细菌素Lcn972A产生菌的鉴定及其基因的克隆与序列分析

目的:从杏鲍菇子实体与海带中分离的63株乳酸菌中鉴定出产细菌素Lcn972A的菌株,并对细菌素编码基因进行克隆与基因序列分析。方法:采用生物信息学手段对已报道的细菌素Lcn972A编码基因进行分析比较,设计引物,分别以各乳酸菌基因组DNA为模板,利用PCR克隆技术克隆出细菌素Lcn972A的基因,利用生物信息学工具对其核酸序列和预测的蛋白序列进行分析。结果:在63株乳酸菌的基因组样品中有15组被克隆出目的条带,其中杏鲍菇乳酸菌A15与海带乳酸菌CX2样品PCR产物条带清晰稳定性好,经鉴定两样品的乳酸菌株为乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）。对克隆的细菌素Lcn972A基因测序结果表明该基因序列全长276 bp。生物信息学分析显示该基因编码91个氨基酸,分子量大小22843.3 u,等电点5.33,氨基酸序列为亲水性,二级结构主要由α-螺旋、无规卷曲和延伸链组成。结论:从分离自杏鲍菇子实体乳酸乳球菌A15与海带乳酸乳球菌株CX2的细菌素编码基因及氨基酸序列与报道的有所不同,可能是新的细菌素,该细菌素的抗菌特点有待进一步的研究。      

烟草基因组知识篇：2．基因组测序

基因组计划的最终目标是获取所研究生物体的全部DNA序列,一般包括三个图谱,即遗传图谱、物理图谱和基因组全序列图谱,并将基因以及其他有意义的特征定位于DNA序列中.人以及模式生物的染色体都不能直接进行DNA测序,因此首先必须将它们随机地"敲碎"(通过限制性内切酶酶切或超声波处理或DNA酶Ⅰ降解)变成成千上万的小片段,构建成不同水平和类型的基因组文库,例如YAC(yeast artificial chromosome,酵母人工染色体)文库、BAC(bacterial artificial chromosome,细菌人工染色体)文库和cDNA文库等.然后对文库中的每个克隆片段进行DNA测序,再对所有测定的每条序列经过计算机程序处理装配成染色体上完整的DNA序列.     

基于土壤宏基因组文库筛选非培养木聚糖酶基因

采用物理化学法提取土壤基因组DNA,将土壤DNA纯化后采用序列筛选策略获得非微生物纯培养方式的木聚糖酶基因。序列筛选依据木聚糖酶保守序列设计简并引物,PCR扩增获得200 bp的木聚糖酶核心序列,构建了约5 000个克隆子的序列文库。随机挑取200个克隆子测序,获得11条来自未培养微生物的木聚糖酶核心序列。并对其中细菌源序列1~19进行研究,利用HiTAIL-PCR扩增细菌源序列1~19的木聚糖酶基因全长,分析其编码蛋白,并将其与表达载体pET-28a(+)连接后导入E.coli表达,超声破壁后测得木聚糖酶酶活力为(19.94±0.3)U/mL。利用序列筛选获取土壤宏基因组源木聚糖酶基因的研究为筛选获得土壤未培养微生物木聚糖酶基因新资源提供了新的途径。     

吸水链霉菌valG基因的克隆与表达

为提高井冈霉素A的产量,本实验尝试构建吸水链霉菌的多拷贝基因菌株.根据吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus subsp.jinggangensis）的糖基转移酶基因（valG）序列设计了1对引物.PCR扩增编码糖基转移酶（ValG）的1269 bp基因后,利用TA克隆构建克隆质粒pMD-19-valG.测序正确后经双酶切构建穿梭质粒pIJ8630-valG.再次测序验证后,经质粒DNA转化吸水链霉菌感受态细胞将pIJ8630-valG导入吸水链霉菌中.PCR检测证实重组菌构建成功.HPLC检测发酵产物,发现井冈霉素A的产量达到了1.17 mg/mL,比出发菌株提高了11.2％,valG基因得到表达,为进一步利用valG构建新的高产菌株奠定了基础.     

海洋放线菌乙酰CoA连接酶的克隆

克隆稀有海洋放线乙酰CoA连接酶合成基因的基因片段。根据Salinispora arenicola CNS-205的核苷酸序列保守区设计两对乙酰CoA连接酶特异性引物,以其总DNA为模板,采用PCR的方法扩增得到了包含乙酰CoA连接酶的完整的基因片段,并将该片段成功插入到克隆载体pUC-18中。将重组质粒进行酶切验证并在检测机构中验证测序结果正确,成功地获得了稀有海洋放线菌Salinispora arenicola的乙酰CoA连接酶合成基因的基因片段,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

氨基甲酸乙酯降解酶的基因克隆

提取氨基甲酸乙酯降解菌株基因组DNA,以27f和1492r为引物PCR扩增并测定目的菌株16Sr DNA序列,基因组DNA以Mbo I进行酶切,与BamH I酶切的pUC18连接形成重组载体,将载体转化入大肠杆菌BL21中,构建基因组文库。利用溴麝香草酚蓝筛选培养基上筛选含有氨基甲酸乙酯降解酶基因的重组菌。通过本实验,鉴定出氨基甲酸乙酯降解酶菌株属于蜡样芽孢杆菌。阳性重组菌株可通过含有1%溴麝香草酚蓝的培养基(pH=6.5)筛选出来。     

瘤胃中干酪乳杆菌的亚油酸异构酶基因的克隆与表达

以从黄牛瘤胃中分离到的一株具有将亚油酸转化为c9,t11-共轭亚油酸(conjugated linoleic acid,CLA)的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Fx为出发菌株,提取其基因组DNA,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增得到1 700 bp大小的亚油酸异构酶(linoleic acid isomerase,LAI)基因片段,将该基因片段纯化后进行TA克隆,得到重组质粒p UCm-T-LAI,将重组质粒p UCm-T-LAI和表达质粒p ET-Dsb A同时进行双酶切,连接得到重组表达载体p ET-Dsb A-LAI,经PCR鉴定和酶切后,将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21中,得到具有LAI活性的重组菌株,能将亚油酸转化为c9,t11-CLA,表明从Lactobacillus casei Fx成功克隆LAI,该研究将有助于深入了解不同瘤胃细菌特异性合成不同CLA异构体的LAI基因差异。     

棘孢木霉木聚糖酶Ⅱ结构基因和上游调控区的克隆及分析

作者克隆及分析了棘孢木霉木聚糖酶Ⅱ结构基因和上游调控区,并获得了内源启动子.根据木霉属木聚糖酶Ⅱ结构基因及上游调控区的保守性,以棘孢木霉基因组DNA为模板,进行简并PCR扩增,产物纯化并克隆至T载体,经酶切鉴定后进行序列分析.扩增获得片段长1875 bp,由795 bp的木聚糖酶Ⅱ结构基因和1 080 bp的上游调控区...     

鲁西黄牛乳铁蛋白N-末端多肽基因的表达与活性检测

从黄牛的肝脏中提取总的DNA，根Genebank牛乳铁蛋白的cDNA序列，设计特异性引物，采用RT-PCR进行扩增，将扩增片段克隆于PGEM－Teasy　vector中。测序结果表明，该片断是乳铁蛋白基因的cDNA序列，编码50个氨基酸的150bp的多肽片断，通过BamH1和ＥcoR1双酶酶切该片断，并连接到表达载体PGEX-4T1中，转化大肠杆菌BL21，进行诱导表达，蛋白电泳显示，表达成功；经纯化、胃蛋白酶酶解后，具有抗菌生物活性。     

2种山葡萄白藜芦醇合酶基因的克隆与序列分析

目的:白藜芦醇合酶(resveratrol synthetic enzyme,RS)是植物白藜芦醇合成途径中的关键酶,为获得高效表达的白藜芦醇合酶基因,方法:利用已知的葡萄RS基因(AF274281)序列设计并合成一对引物,以2种不同来源的山葡萄叶片基因组DNA为模板,PCR扩增包含RS完整基因在内的一段序列;在此基础上采用悬挂延伸PCR法分别克隆目的基因。结果:测序与序列分析表明,RS全长基因片段大小均为1 536bp,其中包含一个内含子及两个外显子,同源性比较,其内含子碱基变化较大。悬挂延伸PCR法克隆获得的目的基因,开放读码框分别为1 170 bp和1 182bp,编码389/392个氨基酸残基,命名为CNRS1、CNRS3。同源性比较发现,CNRS1、CNRS3与已知葡萄RS基因序列的同源性分别为98%、97.5%。结论:以上结果证实CNRS1、CNRS3属葡萄RS基因家族成员,为今后进一步对该基因的研究与利用打下了基础。     

人甲胎蛋白AFP在大肠杆菌中表达和鉴定

本研究通过应用基因工程技术,重组构建编码人全长甲胎蛋白AFP基因的原核表达载体pET22b-AFP,并将其转化到大肠杆菌宿主菌BL21（DE3）中进行诱导表达目的蛋白AFP。采用PCR法扩增编码AFP蛋白的cDNA序列片段,并将其克隆到含有His-tag的pET22b原核表达载体上;重组质粒经双酶切及测序鉴定正确后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达;对诱导过程中不同浓度的IPTG和不同的温度进行优化;选定最佳的优化条件进行诱导表达目的蛋白;SDS-PAGE电泳和Western Blot法鉴定表达产物。结果表明,通过PCR扩增技术获得了编码AFP蛋白的基因片段;重组质粒经双酶切和基因测序等方法鉴定后,确认了重组质粒已经构建成功;表达产物通过利用SDS-PAGE和Western Blot法检测到在66 kDa附近出现条带,与预期值相符,表明重组AFP蛋白已成功表达。     

人甲胎蛋白 AFP 在大肠杆菌中表达和鉴定

本研究通过应用基因工程技术,重组构建编码人全长甲胎蛋白AFP基因的原核表达载体pET22b-AFP,并将其转化到大肠杆菌宿主菌BL21（DE3）中进行诱导表达目的蛋白AFP。采用PCR法扩增编码AFP蛋白的cDNA序列片段,并将其克隆到含有His-tag的pET22b原核表达载体上;重组质粒经双酶切及测序鉴定正确后转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行IPTG诱导表达;对诱导过程中不同浓度的IPTG和不同的温度进行优化;选定最佳的优化条件进行诱导表达目的蛋白;SDS-PAGE电泳和Western Blot法鉴定表达产物。结果表明,通过PCR扩增技术获得了编码AFP蛋白的基因片段;重组质粒经双酶切和基因测序等方法鉴定后,确认了重组质粒已经构建成功;表达产物通过利用SDS-PAGE和Western Blot法检测到在66 kDa附近出现条带,与预期值相符,表明重组AFP蛋白已成功表达。     

嗜酸乳杆菌zrx02的plnD基因克隆及生物信息学分析

目的:对zrx02嗜酸乳杆菌细菌素编码基因进行克隆与序列分析。方法:对分离出的菌株进行16S rRNA鉴定,并根据已报道的plnD编码产物基因设计引物,以该菌基因组DNA为模板进行PCR扩增和测序,利用Pro Param tool,TMHMM等在线软件对编码蛋白进行生物信息学分析。结果:该菌为嗜酸乳杆菌,命名为嗜酸乳杆菌zrx02,该菌含有plnD基因,通过与Gen Bank中相关的抗菌素基因进行比对,发现其基因序列与Gen Bank库中的Lactobacillus plantarum strain（WP 016526896.1）plnD gene的同源性达到100%。生物信息学分析显示该基因全长355 bp,编码92个氨基酸,相对分子量10.54 ku,理论等电点9.26,该基因编码蛋白是稳定蛋白,不具有明显的跨膜结构,二级结构主要有α-螺旋、无规则卷曲和延伸链组成,三级结构结果显示plnD蛋白模型与Streptococcus pneumoniae中的ComE同源性最高。结论:对嗜酸乳杆菌zrx02 plnD基因的克隆与分析,为进一步探究细菌素的形成机制奠定理论基础。      

基于蛋白损伤污染物毒性评价的luxCDABE生物发光载体的构建

目的构建含完整lux CDABE基因盒的PUCD-dna K重组发光载体,用于对蛋白损伤污染进行毒性评价。方法用PCR法从大肠杆菌W3110中扩增dna K基因,将PCR产物测序后与Gen Bank中dna K序列进行BLAST比对。将dna K片段及PUCD615载体均用Bam H I、Eco R I双酶切,连接后电转化导入宿主菌JM109。挑取克隆,提取质粒用PCR鉴定,阳性克隆再进行测序。结果 dna K基因PCR扩增产物得到206 bp片段,PCR产物测序后BLAST比对同源性为100%,表明扩增序列正确。PUCD-dna K测序结果表明序列含有dna K基因及PUCD615载体上的基因,且与载体连接处正确地出现对应的酶切位点。结论 PUCD-dna K载体构建成功。含lux CDABE全基因盒作为报告基因的载体PUCD615可克服lux AB必须外加底物(脂肪醛)才能实现生物发光的缺点,通过优化连接及转化条件,可将大片段的PUCD615载体与短片段的插入序列连接成功,构成重组载体。     

链霉菌MY0504纤溶酶YG4基因的克隆及生物信息学分析

本研究获得了海洋链霉菌MY0504纤溶酶YG4基因,并对其进行生物信息学分析。利用依据同源序列设计的兼并引物,对提取的链霉菌MY0504的基因组DNA进行PCR扩增,将得到的DNA片段连接到pMD18-T载体后转化感受态Trans10细胞,然后对阳性克隆进行测序,并对序列进行生物信息学分析。最终克隆了1083bp的海洋链霉菌MY0504纤溶酶YG4基因。将获得的YG4基因输入Gen Bank网站,进行检索比对,结果显示与丝氨酸蛋白酶基因碱基序列同源性100%。对16s rDNA序列分析结果表明,该菌株与达格斯地链霉菌、氢化链霉菌、嫩白黄链霉菌、浅紫链霉菌的亲缘关系较近;通过对YG4基因编码蛋白的一级结构、二级结构、亚细胞定位和三级结构的预测和分析,结果表明:该基因编码360个氨基酸,其编码产物为稳定的亲水蛋白;二级结构以α螺旋和β折叠为主,无信号肽和跨膜结构域,有40个磷酸化位点;高级结构以无规则卷曲为主。本研究结果为研究海洋链霉菌MY0504纤溶酶YG4基因的表达机制及目的蛋白表达水平的提高提供了重要信息。     

假单胞菌SP-6胞外弹性蛋白酶基因的克隆与表达

以分离筛选、鉴定的假单胞菌为研究材料,提取假单胞菌的基因组为模板基因,设计引物进行PCR扩增.扩增的条件为94℃预变性4min,98℃变性10 s,58℃退火1min,72℃延伸2min,35个循环,72℃复性10min.用试剂盒回收PCR产物,以PGEM-T Easy Vector为载体,产生重组质粒,转化到大肠杆菌(E.coli)JM109细胞中,于LB平板上进行蓝白筛选阳性克隆.提取阳性克隆的质粒,电泳筛选滞后质粒,EcoRⅠ酶切验证后进行测序,检测弹性蛋白酶基因在JM109 E.coli细胞中的表达.结果表明PCR扩增出1.67 kb的基因片段,并成功克隆在E.coliJM109细胞中;挑取白斑提取的质粒,检测有滞后质粒,EcoR Ⅰ酶切检测到3.0 kb的载体和1.67 kb的基因片段;以滞后质粒为模板再次进行PCR扩增,扩增出1.67 kb基因片段,证明该质粒为重组质粒,经上海博亚生物技术公司测序为1.67 kb的基因片段,并在E.coliJM109细胞中表达.     

GDHt-β亚基基因的套式PCR扩增及其DNA测序

采用套式PCR技术，从肺炎克氏杆菌A．S．1．1736基因组中扩增编码GDHt-β亚基基因，对目的基因进行测序并应用生物信息学进行序列分析，结果扩增出约585 bp的目的DNA片段，经GenBank检索对照分析，该基因序列与国外文献报道的同源性达99．34%，表明成功地获得编码GDHt-β亚基的基因，为进一步研究该亚基的结构与生物学功能奠定了基础。     

转基因产品中常见外源基因的克隆与转化

设计带不同酶切位点的引物,分别用PCR扩增植物内源rbcL基因和2种转基因产品中常见的外源基因-CP4-EPSPS基因和BAR基因,并分别与pGEM-TEasyVector连接,克隆到大肠杆菌DH5α中。提取克隆菌落的质粒,并进行酶切鉴定和序列测定。对3个基因的克隆质粒进行相应的双酶切,回收酶切产物,先后转化到受体载体pCAMBW中。最后获得的重组质粒的酶切和PCR鉴定结果表明3个基因已被成功转化到受体载体中。     

黑曲霉XZ-3S木聚糖酶Xyn ZF-1基因克隆和序列分析

利用RT-PCR技术从黑曲霉XZ-3S中扩增并克隆了木聚糖酶(Xyn ZF-1)基因的cDNA片段,测序结果表明,Xyn ZF-1基因核苷酸序列阅读框全长678bp,编码225个氨基酸,推测分子量为24.06ku,等电点为5.20。以XZ-3S基因组DNA为模板扩增Xyn ZF-1的DNA序列,该序列仅存在一个内含子,长度为68bp。成熟肽基因推导的氨基酸序列与其他微生物来源的木聚糖酶一级结构进行比较,同源性最高达到了89.47%。系统进化树分析该酶属于G/11族糖基水解酶。又进一步对Xyn ZF-1二级结构进行了分析,并通过SWISS-MODEL预测了该酶的三维结构。     

基于CRISPR/Cas9系统的金针菇基因组编辑载体构建

采用高效基因编辑系统CRISPR/Cas9,构建金针菇基因Mads-8敲除载体及转化体系。以转录组数据为依据,通过分析基因Mads-8序列信息,选择高效的靶位点序列,同时加入筛选标记基因hph构建过渡载体sgRNA-T,通过菌落PCR鉴定和测序来验证靶位点序列是否正确插入。以表达载体pg Fvs-cas9为框架,酶切连接后构建重组敲除载体pg Fvs-Cas9-gRNA,PCR和酶切鉴定敲除载体。再以PEG介导的金针菇原生质体转化表达载体,在潮霉素抗性平板上筛选拟转化子,以拟转化子基因组DNA为模板扩增Cas9基因。结果显示,靶位点序列成功插入敲除载体且序列正确,重组质粒成功转化进金针菇的基因组。对金针菇基因组敲除载体的构建,为后续金针菇相关基因的功能验证及育种研究提供载体材料及理论依据。