在无血清无蛋白培养基中培养Vero细胞

目的开发在无血清无蛋白培养基(PF)中培养Vero细胞的技术。方法在DMEM/F12培养基中添加酵母提取物和大豆水解物,配制成无血清无蛋白培养基。使用配制好的无血清无蛋白培养基,分别在玻璃、聚乙烯醇缩丁醛(PVB)和聚苯乙烯(PS-TC)培养面上培养Vero细胞,观察细胞生长情况,并绘制细胞生长曲线,以含血清培养基BM为对照。结果与BM培养基比较,在玻璃培养面上,PF培养基不支持Vero细胞生长和分裂;在PVB培养面上,PF培养基支持Vero细胞生长,但不支持分裂;在PS-TC培养面上,PF培养基支持Vero细胞的生长和分裂。结论在PS-TC培养面上,PF培养基适合培养Vero细胞。     

Sabin株脊髓灰质炎病毒在Vero细胞上的传代稳定性

目的探讨Sabin株脊髓灰质炎病毒在Vero细胞上的传代稳定性。方法用Sabin株脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型分别以0.01、0.1和1MOI接种Vero细胞,进行传代培养,共传13代。采用微量细胞病变法测定病毒滴度;双抗体夹心法测定D抗原含量;免疫Wister大鼠,采用微量中和试验测定病毒的免疫原性。结果Sabin株脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型在Vero细胞上连续传13代,病毒滴度基本稳定;D抗原含量呈下降趋势;免疫原性下降迅速。结论用Sabin株脊髓灰质炎病毒制备灭活疫苗,在Vero细胞上传代的代次越低越好。     

无血清培养基培养Vero细胞制备狂犬病病毒工艺的建立

目的建立无血清培养基(virus production-serum-free medium,VP-SFM)培养Vero细胞制备狂犬病病毒CTN-1V株的工艺。方法分别采用VP-SFM和含5%牛血清DMEM于方瓶中培养Vero细胞制备狂犬病病毒CTN-1V株,比较无血清培养基培养不同代次Vero细胞间及无血清与含血清培养基培养Vero细胞间制备的狂犬病病毒滴度及效力。将2 g/L微载体cytodex-1加至250 ml spinner flask中,加入Vero细胞,37℃培养3 d,按MOI=0.02接种狂犬病病毒CTN-1V株,检测病毒收获液的病毒滴度及效力,每天显微镜下观察细胞生长情况,计算细胞比生长速率。结果无血清培养基培养不同代次Vero细胞制备狂犬病病毒的滴度和效力差异无统计学意义(P0.05);无血清和含血清培养基培养Vero细胞制备狂犬病病毒的滴度差异无统计学意义(P0.05),但无血清培养基培养Vero细胞制备狂犬病病毒效力明显高于含血清的培养基(P0.05)。搅拌瓶微载体系统培养Vero细胞制备狂犬病病毒,细胞贴壁均匀,生长良好,收获病毒液的平均病毒滴度为6.50 lg FFU/ml,平均病毒效力为6.77 IU/ml。结论初步建立了微载体系统无血清培养Vero细胞制备狂犬病病毒的工艺,为无血清规模化制备狂犬病疫苗奠定了基础。     

低血清培养Vero细胞和流感病毒条件的优化

目的优化低血清培养Vero细胞和流感病毒的条件,为开发Vero细胞流感疫苗奠定基础。方法分别在DMEM/F12和SLM-199培养基中,添加不同浓度的血清,培养Vero细胞,观察细胞连续传代的生长状态;接种流感病毒后,检测病毒培养液不同pH值、不同浓度TPCK-胰酶和病毒不同接种量对病毒血凝效价的影响。结果用SLM-199在1.0%血清浓度下培养的Vero细胞接种流感病毒血凝效价较高,病毒培养液pH值为7.2,TPCK-胰酶含量为1.0μg/ml,接种病毒MOI为1.0时,72h收获的病毒血凝效价最高。结论已筛选出低血清培养Vero细胞和流感病毒的适宜条件。     

Vero细胞无血清培养基的筛选及其培养流感病毒H5N1条件的优化

目的筛选适宜Vero细胞培养的无血清培养基,并优化其培养流感病毒H5N1的条件。方法取VP-SFM培养的Vero细胞(SFM-Vero),以增殖速率为指标,筛选无血清培养基[VP-SFM、EX-CELL~(TM) VERO、Virus Pro ~(TM) VERO、自制无血清培养基1(SFM-1)和2(SFM-2)];采用中心组合实验(Box-Behnken)优化SFM-Vero培养流感病毒H5N1的pH、TPCK-Trypsin浓度和病毒接种MOI。结果 Vero细胞在VP-SFM和自制SFM-1培养基中生长情况好于其他无血清培养基;H5N1病毒株能够感染无血清适应的Vero细胞;SFM-Vero培养流感病毒H5N1较优条件为:p H 7.64,TPCK-Trypsin浓度0.68μg/ml,MOI 0.01。在该条件下培养的流感病毒HA滴度可达768 HAU/50μl,为正常培养基培养的Vero细胞的2.33倍。结论筛选出适宜Vero细胞生长的无血清培养基,优化了流感病毒H5N1 Vero细胞适应株无血清培养的条件。     

无血清悬浮培养MDCK-siat7e细胞的传代稳定性

目的 研究连续传代的犬肾上皮(Madin-Darby canine kidney,MDCK)细胞MDCK-siat7e的传代稳定性.方法 复苏工作细胞库,连续传45代,比较不同代次(0、7、17、28、45代)MDCK-siat7e细胞生长4d的形态、0～9d的生长曲线及比生长速率(μ)、葡萄糖比消耗率[Qi(Gluc...     

轮状病毒P[2]G3株在Vero细胞上的传代适应性

目的研究轮状病毒P[2]G3株在Vero细胞上的传代适应性,以确定其在Vero细胞上培养的最适条件。方法将P[2]G3株轮状病毒分别以0.01、0.05和0.1MOI接种于Vero细胞,观察细胞病变(CPE)情况,并检测病毒的感染性滴度,确定在Vero细胞上接种病毒的最适MOI。同时观察连续传15代后,各代次病毒的滴度及其基因核酸带型的变化。结果MOI为0.05时,接种病毒后出现CPE及收获时间均较早,病毒的感染性滴度最高,确定接种病毒的最适MOI为0.05。连续传15代,病毒滴度随传代次数的增加而上升,各代次病毒的基因组核酸带型基本一致,且与原代病毒相符。结论轮状病毒P[2]G3株经适应性培养后,可在Vero细胞上稳定传代15代。     

生物反应器无血清悬浮培养MDCK-siat7e细胞工艺的建立

目的建立无血清无蛋白无动物源性培养基BD001悬浮培养MDCK-siat7e细胞的工艺,为MDCK-siat7e细胞的生物反应器规模化培养及病毒性疫苗的研制提供依据。方法采用BD001驯化MDCK-siat7e细胞,建立无血清无蛋白无动物源性MDCK-siat7e细胞库,对细胞库进行常规检定,观察MDCK-siat7e细胞的生长形态;比较不同起始接种密度(4.0×10~5、8.0×10~5、1.6×10~6 cells/ml)悬浮培养,MDCK-siat7e细胞达到平台期的时间、平台期细胞密度及活率;比较不同规模生物反应器(3、15、60 L)无血清无蛋白无动物源性培养MDCK-siat7e细胞对数生长期的比生长速率(μ)、分裂次数(Cd)、葡萄糖比消耗速率(q_(gluc))、乳酸对葡萄糖的转化率(Y_(lac)/g_(luc)),观察细胞的生长和代谢情况。结果建立的无血清无蛋白无动物源性MDCK-siat7e细胞库复苏后细胞平均活率为(96.20±2.95)%。MDCK-siat7e细胞在BD001培养基中复苏传代后生长状态良好,经过24 h潜伏期后,进入对数生长期,第6天进入平台期,第8天达最大细胞密度(6.2×10~6 cells/ml),维持至第12天细胞密度和活率开始下降,进入衰亡期。MDCK-siat7e细胞在无血清培养基中生长良好;不同起始接种密度MDCK-siat7e细胞达到平台期的时间差异有统计学意义(P0.05),平台期细胞密度及活率差异无统计学意义(P0.05);不同规模生物反应器培养的MDCK-siat7e细胞的μ、Cd、q_(gluc)、Y_(lac/gluc)差异均无统计学意义(P0.05),细胞生长代谢良好。结论建立了生物反应器无血清悬浮培养MDCK-siat7e细胞的工艺,为病毒性疫苗生产中采用无血清无蛋白、无动物源性培养基,生物反应器规模化培养MDCK-siat7e细胞提供了一定的实验依据。     

Vero细胞和流感病毒在无血清条件下的微载体培养

目的探索Vero细胞和流感病毒在无血清条件下的微载体培养条件。方法在搅拌瓶中,选择合适的微载体,在无血清条件下培养Vero细胞和流感病毒。观察Vero细胞的生长状况,并检测流感病毒的血凝滴度。结果Vero细胞在Cytodex 3上生长最好,每个微载体上接种10个细胞为最佳接种浓度,以MOI=0.005和0.010 CCID50/细胞接种H1N1流感病毒后,在72h时,培养上清病毒血凝滴度达到最高。结论无血清条件下,Vero细胞在Cytodex 3上生长良好,流感病毒能在Vero细胞上成功培养。     

Vero细胞无血清培养基的优化

目的通过试验设计(design of experiments,DOE)方法和统计学分析快速优化Vero细胞无血清培养基。方法以DMEM/F12为基础培养基,通过Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验和Box-Behnken试验考察7种添加物胰岛素、人转铁蛋白、透明质酸、牛血清白蛋白、亚硒酸钠、表皮生长因子和高密度脂蛋白对Vero细胞生长的影响,以CCK-8测定的吸光度值(A490)为响应值,优化Vero细胞无血清培养基。用最优化的因子浓度配制的Vero细胞无血清培养基培养Vero细胞,对优化结果进行验证。结果通过Plackett-Burman试验筛选出胰岛素、牛血清白蛋白和人转铁蛋白对Vero细胞生长影响较大;采用最陡爬坡试验和Box-Behnken试验进一步优化,Design-Expert 8.06软件进行回归分析,得到胰岛素、人转铁蛋白和牛血清白蛋白的最佳浓度分别为5.625μg/ml、14.034μg/ml和3.92 mg/ml,在此优化条件下的A490值为2.3,较基础培养基提高了3.41倍。用最优的胰岛素、人转铁蛋白和牛血清白蛋白浓度配制的Vero细胞无血清培养基培养Vero细胞的A490值为2.148,为预测值的93.4%,符合度较高。结论应用DOE方法快速高效地优化了Vero细胞无血清培养基,为无血清培养基的研制奠定了基础。     

非洲绿猴肾细胞(Vero)无血清细胞库的建立

目的建立Vero细胞无血清细胞库。方法采用序贯适应和直接适应方法,将Vero细胞从有血清培养适应到无血清培养,建立Vero细胞无血清细胞主库和工作库,采用STR图谱并结合染色体计数对Vero细胞进行鉴别,并对Vero细胞无血清细胞库进行致瘤性和病毒外源因子检定。结果两种方法均能使Vero细胞适应到无血清培养,其中直接适应法可大大缩短适应代次,因此选择其作为建立Vero细胞无血清细胞库的方法。Vero细胞无血清主库和工作库的STR图谱与日本细胞库公布的Vero细胞STR图谱完全一致,Vero细胞库无外源因子污染,无致瘤性。结论Vero细胞无血清细胞库可用作生物制品生产用候选细胞基质。     

人牙髓干细胞的无血清培养及其生物学特性

目的使用无血清培养基体外分离培养人牙髓干细胞(dental pulp stem cell,DPSC),并分析其生物学特性。方法分别用有血清培养体系(SCM:含10%胎牛血清的DMEM)和无血清培养体系(SFM:化学成分明确的、无动物源成分的市售培养基Mesen Cult-XF medium)培养人DPSC,倒置显微镜下观察细胞生长、增殖情况及形态特征。细胞传至5代后,检测两种培养基培养的细胞的增殖能力、免疫表型和分化能力。结果 SFM与SCM培养的细胞形态相似,但SFM培养的细胞外形显得纤细、细长,立体感更强;SFM与SCM培养的人DPSC有相似的增殖能力、细胞表型和分化能力,且SFM培养的人DPSC成骨和成软骨分化能力更强。结论本实验表明,SFM能够在体外培养扩增人DPSC,并维持其干细胞特性,包括自我更新能力(集落形成能力)和多向分化潜能,可取代FBS用于细胞治疗及生物医学研究。     

肠道病毒71型在Vero细胞中培养条件的优化

目的优化肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)在Vero细胞中的培养条件。方法分别采用吸附法和直接接种法将EV71接种于Vero细胞中进行增殖,检测病毒滴度;选择最佳接种方法接种病毒,考察血清浓度、收毒方式、病毒接种量(MOI)和收毒时间对病毒滴度的影响。结果将MOI为0.02～0.2的病毒直接接种于不含血清的培养基中,培养60 h,胞外收毒,可获得较高的病毒滴度。结论优化了EV71在Vero细胞中的培养条件,为EV71的大规模培养及其疫苗研发奠定了基础。     

沪191麻疹病毒疫苗株连续传代的基因稳定性

目的研究沪191麻疹病毒疫苗株(S191)在原代鸡胚成纤维细胞中连续传代的基因稳定性,为评估和控制麻疹疫苗的免疫原性及安全性提供依据。方法取S191的22代冻干主种子批在SPF原代鸡胚成纤维细胞上连续传代获得的23、26(用于生产的疫苗代次)、29、31和33代病毒液,提取病毒RNA,RT-PCR扩增后,进行全序列测定,并对病毒关键的保护性抗原进行核苷酸和氨基酸序列分析。结果与22代全基因比较,核苷酸序列同源性:26代为99.96%,33代为99.92%;氨基酸序列同源性:26代为99.98%,33代为99.89%。26代疫苗病毒仅M蛋白第123位氨基酸由苏氨酸→赖氨酸,33代病毒有5个氨基酸差异。结论 26代S191麻疹疫苗疫苗病毒的基因结构高度稳定,疫苗可保持主种子病毒的免疫原性和安全性。     

Vero细胞无血清培养制备弓形虫排泄-分泌抗原适宜条件的筛选

目的筛选Vero细胞无血清培养制备弓形虫排泄-分泌抗原(ESA)的适宜条件。方法采用拉丁方析因设计。第一部分:在血清浓度为0.5%、1.0%、2.0%、4.0%的培养基中,共培养Vero细胞与弓形虫速殖子,分别于培养3、6、12、24h时,改为无血清培养基,继续培养至第7天,收集培养上清液,制备ESA,并检测蛋白含量。第二部分:在含1.0%血清培养基中共培养Vero细胞与弓形虫速殖子,分别于培养12、24、48、72h时,改为无血清培养基,继续培养至第7、9、11、13天,收集培养上清液,制备ESA,并检测蛋白含量。结果Vero细胞与弓形虫速殖子在1.0%血清浓度培养基中培养12或24h时,无血清培养基继续培养7d,制备的ESA蛋白含量显著高于其他血清浓度(0.5%、2.0%、4.0%)及含血清培养时间(3、6h)。Vero细胞与弓形虫速殖子在含1.0%血清培养基中共培养12、24h,无血清培养基继续培养至第13天,制备的ESA蛋白含量显著高于其他培养时间(48、72h)和无血清培养基继续培养时间(7、9、11d)。结论培养基的血清浓度以及含血清和无血清培养时间是影响体外制备ESA的重要因素。Vero细胞与弓形虫速殖子在1.0%血清浓度培养基中培养12h,无血清培养基继续培养13d,为制备ESA的适宜条件。     

Vero细胞培养轮状病毒关键条件的优化

目的优化轮状病毒基因重配株(UD株)在Vero细胞上培养的关键条件。方法将轮状病毒基因重配株(UD株)分别以0.01、0.03、0.05和0.10 MOI接种Vero细胞,分别于接种病毒后6、12、24、36、48、72、84、96、108、120 h取样,观察细胞病变(CPE)情况,计算半数感染剂量(CCID50/ml)。以0.05 MOI接种Vero细胞,分别加入含1、2、3、5、8和10μg/ml胰蛋白酶的M199培养液,于接种病毒后12~48 h,观察CPE情况,检测病毒滴度。结果以0.05 MOI接种Vero细胞后,维持液中胰蛋白酶浓度为5μg/ml,培养时间为48 h时,滴度达到最高,为6.5 lgCCID50/ml,且对Vero细胞的分裂增殖无不良影响。结论通过对Vero细胞培养轮状病毒关键条件的优化,获得了提高病毒滴度的有效方法,为使用Vero细胞培养轮状病毒制备轮状病毒减毒活疫苗奠定了基础。     

Vero细胞培养流感病毒的低血清培养基的筛选

目的筛选Vero细胞生长的最适低血清培养基,用于流感病毒的细胞培养。方法分别以MEM、M199、DMEM/F12、DMEM/F12与MEM混合物(1∶1)为基础培养基,添加5%、2%、1%的小牛血清传代培养Vero细胞,通过细胞形态观察、细胞计数及MTT法检测细胞的增殖活力筛选最适基础培养基;将流感病毒接种低血清适应的Vero细胞,检测病毒收获液的血凝效价及残留BSA含量,电子显微镜观察病毒形态。结果以DMEM/F12与MEM混合物(1∶1)为基础培养基,添加2%小牛血清培养的Vero细胞长势良好,细胞数量较多,增殖活力最强。低血清适应的Vero细胞培养的流感病毒血凝效价最高可达1∶512,平均值为1∶384;病毒液中的残留BSA含量约为正常血清培养条件下的1/18;病毒形态完整。结论成功筛选出Vero细胞培养流感病毒的低血清培养基,为更具生物安全性的流感疫苗的研发奠定了基础。     

生物反应器-微载体技术培养Vero细胞制备柯萨奇病毒A组16型

目的利用生物反应器-微载体培养技术培养Vero细胞制备柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CA16)。方法应用生物反应器-微载体培养法进行Vero细胞培养,待细胞长成致密单层时,接种CA16,于37℃培养,每隔24 h观察细胞病变情况,并检测病毒滴度。结果 Vero细胞在微载体上吸附140 h后,绝大部分细胞在微载体上长成致密单层,细胞密度约为12.3×10~5个/ml;接种CA16后72 h,Vero细胞完全病变,几乎全部从微载体上脱落,病毒滴度达最高,约7.75 TCID_(50)/ml。结论成功采用生物反应器-微载体培养技术培养Vero细胞制备了CA16,且病毒滴度较高,为CA16灭活疫苗的研制奠定了基础。