红豆杉醇提物作为流感疫苗佐剂的免疫效果及安全性

目的探讨红豆杉醇提物作为H3N2流感病毒灭活疫苗佐剂对小鼠的免疫原性及安全性。方法将ICR小鼠随机分为5组,每组7只,醇提红豆杉佐剂组:含血凝素1.2μg,红豆杉醇提物0.2 mg;水提红豆杉佐剂组:含血凝素1.2μg,红豆杉水提物0.2 mg[3];铝佐剂对照组:含氢氧化铝0.2 mg,血凝素1.2μg;疫苗对照组:含血凝素1.2μg;空白对照组:注射生理盐水0.2 ml。分别于0、21 d经腿部肌肉注射免疫2次,每次0.2 ml/只,初免后每隔7 d采血,收集血清,检测血凝抑制(HI)抗体效价,于初免后1、21、70 d观察各组小鼠的体重变化,并测定红豆杉醇提物的小鼠半数致死量(LD50)。结果醇提红豆杉佐剂组各时间点的小鼠血清HI抗体效价均高于疫苗对照组,在28 d时,含佐剂疫苗组的抗体效价均高于单独疫苗组,醇提红豆杉佐剂组的抗体产生先于铝佐剂对照组;各组小鼠体重增长差异无统计学意义(P>0.05);红豆杉醇提物的LD50值为577.93 mg/kg。结论红豆杉醇提物作为流感疫苗佐剂具有良好的安全性及有效性,有望成为流感灭活疫苗的新型免疫佐剂。     

流感亚单位疫苗裂解剂残留量检测及安全性试验

目的检测流感亚单位疫苗的裂解剂残留量,并观察其安全性。方法制备3批流感亚单位疫苗,采用比色法检测其裂解剂Tween-80和CTAB的残留量,通过动物实验观察其安全性。结果制备的3批疫苗样品,Tween-80的残留量平均在68.3~72.0μg/ml之间,CTAB残留量平均在36.3~38.7μg/ml之间。在安全性试验中,豚鼠未出现过敏反应,小鼠和豚鼠未出现异常毒性反应。结论制备的流感亚单位疫苗的裂解剂残留量符合拟定规程要求,安全性良好。     

单纯疱疹病毒2型表面糖蛋白D亚单位疫苗免疫佐剂的筛选及免疫方案优化

目的筛选单纯疱疹病毒2型(herpes simplex virus type 2,HSV-2)表面糖蛋白(glycoprotein)D2(g D2)亚单位疫苗的免疫佐剂,对免疫剂量、免疫次数等免疫方案进行优化。方法使用Alum佐剂、Poly I:C佐剂及Alum+Poly I:C混合佐剂,分别配伍不同剂量(2、5、10μg)的gD2蛋白,共制成9种注射制剂,经后腿肌肉注射免疫9组雌性BALB/c小鼠,分别于初次免疫后第28和42天各加强免疫1次,于初次免疫后28 d及第2、3次免疫后14 d,经眼眶静脉窦取血,分离血清,ELISA法检测特异性抗g D2抗体效价;脱颈椎处死小鼠,分离研磨脾脏后,获得脾细胞,加入gD2抗原刺激培养71 h后,收集细胞上清,应用CBA试剂盒测定细胞因子(IL-2、IFNγ、TNF-α)浓度;确定最佳免疫方案。结果初次免疫后28 d,各组总抗体效价偏低,混合佐剂(Alum+Poly I:C)配伍10μg抗原组小鼠血清抗体效价最高,但动物个体差异大。第2次免疫后14 d,各组小鼠血清抗体效价较第1次免疫显著增高;佐剂及抗原剂量对抗体效价影响显著,其中Poly I:C佐剂配伍10μg抗原组小鼠抗体效价及细胞因子分泌水平综合最高。末次免疫后14 d,小鼠血清中抗体效价较第2次免疫再次升高,动物个体间效价差异缩小,混合佐剂组效价最高;各组细胞因子分泌水平较第2次免疫略有增高,混合佐剂配伍2μg抗原组分泌高水平的IL-2、IFNγ、TNF-α。结论小鼠免疫模型中,使用Alum+Poly I:C混合佐剂较使用任一单独佐剂可产生最佳免疫效果,最佳免疫组为混合佐剂配伍2μg抗原组,最佳免疫次数为3次,第1和2次免疫间隔28 d,第2和第3次免疫间隔14 d,最佳免疫剂量为2μg/只小鼠。     

壳聚糖季铵盐微球作为注射疫苗佐剂的安全性评价

以小鼠、大鼠、豚鼠、家兔等为动物模型,对壳聚糖季铵盐微球作为注射疫苗佐剂进行安全性评价. 结果表明,小鼠急性毒性实验中50倍临床拟给药剂量(5.0 mg/只)下动物耐受性良好;大鼠重复毒性实验中即使50倍高剂量多次注射微球,动物各组织器官仍无病理性变化;异常毒性实验中小鼠给药后体征正常、体重明显增加,壳聚糖微球注射豚鼠后未见过敏反应及症状;家兔注射部位未发生肌肉组织溃烂、化脓等,佐剂未引起红细胞溶血.     

流感H3N2疫苗纳米乳佐剂的优化及安全性

目的优化纳米乳新配方,并从载水量及载苗方式探讨影响佐剂效果的因素。方法将ICR小鼠随机分为7组,每组5只,即A1、A2、A3、A4纳米乳佐剂组[A1(载水量66.7%)、A2(载水量80.0%)、A3(载水量85.7%)为成乳后加入疫苗吸附,A4(载水量80.0%)为成乳前加入疫苗包裹]:分别加入等量H3N2裂解疫苗[血凝素(hemagglutinin,HA)1.8μg];空白对照组:生理盐水;单独疫苗组:HA 1.8μg;铝佐剂组:Al(OH)30.2 mg,HA 1.8μg。均经小鼠大腿腓肠肌注射0.2 ml,0、21 d免疫,于初免后第1周开始,每周经尾动脉采血,分离血清,检测血凝抑制(haemagglutination inhibition,HI)效价,比较各组的免疫应答水平。以初免后1周内小鼠体重变化及最大给药量试验分析纳米乳的最大耐受量(maximal tolerance dose,MTD)。采用马尔文粒度仪检测不同载水量纳米乳粒径大小及分散系数。伪三元相图法及静置观察检测稳定性。结果小鼠初免后第5周,单独疫苗组小鼠HI滴度与A1、A2、A3纳米乳佐剂组相比,差异有统计学意义(P0.05),与A4纳米乳佐剂组相比,差异无统计学意义(P0.05);A3纳米乳佐剂组于初免后第5周,HI滴度达到峰值,约为单独疫苗组的4倍,也明显高于铝佐剂对照组和A1、A2纳米乳佐剂组(P均0.05)。纳米乳搭载或包裹疫苗对小鼠生长无明显影响,MTD25 ml/kg。纳米乳平均粒径分布均为10~100 nm左右,纳米乳A1、A2、A3粒径大小无明显差异,均匀度较好。载水范围大的纳米乳可搭载足量抗原,稳定性好。结论载水量85.7%、以吸附方式载苗的纳米乳佐剂效果最佳,且具有良好的安全性。     

玛咖提取物作为流感疫苗佐剂的体液免疫效果及安全性

目的探讨玛咖提取物作为流感疫苗佐剂的体液免疫效果及安全性。方法将BALB/c小鼠随机分为4组,每组10只,玛咖提取物佐剂组:含血凝素1.8μg,玛咖提取物0.2 mg;氢氧化铝佐剂组:含血凝素1.8μg,氢氧化铝0.2 mg;无佐剂疫苗组:含血凝素1.8μg;生理盐水组:生理盐水。分别于0、21 d经小鼠腿部肌肉注射免疫2次,0.2 m L/(只·次)。初次免疫后,每隔7 d收集血清,测定小鼠血凝抑制抗体效价。初免后7 d内,每天称量1次小鼠体重,监测各组小鼠体重变化。结果 14、21、28、35、42、49和56 d时间点,玛咖提取物佐剂组小鼠血清血凝抑制抗体效价均显著高于无佐剂疫苗组,差异有统计学意义(P0.05);与氢氧化铝佐剂组比较,玛咖提取物佐剂组小鼠血清血凝抑制抗体效价7、14和21 d差异无统计学意义(P0.05),28、35、42、49和56 d差异有统计学意义(P0.05);组内不同时间点的血凝抑制抗体效价差异有统计学意义(P0.05);各组小鼠体重变化差异无统计学意义(P0.05),注射部位未见不良反应。结论玛咖提取物作为疫苗佐剂具有良好的安全性,且佐剂效果明显,有望成为流感灭活疫苗的新型免疫佐剂。     

增强ESAT6-CFP10融合蛋白诱导小鼠细胞免疫应答佐剂的筛选

目的筛选能增强特异性抗原早期分泌抗原靶6蛋白(Early secretory antigenic target 6,ESAT6)-培养滤出液蛋白-10(Culture filtrate protein 10,CFP-10)融合蛋白(E1C0)诱导小鼠细胞免疫应答的佐剂,建立基于细胞免疫应答的小鼠模型,以评价基于体外干扰素γ释放分析(IFNγrelease assay,IGRA)结核诊断方法中特异性刺激抗原E1C0的活性。方法建立小鼠IFNγ双抗体夹心SABC-ELISA检测系统,并验证系统的线性、灵敏度、重复性和特异性。将BALB/c小鼠随机分为7组:E1C0+单磷酸类脂A(Monophosphoryl lipid A,MPL)+双十八烷基二甲基溴化铵(Dimethyl dioctadecylammonium bromide,DDA)组、E1C0+DDA组、E1C0+MPL组、E1C0+弗氏不完全佐剂(IFA)组、E1C0组、生理盐水组和MPL+DDA联合组,每组6只,经小鼠后肢内侧皮下免疫3次,间隔2周,免疫剂量为:E1C0 100μg/只,MPL 25μg/只,DDA 250μg/只,IFA 100μl/只。末次免疫4周后处死小鼠,无菌取脾,分离脾淋巴细胞,加入E1C0进行培养,MTT法检测特异性淋巴细胞增殖反应,ELISA法检测培养上清中IFNγ水平。采用筛选出的最佳佐剂与抗原组合免疫3批BALB/c小鼠,进行IFNγ诱生测定。结果检测系统的线性范围为:40～2 560 pg/ml(R>0.98);灵敏度为40 pg/ml;变异系数(CV)<15%,检测大鼠、豚鼠和兔血清IFNγ均为阴性;E1C0+MPL+DDA组、E1C0+IFA组和E1C0+DDA组小鼠特异性淋巴细胞增殖刺激指数均明显高于生理盐水组(P<0.01);E1C0+MPL+DDA组小鼠的脾淋巴细胞经E1C0体外刺激后,产生的IFNγ水平明显高于其他组(P<0.001);重复试验结果显示,E1C0+MPL+DDA组3批小鼠免疫后,脾淋巴细胞诱生的IFNγ水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论 E1C0与MPL和DDA联合免疫所诱导的小鼠Th1型细胞免疫应答最强,成功建立了用于评价刺激抗原E1C0活性的小鼠模型。     

人禽流感裂解疫苗对小鼠的免疫原性观察

目的观察人禽流感裂解疫苗对小鼠的免疫原性。方法将不同血凝素含量(20、30、45μg/ml)的铝佐剂和无佐剂人禽流感裂解疫苗各3批分别经腹腔注射免疫小鼠,0.5 ml/只,每批疫苗又分为1针、2针和3针组,每组10只,每针间隔1周,同时设空白对照组。首针免疫后21 d,分别采血,分离血清,检测血凝抑制抗体效价和中和抗体效价。结果 1针、2针组各3批无佐剂疫苗免疫小鼠的血凝抑制抗体效价和中和抗体效价分别小于1∶40和1∶200;2针、3针组各3批铝佐剂疫苗的血凝抑制抗体效价均大于1∶50,2针组20、30μg/ml血凝素铝佐剂疫苗的中和抗体效价均大于1∶200;2针、3针组20、30与45μg/ml血凝素铝佐剂疫苗的血凝抑制抗体效价和中和抗体效价差异均无统计学意义(P>0.05);且2针、3针组3批铝佐剂疫苗的血凝抑制抗体效价和中和抗体效价均明显高于相应的3批无佐剂疫苗。结论铝佐剂疫苗对小鼠的免疫原性明显优于无佐剂疫苗,且20、30μg/ml血凝素铝佐剂疫苗接种2针可获得理想的免疫效果。     

结核分枝杆菌融合蛋白亚单位疫苗对BCG初始免疫的加强效应及保护效力

目的探讨结核分枝杆菌融合蛋白亚单位疫苗对BCG初始免疫的加强效应及保护效力。方法将Ag85B、Ag85B-Mpt64190-198-HspX(AMH)、Ag85B-Mpt64190-198-Mtb8.4(AMM)以及AMH+AMM蛋白分别与佐剂二甲基三十六烷基铵(DDA)和卡介苗多糖核酸(BCG-PSN)混合,制备亚单位疫苗。第0周用BCG皮下免疫C57BL/6小鼠,第8、10周分别用各蛋白疫苗皮下加强免疫,以PBS和BCG(仅免疫1次)作为对照。末次免疫后4周,采血检测血清抗体水平,并分离脾淋巴细胞,检测分泌IFNγ的水平;末次免疫后12周,经尾静脉注射H37Rv株,6周后取肺,进行菌落计数,抗酸及HE染色观察。结果各亚单位疫苗加强组诱导产生的特异性抗Ag85BIgG抗体水平均明显高于BCG组;融合蛋白疫苗加强组免疫小鼠脾细胞经Ag85B和PPD刺激后,产生分泌IFNγ的淋巴细胞数明显多于BCG组;融合蛋白加强组免疫小鼠肺组织结核结节面积与BCG组比较,差异无统计学意义;仅AMM+AMH加强组免疫小鼠肺组织菌落计数明显低于BCG组,其抗酸染色阳性细菌数明显低于PBS、BCG及AMH、Ag85B加强组。结论AMH和AMM疫苗联合加强BCG免疫,能诱导小鼠特异性的细胞免疫和体液免疫应答,具有较强的免疫原性,可增强BCG的保护效力。     

不同浓度配比的CpG ODN和Al(OH)_3佐剂乙型肝炎疫苗的免疫原性

目的比较不同浓度配比的CpG ODN和Al(OH)3佐剂乙型肝炎疫苗的免疫原性。方法按乙肝表面抗原浓度为20μg/ml,分别加入3个浓度的Al(OH)3(300、400、500μg/ml)和CpG ODN(125、250、500μg/ml)佐剂,按不同配比制备9组不同佐剂浓度的疫苗样品,以不加CpG ODN佐剂的疫苗作为对照。将各组疫苗样品分别按1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256共5个稀释度稀释后,经腹腔免疫BALB/c小鼠,第5周检测血清中抗-HBs水平,计算抗体阳转率及半数有效量(ED50);将各组疫苗样品分别于第0和28天经左前胫肌肉免疫BALB/c小鼠,分别于第1次免疫后第2、4、6、8、10周检测体液免疫应答水平,第5周检测细胞免疫应答水平。结果不同浓度CpG ODN和Al(OH)3的9组疫苗样品免疫小鼠后,ED50均小于0.2,对照组疫苗的ED50为0.235。不同浓度CpG ODN和Al(OH)3的9组疫苗样品小鼠血清抗体滴度均高于对照组,且抗体产生时间略提前;Al(OH)3浓度为400和500μg/ml时,疫苗诱导小鼠产生的抗体滴度与CpG ODN佐剂浓度呈正相关。对照组诱导产生的IFNγ水平均较其他疫苗组低;随着A1(OH)3浓度的升高,同一CpG ODN浓度的疫苗样品诱导IFNγ的水平逐渐下降;相同A1(OH)3浓度下,低浓度CpG ODN组斑点形成细胞数(spot-forming cell,SFC)均值较高,而高浓度组SFC均值较低。结论 A1(OH)3和CpG ODN作为双佐剂系统协同乙型肝炎疫苗,不仅能增强体液免疫应答,还能诱导IFNγ的表达,激活Th1细胞免疫应答,比传统A1(OH)3单佐剂乙型肝炎疫苗更具优势,其中CpG ODN和Al(OH)3浓度均为500μg/ml的疫苗制剂免疫原性最佳。