人结直肠癌中两种新分子生物标记物的筛选

为挖掘结直肠癌早期病变的生物标记物,通过对高通量组织芯片上进行优化的多重免疫组织化学染色,观察比对了TATA序列结合蛋白相关因子1 (TATA-box binding protein associated factor 1 like,TAF1L)和stomatin家族蛋白1 (stomatin-like protein 1,STOML1)在结直肠癌组织和相匹配的癌旁正常组织之间的表达差异,检测了其表达水平与癌组织的不同临床分期、病理分级和tumor-lymph node-metastasis(TNM)分期的关系.结果显示,相比癌旁正常组织,TAF1L蛋白质在癌组织中呈高表达,差异具有统计学显著性意义(P 0. 000 1),并可随原位病灶的恶化显现明显的表达改变; STOML1蛋白质的表达水平在癌组织中差异无明显统计学意义(P 0. 05).结果显示,TAF1L蛋白质的异常高表达与结直肠癌的发生发展可能存在直接的关联,有可能成为结直肠癌早期诊断、精准治疗和预后判定的新分子标记物.     

柞蚕滞育关联蛋白基因dap2的表达特征及分子特性

滞育关联蛋白(DAP)在昆虫滞育进程中可能发挥重要作用。从NCBI获取柞蚕滞育关联蛋白基因2(Antheraea pernyi diapause-associated protein 2,dap2)的序列,序列分析表明该基因的cDNA全长1 187bp,ORF为874bp,编码278个氨基酸。NCBI数据库氨基酸序列比对,DAP2与烟草天蛾和家蚕的眼色素结合蛋白(omminbinding protein,OBP)同源性分别达到57%和58%。通过荧光定量PCR和Western blotting方法,分别检测柞蚕不同发育时期和五龄幼虫不同组织中dap2的转录表达水平,结果表明dap2在滞育蛹中转录和表达水平最高;在5龄幼虫不同组织中的分析表明其转录水平在脂肪体和血淋巴中最高,在翻译水平上血淋巴中表达最高。分离纯化后,对天然DAP2蛋白分子特性进行初步研究,吸收光谱分析不能表明其携带色素,去糖基化修饰分析表明其为糖蛋白,双向电泳表明其可能存在三种不同程度的翻译后修饰,推测其可能是柞蚕的一种眼色素结合蛋白(ommin-binding protein,OBP)。     

骨形态发生蛋白-7在E.coli中的可溶性表达

骨形态发生蛋白-7(BMP-7)属于转化生长因子(TGF-β)家族中的成员,有很强的骨诱导作用.为了获得可溶性的rhBMP-7,利用SOE-PCR法获得链球菌G蛋白B1域(GB1)目的基因,构建GB1、连接肽、6His-tag、EKsite (Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)和BMP-7融合表达型载体,转化E.coliBL21 (DE3).工程菌在28℃下经0.1 mmol/LIPTG诱导后,可获得表观分子量约为28 kD的以可溶形式表达的GB1-BMP-7融合蛋白.     

凋亡蛋白对Bcl-2家族几个基因表达影响

凋亡蛋白（Apoptin）只诱导肿瘤细胞或转化的细胞凋亡,但其作用机制还不十分清楚．从鸡贫血病毒总DNA中克隆出凋亡蛋白基因,构建pcDNA3．1／CT—Apoptin—GFP—TOPO融合表达的载体．用该载体转染HHCC单层传代细胞24h后,观察到绿色荧光蛋白表达,同时观察到细胞形态呈凋亡特征变化．提取细胞总RNA,按SuperArray芯片操作方法检测到实验组Bcl-2家族中的BimL,Bcl-2,Bax和Bak基因上调表达．Bcl-2家族在细胞凋亡的过程中作用重要．凋亡蛋白诱导HHCC细胞凋亡过程中,促凋亡的BimL,Bax和Bak基因上调,抗凋亡的Bcl-2基因也上调．可能BimL与Bcl-2竞争性结合导致Bax或Bak释放,最终诱导细胞凋亡．揭示Bcl-2家族的基因参与凋亡蛋白诱导的HHCC细胞凋亡过程．     

补料分批培养大肠杆菌表达胸腺素α1融合蛋白

在摇瓶培养含有trymosin α1基因的重组pET32a质粒的工程菌BL21表达胸腺素α1融合蛋白的基础上，确定了分批发酵的基本培养条件．分别在B．Braun 5L自控发酵罐中进行了分批发酵和补料分批发酵，针对发酵过程中工程菌生长较旺盛而表达量小的情况，改变了培养方式．比较了不同的培养条件和方式下的工程菌的生长状况和融合蛋白的表达量，得到了高产量和高表达的培养条件：在培养过程中始终保持DO值〉30％，在对数生长期溶氧供给不足的情况下，提高搅拌速度到最大并适当补充纯氧；（2）限制性流加葡萄糖；（3）培养温度35℃，诱导表达温度30℃；（4）对数中期诱导，表达时间为4～5h；（5）在诱导前加入新鲜培养基，稀释发酵液一倍，并以稀释后的发酵液体积为准加入诱导剂．最终使菌体的干重达10g／L，融合蛋白表达量达23．25％．     

H5N1禽流感病毒蛋白对1F1TM基因家族转录的影响

干扰素诱导的跨膜蛋白(Interferon induced transmembrane protein,简称IFITM)通过抑制病毒进入细胞来保护细胞,使其免受多种病毒的感染。为了鉴定H5N1病毒本身和结构蛋白是否作为IFITM基因的新调节因子,通过试验探讨了H5N1病毒和结构蛋白对IFITM基因家族转录的影响。结果显示,H5N1病毒的NS1、M1、NP和PB2蛋白在A549细胞中增加了IFITM1、IFITM2和IFITM3表达,对HEK293T细胞没有影响,在HEK293T细胞和A549细胞上,没有发现H5N1病毒的HA和NA蛋白影响IFITM基因家族表达。即在H5N1禽流感病毒感染期间,NS1、M1、NP和PB2蛋白的过表达可以直接刺激IFITM1、IFITM2和IFITM3的上调,而呼吸系统的上皮细胞可能首先被影响,特别地,NP和NS1显示对IFITM基因家族的表达显示更显著的作用。     

补料分批培养大肠杆菌表达胸腺素α1融合蛋白

在摇瓶培养含有trymosin α1基因的重组pET32a质粒的工程菌BL21表达胸腺素α1融合蛋白的基础上,确定了分批发酵的基本培养条件.分别在B.Braun 5 L 自控发酵罐中进行了分批发酵和补料分批发酵,针对发酵过程中工程菌生长较旺盛而表达量小的情况,改变了培养方式.比较了不同的培养条件和方式下的工程菌的生长状况和融合蛋白的表达量,得到了高产量和高表达的培养条件: 在培养过程中始终保持DO值＞30%,在对数生长期溶氧供给不足的情况下,提高搅拌速度到最大并适当补充纯氧;(2)限制性流加葡萄糖;(3)培养温度35 ℃,诱导表达温度30 ℃;(4)对数中期诱导,表达时间为4～5 h;(5)在诱导前加入新鲜培养基,稀释发酵液一倍,并以稀释后的发酵液体积为准加入诱导剂.最终使菌体的干重达10 g/L,融合蛋白表达量达23.25%.     

超声引导下肝细胞癌穿刺组织中Ezrin表达的临床意义

探讨Ezrin表达及超声引导下穿刺活检对肝细胞癌（HCC）的应用价值,实验方法如下：36例经超声引导下穿刺所得的HCC组织作肝穿癌组;45例手术切除的HCC组织作手术癌组,同时取12个癌旁肝组织作癌旁组;用免疫组化方法检测两组标本的Ezrin蛋白表达,并与临床病理学参数做统计学分析。得出结果：肝穿癌组Ezrin阳性表达率为80．6％,手术癌组为86．7％,差异无统计学意义（P=0．459）;手术癌组与肝穿癌组的Ezrin表达均高于癌旁组织（P值分别为0．003和0．024）;手术癌组Ezrin的表达与肿块大小、有无癌栓、分化程度密切相关（P均〈0．05）;肝穿癌组Ezfin的表达与肿块大小、有无门脉癌栓密切相关（P均〈0．05）,且随着TMN分期增加有增高趋势,但无统计学意义（P=0．155）。结论：HCC组织中Ezrin基因的表达对HCC诊断、治疗及判断预后具有指导意义,超声引导下HCC穿刺活检组织中Ezrin基因的表达与HCC手术切除标本中Ezrin基因表达意义相近。     

采用酵母双杂交法筛选PSRPK相关蛋白基因

本课题组在前期研究中,从多头绒泡菌中分离到一个SR蛋白激酶基因psrpk,并将其编码蛋白命名为PSRPK(SR protein kinase ofPhysarum Polycephalum).为分离PSRPK相关蛋白基因以了解PSRPK的功能,构建了转化率为2×106转化子/3μg pGADT7-Rec、密度为5.35×108cells/mL、滴度为2.34×109cfu/mL的多头绒泡菌酵母双杂交AD库.以PSRPK为饵蛋白筛选该文库得到接合率为41.18%的杂交酵母,在SD/-Leu/-Trp/-Ade/-H is培养板上筛选获得1476个杂交克隆,其中,X-gal滤纸显色呈强蓝色的克隆有342个.对大于500 bp的67个克隆测序获得35个cDNA片段,其中编码Plasm in C、branched-chain am inoacid am inotransferase(BCAT)类似蛋白、MSF1类似蛋白、m ixed-linked glucanase precursor类似蛋白、FCY1p类似蛋白和40S ribosomal protein S2类似蛋白等7个cDNA片段在阳性杂交酵母克隆中出现多次,其余仅出现一次.在35个cDNA片段的编码序列中有15个具有同源蛋白,31个编码序列的丝氨酸含量大于或等于6%,符合激酶底物的组成特征.     

人血清淀粉样蛋白A1原核表达及胶体金检测方法的建立

通过胶体金免疫层析技术建立一种特异、便捷、快速的SAA1定量检测新方法.利用大肠杆菌BL21(DE3)原核表达人血清淀粉样蛋白A1(SAA1),根据BL21(DE3)表达偏好性设计并合成SAA1蛋白基因片段,构建表达载体pET-28a-SAA1,采用CaCl2法制备BL21(DE3)感受态,热激转化法将pET-28a-SAA1转入到BL21(DE3).经表达条件优化,获得重组蛋白最佳诱导表达条件:温度30℃,时间6h,转速180rpm/min,培养基pH 7.0,IPTG浓度0.4mM,诱导表达后目的蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定,Ni柱纯化、透析、浓缩从而获得浓度为8.09mg/ml,纯度为85%的SAA1.同时,结合胶体金标记技术,建立了SAA1胶体金免疫层析试纸检测方法,线性范围0.16~500μg/ml,最低检测限0.16μg/ml,该研究为临床体外诊断SAA1快速检测提供技术基础.     

家蚕MBP-Bmlp7蛋白的克隆表达及免疫学鉴定

克隆表达家蚕蚕蛹30 kD(1 kD=1 u)脂蛋白家族成员Bmlp7(Bombyx mori lipoprotein 7)的融合蛋白,鉴定其致敏原性.合成Bmlp7的基因后连接至载体质粒p MAL-C5e上,在大肠杆菌BL21中诱导表达出麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein,MBP)-Bmlp7,纯化后,利用Western blot鉴定MBP-Bmlp7融合蛋白与家蚕过敏患者血清中特异性免疫球蛋白E(immunoglobulins E,Ig E)的结合能力.结果显示,纯化得到了纯度较高的MBP-Bmlp7融合蛋白,且该融合蛋白能够与家蚕过敏患者血清特异性IgE结合,说明Bmlp7是家蚕中一种潜在的致敏原.     

大豆LEA蛋白Em的表达可提高大肠杆菌和烟草耐盐性

将大豆Em（LEA1）基因构建到原核表达载体pET28-Em中．转化大肠杆菌，经SDS—PAGE电泳及电喷雾质谱鉴定．结果显示，经IPTG诱导的重组菌可表达约18kDa的特异蛋白．这种蛋白具有良好的可溶性和热稳定性．在含800m mol／L NaCl培养基中，含空载体的对照菌生长迟滞期约为50h，含Em基因的重组菌生长迟滞期为32h，表明大豆Em蛋白的表达可提高大肠杆菌对盐胁迫的适应能力及耐盐性．在此基础上，构建了含Em基因的真核表达载体pBI—Em．再利用根癌农杆菌介导法将该基因转入烟草．PCR及RT-PCR结果显示，大豆Em基因已整合到转基因烟草的基因组DNA中，并能正常转录．转化率为53％．转Em基因烟草植株在含有质量分数1．5％NaCl的培养基中生长状况好于对照植株，叶片的叶绿素含量高于对照植株的叶片．结果表明，大豆Em基因的表达可提高大肠杆菌和转基因烟草的耐盐性．     

SHP-2酪氨酸磷酸酶C—SH2结构域的表达纯化和NMR研究

SHP-2是一种非跨膜型蛋白酪氨酸磷酸酶.将其N末端结构域C-SH2克隆至原核表达载体pGEX-2T中,命名为pGEX-2T-C-SH2.该融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达于菌体上清液中,经GST亲和层析柱和FPLC分子筛柱纯化后,目的蛋白纯度可达98%.质谱分析表明,目的蛋白相对分子量与理论值基本相同.在最适表达条件下,1 L的M9培养基能够高效表达并获得12 mg C-SH2蛋白,NMR结构和活性位点的分析表明,目的蛋白能正确折叠并呈规则的空间结构.     

表达人源PD-L1的4T1细胞系的构建

为构建稳定表达人源hPD-L1分子的小鼠乳腺癌细胞系(4T1),建立BALB/c小鼠乳腺癌肿瘤模型,采用Lipofactamine 3000转染试剂将携带绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)和hPD-L1的质粒转入4T1细胞中,经嘌呤霉素筛选获得4T1-hPD-L1单克隆细胞系,通过流式细胞术检测细胞纯度。将构建成功的细胞系皮下植入BALB/c小鼠背部,建立乳腺癌皮下肿瘤模型。流式细胞术检测4T1-hPD-L1细胞中GFP、PD-L1双阳性率为97.0%。将4T1-hPD-L1单克隆细胞系皮下接种于BALB/c小鼠背部可成瘤。成功构建稳定表达hPD-L1分子的4T1单克隆细胞系,并建立BALB/c小鼠乳腺癌肿瘤模型,为进一步研究PD-L1抗体药物提供参考。     

骨形态发生蛋白-2基因工程菌的构建及可溶性研究

骨形态发生蛋白是一类调节骨组织发育的生长因子,其中骨形态发生蛋白-2诱导成骨活性最强,在骨组织工程研究中最具研究意义.为获得能高效表达溶解性高的人骨形成蛋白-2(BMP-2)的基因工程菌,用PCR方法扩增得到BMP-2的基因序列,直接将PCR产物连接到胞内融合表达型T载体质粒pMT-L上,构建包括麦芽糖结合蛋白(MBP)、连接肽、6个His、EKsite(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)和BMP-2的表达载体,转化E.coli DH5α,经抗性筛选和菌落PCR鉴定,抽提阳性克隆质粒转化表达宿主E.coli BL21(DE3),成功构建可在大肠杆菌细胞质内表达MBP-BMP-2融合蛋白的基因工程菌.工程菌经0.1mmol/L IPTG诱导后,可获得表观分子量约为55kD的以可溶形式表达的BMP-2融合蛋白.     

融合蛋白sCAR-TSP-1原核表达纯化及诱导白血病细胞K562凋亡的研究

根据thrombospondin-1(TSP-1)氨基酸序列(RFYVVMWK),以已有的腺病毒受体sCAR为模板,将8个氨基酸对应基因核苷酸通过PCR扩增于sCAR之后,得到sCAR-TSP-1,连接到表达载体pQE30上,转化大肠杆菌M15后获得工程茵。该菌株经IPTG诱导后,高效表达出带有组氨酸标签以包涵体形式存在的融合蛋白sCAR-TSP-1。包涵体经过尿素变性溶解、PBS稀释复性、Ni离子亲和层析柱纯化,获得目的蛋白。SDS-PAGE分析表明,有一条明显的特异性蛋白条带。同时细胞实验结果表明融合蛋白sCAR-TSP-1对白血病细胞K562有明显凋亡作用。     

Ezrin低表达与肺鳞状细胞癌患者预后之间的关系

为了探讨癌基因Ezrin蛋白表达在肺鳞癌中的预后意义,应用免疫组化染色检测了96例肺鳞癌及其癌旁正常肺组织中Ezrin蛋白的表达,并结合临床生物学指标及生存时间进行统计学分析。结果显示:肺鳞癌、癌旁正常组织中Ezrin蛋白阳性表达率分别为41.67%和91.67%,癌组织中Ezrin蛋白阳性表达率明显低于癌旁正常组织(P<0.01),Ezrin蛋白在肺鳞癌中的阴性表达与肿瘤大小(P<0.05)、组织分化程度(P<0.05)、病理学分期(P<0.01)、是否有转移(P<0.01)密切相关,且癌组织中Ezrin蛋白的阴性率与患者5年生存率明显相关(P<0.01);Ezrin蛋白阴性表达(HR:0.292,95%CI:0.141～0.606,P=0.001)、病理学分期和转移是肺鳞癌预后不良的独立风险因素。得出结论:检测肺鳞癌组织中Ezrin蛋白的表达对其诊断及预后评估有重要价值,有望成为肺鳞癌新的生物标志物及靶向治疗的分子靶点。     

生物信息数据库分析INHBA在结直肠癌中的表达及临床意义

抑制素βA作为转化生长因子-β(TGF-β)超家族成员,在不同肿瘤中具有促癌或抗癌作用.通过生物信息数据库分析了INHBA在结直肠癌中的表达水平及临床意义.结果显示INHBA在结直肠癌中明显高表达,且其高表达与结直肠癌的临床分期、T分期和N分期呈正相关.INHBA基因启动子的甲基化水平在结肠腺癌和直肠腺癌中都显著降低....     

小麦麦谷蛋白高分子量亚基N端序列克隆及原核表达分析

为了探究麦谷蛋白高分子量亚基(HMW-GS)的N-末端结构域对面粉品质的影响,以HMW-GS的1Dx5的N-末端结构域(1Dx5-N)为目的基因进行序列克隆及原核表达,研究大肠杆菌BL21(DE₃)为载体菌进行转化,鉴定阳性克隆,以IPTG和乳糖作为诱导剂,并通过正交试验,筛选最佳的诱导条件。结果表明：1Dx5-N序列基因全长267 bp,共编码氨基酸89个,预测分子质量为16.211 kDa;经转化、阳性克隆鉴定后,证明了该表达载体能够在大肠杆菌中稳定遗传;IPTG和乳糖均可诱导1Dx5-N进行表达;SDS-PAGE表明1Dx5-N重组蛋白多为包涵体蛋白;IPTG诱导蛋白最佳表达条件为温度30℃,浓度0.6 mmol/L,诱导时间16 h;乳糖诱导蛋白最佳表达条件为温度30℃、质量浓度9 g/L、诱导时间16 h。通过对比发现,乳糖可代替IPTG诱导1Dx5-N蛋白表达。     

与结肠腺癌相关的细胞周期生物标志物的识别

结直肠癌是一种致死率较高的癌症,结肠腺癌是其最常见的病理亚型。挖掘与结肠腺癌相关的细胞周期相关基因、生长因子和激素,对研究结肠腺癌的发病机制以及诊断治疗都具有重要价值。利用加权基因共表达网络分析方法,根据TCGA和GTEx数据库中结肠腺癌样本的转录组数据构建基因共表达网络;利用模块特征相关系数,筛选出与结肠腺癌相关的重要模块;通过基因差异表达分析和富集分析,得到重要模块的差异基因和模块功能信息;利用生存分析识别与结肠腺癌相关的细胞周期生物标志物;进一步根据蛋白互作网络推断诱导结肠腺癌发生的内源性因素。结果表明：结肠腺癌相关的7个细胞周期生物标志物(CDC45、EREG、PBK、TOP2A、PER1、SNCG、NGFR)和4个内源性因素(ANP、BNP、FGF、NGF),这些生物标志物和内源性因素可作为结肠腺癌诊断和治疗的依据。