乙型脑炎减毒活疫苗对中国主要流行基因型毒株的免疫效果

目的评价乙型脑炎(简称乙脑)减毒活疫苗SA14-14-2免疫人体后对中国流行的两种主要基因型(Ⅰ型和Ⅲ型)的免疫效果。方法收集乙脑减毒活疫苗免疫的健康儿童免疫前及免疫后28 d采集的血清样品,采用蚀斑减少中和试验(plaque reduction neutralization test,PRNT)检测血清中对中国流行的两种基因型乙脑病毒的中和抗体,并计算血清中和抗体阳转率。结果疫苗免疫后对国内流行的基因Ⅰ型和Ⅲ型乙脑病毒均产生了较高水平的中和抗体,血清中和抗体阳转率分别为90. 0%和92. 0%,几何平均滴度(GMT)分别为1︰26. 2和1︰27. 5,差异无统计学意义(P 0. 05)。结论乙脑减毒活疫苗免疫人体后,对中国流行的2种基因型乙脑病毒均具有较好的免疫效果。     

乙型脑炎减毒活疫苗毒力稳定性分析

目的分析乙型脑炎减毒活疫苗毒力稳定性。方法按照《中国药典》三部(2010版)及武汉生物制品研究所有限责任公司《乙型脑炎减毒活疫苗乳鼠返祖传代试验及小鼠脑内致病力试验SOP》,对随机抽取的28批乙型脑炎减毒活疫苗进行乳鼠返祖传代试验的脑内致病力检测,同时测定发病乳鼠脑组织悬液的病毒滴度,并应用SPSS 13.0软件对28批疫苗病毒滴度、发病乳鼠脑组织上清病毒滴度及发病乳鼠脑内病毒对小鼠的脑内致病力检测结果进行Kendall相关性分析。结果 28批乙脑减毒活疫苗病毒滴度为6.0~7.1 Lg PFU/ml,发病乳鼠脑内病毒对小鼠的脑内致病力(LD50)均低于3.0 Lg LD50/0.03 ml,发病乳鼠脑组织上清病毒滴度为5.8~7.0 Lg PFU/ml。发病乳鼠脑内病毒对小鼠的脑内致病力与疫苗滴度及发病乳鼠脑组织上清病毒滴度间不存在相关性,而疫苗滴度与发病乳鼠脑组织上清病毒滴度间低度相关。结论乙型脑炎减毒活疫苗毒力稳定,乳鼠传代返祖试验及其判定标准科学严谨,用于疫苗的质量控制是可行的,进一步表明SA14-14-2株遗传稳定性良好。     

应用Vero细胞生产乙型脑炎减毒活疫苗

<正>乙脑减毒活疫苗副反应小,注射针次少,但乙脑减毒括疫苗在生产过程中由于使用地鼠肾细胞,存在动物源性的各种污染和变化因素不易控制。所以我们尝试使用传代细胞制备乙脑活疫苗。方法是将乙脑SA14-14-2毒株接种于长成致密单层的Vero细胞瓶中,加入无血清维持液,35℃培养,于     

流行性乙型脑炎活疫苗11年的流行病学效果

目的 观察连续大面积接种流行性乙型脑炎活疫苗的流行病学效果。方法 连续观察１１年接种 乙脑活疫苗的１８２７１５人次的乙脑发病率。结果１１年内均未出现异常反应,总发病率由接种前的２１．８９／１０万下降 到２／１０万左右,保护率为９８．９９％。结论 进一步证明乙脑活疫苗安全有效。     

流行性乙型脑炎活疫苗流行病学效果观察

1991年对58645名1～7岁儿童进行了乙脑活疫苗流行病学效果观察,接种乙脑活疫苗组29639人,发生乙脑2例,发病率为6.75/10万;未接种组29006人,发生乙脑46例,发病率158.59/10万,二者差异显著(x~2=39.49,P<0.005),疫苗当年保护率95.74％、保护比1:23.49,高于国内灭活疫苗报告的结果,同时,活疫苗对病情的轻重和转归有良好的影响.而且使用简便安全。     

乙型脑炎减毒活疫苗质量控制中趋势分析的应用

<正>我国自2001年开始逐步实行生物制品批签发,至2006年1月1日将所有预防用疫苗、血液制品及用于血源筛查的体外诊断试剂纳入批签发。生物制品的批签发工作包括对每批制品的资料审核和样品的检验。批签发的实施保证了生物制品的质量[1-2]。     

流行性乙型脑炎减毒活疫苗国内外不同野毒株的免疫性

目的研究乙型脑炎减毒活疫苗对国内外不同野毒株的免疫原性。方法用小鼠保护力试验和空斑减少中和试验检测该疫苗对国内外不同野毒株攻击的保护作用及其免疫血清的中和能力。结果小鼠免疫1针后均能抵抗国内11株和国外11株乙脑病毒的攻击,保护率均可达90％以上;人体免疫血清对台湾1株和国外9株病毒均有明显的中和作用。结论SA14-142株乙脑活疫苗具有广谱的免疫原性。     

乙型脑炎减毒活疫苗及稀释剂与其直接接触的包装容器的相容性

目的考察乙型脑炎减毒活疫苗及稀释剂与其直接接触的包装容器的相容性,评估疫苗及稀释剂现用包装容器的适宜性。方法分别检测已包装的疫苗、稀释剂在加速条件及规定储存条件下,其包装容器的外观、胶塞对疫苗的吸附度,胶塞中抗氧剂2,6-二叔丁基对甲酚(2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol,BHT)和玻璃瓶中有毒有害金属离子As、Sb、Pb、Cd迁移量,玻璃瓶内表面脱片风险等,分析乙型脑炎减毒活疫苗及稀释剂现用包装容器对产品质量的影响程度及包装容器是否被疫苗或稀释剂腐蚀受损。结果 3批乙型脑炎减毒活疫苗在(25±2)℃、相对湿度(RH)(60±5)%放置6个月,(37±2)℃、RH(75±5)%放置4周,2~8℃放置24个月,疫苗及包装材料(容器)外观与0月结果一致,胶塞对疫苗的吸附度低于0.05%,包装容器中抗氧剂BHT及有毒有害金属离子As、Sb、Pb、Cd迁移至疫苗中的量远低于安全限值,玻璃瓶内表面被疫苗腐蚀脱片的风险较低。3批稀释剂在(40±2)℃、RH(75±5)%放置12个月,2~30℃放置至42个月,稀释剂及包装材料(容器)外观与0月结果一致,包装容器中抗氧剂BHT及有毒有害金属离子As、Sb、Pb、Cd迁移至稀释剂中的量远低于安全限值,玻璃瓶内表面被稀释剂腐蚀脱片的风险较低。结论乙型脑炎减毒活疫苗及稀释剂分别与其包装容器发生相互作用的风险可接受,显示了良好的相容性,表明现用包装容器是适宜的。     

乙型脑炎减毒活疫苗中猪圆环病毒PCR检测方法的建立及验证

目的建立乙型脑炎减毒活疫苗中猪圆环病毒1型(porcine circovirus 1,PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)PCR检测方法,并进行验证及初步应用。方法参照Gen Bank中登录的PCV1(AY193712)及PCV2序列(AY181946)设计引物,以提取的PCV1和PCV2基因组DNA为模板,分别经PCR扩增726 bp的PCV1片段和433 bp的PCV2片段,并对PCR反应中的退火温度、引物浓度、Mg2+浓度参数进行优化。将PCR扩增产物分别与p MD18-T载体连接,连接产物转化感受态大肠埃希菌DH5α,挑取阳性克隆,测序并进行同源性分析。对优化的PCR方法进行灵敏度和特异性验证,并用该方法检测3批乙型脑炎减毒活疫苗工作种子批、4批明胶和10批胰蛋白酶中的PCV1和PCV2。结果确定PCR反应的退火温度为54℃,引物浓度为10μmol/L,Mg2+浓度为10 mmol∕L。扩增的目的基因测序结果与Gen Bank中发布的PCV1及PCV2序列的同源性均为100%。建立的PCR方法最低可检出10 pg的目的基因;该方法只对PCV1和PCV2基因组DNA能扩增出特异性条带。用该方法检测乙型脑炎减毒活疫苗工作种子批、明胶和胰蛋白酶,均未检出PCV1和PCV2。结论成功建立了乙型脑炎减毒活疫苗中PCV1和PCV2的PCR检测方法,该方法具有较高的灵敏度和较强的特异性,可用于乙型脑炎减毒活疫苗工作种子批及两种猪源性原材料的PCV1和PCV2污染检测。     

大规模人群接种甲型肝炎减毒活疫苗的免疫效果

应用国产甲型肝炎（下称甲肝）减毒活疫苗采用整群随机分组方法对31421名中小学生进行接种,于接种后4～6周随机抽取1546人进行血清学观察,观察组抗HAV－lgG阳性率为78．7％,其中长春苗组为79．77％,昆明苗组为78．09％。观察组抗HAV－lgG明显高于对照组的14.2％和免疫前的10.4％。经4年的观察,观察组发病为3．97／10万,其中长春苗组为5．0／10万,昆明苗2．82／10万。对照组发病率为29．16／10万,长春苗组为30.26／10万,昆明苗组为28.24／10万。观察组与对照组比较保护率为86．9％,其中长春苗保护率为83．5％,昆明苗保护率为86．99％,两所疫苗效果差异无显著意义。     

乙脑风疹联合减毒活疫苗病毒间的相容性

目的研究乙脑风疹联合减毒活疫苗中乙脑病毒和风疹病毒的相容性。方法将乙脑病毒SA14-14-2疫苗株制备的乙脑减毒活疫苗原液与风疹病毒RA27/3疫苗株制备的风疹减毒活疫苗原液按体积比1∶1比例混合,加入保护剂,冻干制成乙脑风疹联合减毒活疫苗。采用BHK21细胞蚀斑法测定联合疫苗中的乙脑病毒滴度,细胞病变法检测风疹病毒滴度;通过鉴别试验、热稳定性试验、乙脑疫苗免疫原性试验、安全性试验、异常毒性试验、无菌试验以及基因稳定性分析观察联合疫苗病毒间的相容性。结果联合疫苗的乙脑和风疹病毒滴度与单价疫苗的病毒滴度变化在检测误差的允许范围内;联合疫苗于37℃放置7 d,与放置前相比,风疹病毒和乙脑病毒的滴度值下降分别小于1.0 LgCCID50/ml和1.0 LgPFU/ml,符合《中国药典》三部(2010版)要求;联合疫苗中的风疹疫苗对乙脑疫苗的免疫原性无明显的干扰效应;鉴别试验、安全性试验、异常毒性试验、无菌试验结果均符合《中国药典》三部(2010版)要求;联合疫苗在BHK21细胞上传代5次后,乙脑和风疹病毒基因序列均未发生变化。结论乙脑风疹联合减毒活疫苗中的乙脑和风疹病毒具有较好的相容性,本实验为乙脑风疹联合疫苗的进一步研制奠定了基础。     

冻干乙型脑炎减毒活疫苗非动物源性稳定剂的配方及其缓冲液的筛选

目的筛选冻干乙型脑炎减毒活疫苗非动物源性稳定剂的配方及其缓冲液。方法分别以0.01 mol/L PBS和Earles液为缓冲液,右旋糖苷-70、蔗糖、山梨醇、乳糖及组氨酸不同组合构成的冻干稳定剂,制备乙型脑炎减毒活疫苗半成品及冻干疫苗成品,观察在不同温度存放不同时间的稳定性,并检测不同配方冻干稳定剂的崩解温度(Tc)。结果 12种配方冻干稳定剂制成的疫苗半成品可在4℃1周内保持滴度稳定性,在25℃3 d内保持滴度无明显变化,3 d后滴度大幅下降;以0.01 mol/L PBS为缓冲液的稳定剂制备的疫苗的Tc值低于Earles液,以Earles液为缓冲液的D2和F2配方制备的冻干疫苗成品,在4℃及37℃放置1周后,滴度均>5.7 logPFU/ml。结论已筛选出以Earles液为缓冲液,含右旋糖苷-70、蔗糖、山梨醇、乳糖及组氨酸的稳定剂配方,用于制备冻干乙型脑炎减毒活疫苗具有良好的保护效果。     

乙型脑炎减毒活疫苗E蛋白基因及氨基酸序列稳定性分析

目的分析2003²011年连续9年出口韩国的23批乙型脑炎减毒活疫苗E蛋白基因及氨基酸序列的稳定性。方法提取出口韩国的23批乙型脑炎减毒活疫苗及其生产该疫苗的主种子和工作种子病毒RNA,RT-PCR法扩增乙型脑炎减毒活疫苗病毒E蛋白基因片段后进行测序;将23批乙型脑炎减毒活疫苗E蛋白基因序列中8个关键位点氨基酸序列与GenBank中登录的乙型脑炎病毒弱毒株SA14-14-2应用AlignX比对软件进行分析;检测23批乙型脑炎减毒活疫苗及生产该疫苗的主种子和工作种子病毒滴度。结果 23批疫苗与生产该疫苗的主种子、工作种子的病毒E蛋白基因序列与GenBank中登录的乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2 E蛋白基因序列完全一致,均由1 500个核苷酸组成,并编码500个氨基酸,同源性100%;23批疫苗E蛋白基因中与弱毒力密切相关的8个关键位点的氨基酸均未发生改变,与生产该疫苗的主种子、工作种子以及GenBank中登录的乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2(D90195)E蛋白相应位点一致性为100%;生产23批疫苗的主种子和工作种子病毒滴度变化幅度较小,为6.722011年连续9年出口韩国的23批乙型脑炎减毒活疫苗E蛋白基因及氨基酸序列的稳定性。方法提取出口韩国的23批乙型脑炎减毒活疫苗及其生产该疫苗的主种子和工作种子病毒RNA,RT-PCR法扩增乙型脑炎减毒活疫苗病毒E蛋白基因片段后进行测序;将23批乙型脑炎减毒活疫苗E蛋白基因序列中8个关键位点氨基酸序列与GenBank中登录的乙型脑炎病毒弱毒株SA14-14-2应用AlignX比对软件进行分析;检测23批乙型脑炎减毒活疫苗及生产该疫苗的主种子和工作种子病毒滴度。结果 23批疫苗与生产该疫苗的主种子、工作种子的病毒E蛋白基因序列与GenBank中登录的乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2 E蛋白基因序列完全一致,均由1 500个核苷酸组成,并编码500个氨基酸,同源性100%;23批疫苗E蛋白基因中与弱毒力密切相关的8个关键位点的氨基酸均未发生改变,与生产该疫苗的主种子、工作种子以及GenBank中登录的乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2(D90195)E蛋白相应位点一致性为100%;生产23批疫苗的主种子和工作种子病毒滴度变化幅度较小,为6.72⁷.17 lgPFU/ml,而23批疫苗的病毒滴度变化幅度也较小,为7.027.17 lgPFU/ml,而23批疫苗的病毒滴度变化幅度也较小,为7.02⁷.61 lgPFU/ml。结论连续9年出口韩国的23批乙型脑炎减毒活疫苗病毒E蛋白基因稳定,一致性良好,该疫苗质量稳定,安全可靠。     

乙型脑炎减毒活疫苗(SA14-14-2株)的纯化

目的建立纯化乙型脑炎减毒活疫苗(SA14-14-2株)的方法。方法应用超滤浓缩和分子筛凝胶柱层析纯化乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)SA14-14-2病毒液,检测其病毒滴度、原代地鼠肾细胞残留蛋白含量、牛血清白蛋白残留量、庆大霉素残留量,并进行小鼠脑内致病力试验、乳鼠传代返祖试验、异常毒性试验,制备纯化冻干疫苗,进行热稳定性试验。结果纯化后的JEV病毒滴度高于7.0 lg PFU/ml,平均回收率为23%;牛血清白蛋白残留量、庆大霉素残留量及安全性试验均符合《中国药典》三部(2010版)相关规定,去除了约95%的原代地鼠肾细胞残留蛋白;制备的冻干疫苗及热稳定性试验中的病毒滴度均高于5.7 lg PFU/ml,且热稳定性试验中病毒滴度下降未超过1.0 lg,符合《中国药典》三部(2010版)规定。结论建立了乙型脑炎减毒活疫苗(SA14-14-2株)纯化工艺,但病毒回收率较低,不适宜规模化生产,对乙型脑炎病毒减毒活疫苗质量控制具有指导意义。     

羊口蹄疫灭活疫苗分别与小反刍兽疫活疫苗及布氏菌活疫苗联合使用的免疫效果分析

目的分析羊口蹄疫灭活疫苗(inactivated food and mouth disease vaccine,IFMDV)分别与小反刍兽疫活疫苗(live attenuated peste des petits ruminants vaccine,LPPRV)及布氏菌活疫苗(live Brucella vaccine,LBV)联合使用的免疫效果。方法应用口蹄疫O型、亚洲1型二价灭活疫苗与LPPRV联合免疫山羊,观察山羊不良反应,采用病毒中和试验法和液相阻断ELISA法分别测定山羊血清中小反刍兽疫抗体及口蹄疫抗体水平。应用口蹄疫O型、A型、亚洲1型三价灭活疫苗与LBV(M5株)联合免疫绵羊,观察绵羊的不良反应,采用试管凝集试验及液相阻断ELISA法检测绵羊血清中布氏菌抗体及口蹄疫抗体水平。结果 IFMDV分别与LPPRV及LBV联合免疫山羊及绵羊,均未见明显的不良反应,仅出现一过性体温升高现象;IFMDV(肌肉)和LPPRV(皮下)同时联合免疫,山羊血清中小反刍兽疫抗体水平明显高于单独免疫LPPRV组(P0.05);IFMDV与LBV联合免疫,绵羊血清中布氏菌抗体水平高于单独免疫LBV组(P0.05),且联合免疫组抗体阳性率达100%,比单独免疫LBV组提高了13%。结论 IFMDV分别与LPPRV、LBV联合使用具有良好的安全性,且可提高LPPRV及LBV的免疫效果。     

检测乙型脑炎减毒活疫苗中分枝杆菌污染的环介导恒温扩增法的建立

目的建立检测乙型脑炎减毒活疫苗中分枝杆菌污染的环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)法。方法选择皮内注射BCG疫苗、人结核分枝杆菌标准株和临床株、牛分枝杆菌标准株和临床株、草分枝杆菌标准株和临床株、偶然分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、龟脓分枝杆菌、戈登分枝杆菌、土地分枝杆菌、鸟分枝杆菌、施氏分枝杆菌、亚洲分枝杆菌共16株,对建立的LAMP法的灵敏度、精密度、适用性及特异性进行验证,分析其在乙型脑炎单一病毒收获液质量控制中的可行性。结果该方法对偶然、堪萨斯和鸟分枝杆菌的检测灵敏度为103CFU/ml,对其他分枝杆菌的检测灵敏度可达102CFU/ml,灵敏度良好;用建立的方法对同一批样品的6次检测结果均一致,2名试验人员分别每日检测每批样品,连续检测3 d,检测结果均一致,表明该方法精密度良好;乙型脑炎单一病毒收获液中的成分对实验结果无干扰作用,表明该方法适用性良好;分别加入百日咳杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌C3000 3种非分枝杆菌的乙型脑炎单一病毒收获液的检测结果均为阴性,表明该方法可区分分枝杆菌属细菌和非分枝杆菌属细菌,特异性良好。结论建立了检测乙型脑炎减毒活疫苗中分枝杆菌污染的LAMP法,该方法可用于检测乙型脑炎单一病毒收获液是否被分枝杆菌污染。