Si₂O₇ EBC by atmospheric plasma spraying (APS). The crystallization behavior of the as-deposited coating annealed at 1100°C–1300°C with different durations (5 and 20 h) in air and argon atmospheres were investigated through comprehensive characterization techniques. RE disilicate, RE mono-silicate, and RE apatite were detected in the as-sprayed coatings, and mono-silicate and apatite transform to RE₂Si₂O₇ with the increment of temperature and extension of annealing duration. Furthermore, the contribution of multiple RE to the formation of apatite phase is discussed. The results provide a fundamental understanding and may guide the controllable preparation of multi-RE disilicate EBC via APS method.     

Room temperature and low temperature toughness improvement in SAN/ASA blends by blending with CPE,HNBR, and BR

Styrene‐acrylonitrile copolymer (SAN)/acrylonitrile‐styrene‐acrylate terpolymer (ASA) blends (75/25, wt/wt) was toughened by blending with impact modifiers including chlorinated polyethylene (CPE), hydrogenated nitrile butadiene rubber (HNBR), and butadiene rubber (BR) and the impact property was tested at four temperatures (–30, ?15, 0, and 25 °C). The combination of CPE and HNBR was imported to toughen the SAN/ASA blends, indicating that CPE and HNBR had similar toughening effect at room temperature but HNBR exhibited a better performance at low temperature. When a little HNBR was substituted by BR, the impact strength improved dramatically with the total content of impact modifiers keeping at 30 phr. After 15 phr CPE, 10 phr HNBR and 5 phr BR were employed into blends together, the impact strength reached to a peak of 14 kJ/m² at ?30 °C while the impact strength of the blends individually toughened by 30 phr CPE or 30 phr HNBR was 5 or 12 kJ/m², respectively. The toughening mechanism showed that the low glass‐transition temperature (–108 °C) of BR and the compatibilization between BR and matrix accounted for the improvement of toughness. Simultaneously, scanning electron microscopy, dynamic mechanical analysis, flexural and tensile properties, heat distortion temperature, and Fourier transform infrared spectroscopy were measured. © 2017 Wiley Periodicals, Inc. J. Appl. Polym. Sci. 2017 , 134 , 45364.