弱后酸化保加利亚乳杆菌突变株与亲本菌株H+-ATPase基因的相似性比较

为了确定德氏乳杆菌保加利亚亚种H+-ATPase的调控机制,以H+-ATPase缺陷的德氏乳杆菌保加利亚亚种突变菌株和亲本菌株KLDS1.9201作为研究对象.首先分别提取亲本和突变菌株的基因组DNA,随后利用PCR的方法扩增出H+-ATPase蛋白的全部编码基因并测序,最后利用DNAMAN软件比较亲本和突变菌株的H+-ATPase的相似性.结果表明亲本和突变菌株H+-ATPase编码基因的相似性为100％.H+-ATPase缺陷的德氏乳杆菌保加利亚亚种突变菌株KLDS1.9201-11和亲本菌株KLDS1.9201的H+-ATPase活力之间的差异并不是由于编码基因发生了突变,可能是转录水平的降低导致H+-ATPase酶蛋白的表达量降低,进而影响酶活力.为进一步研究德氏乳杆菌保加利亚亚种H+-ATPase的调控机制奠定了基础.     

长双歧杆菌C16 bif黏附基因敲除菌株的构建

长双歧杆菌是定植于人体肠道中的优势菌株,与人体肠道健康密切相关。黏附是长双歧杆菌定植于肠道的前提,研究长双歧杆菌的黏附机制尤为重要。bif黏附基因作为长双歧杆菌的一类胞外黏附因子,其敲除后黏附效力是否丧失尚未明确。本试验利用同源重组技术,以长双歧杆菌为研究对象,构建bif黏附基因敲除突变株,验证该基因的黏附作用。首先以长双歧杆菌C16基因中的bif黏附基因和PBR322为模版,扩增bif黏附基因上、下游同源臂和tet抗性基因,然后分别将它们连接到pMD19-t simple Vecter上,对中间载体pMD19-up、pMD19-down、pMD19-tet进行双酶切,并将回收片段连接到PUC18上构成敲除载体PUC18-up-tet-down。通过电转化的方式导入宿主菌株中,利用同源重组筛选获得长双歧杆菌bif黏附基因缺失菌株。菌落PCR和测序结果均显示bif黏附基因敲除菌株构建成功,为进一步研究长双歧杆菌bif基因的黏附作用奠定基础。     

德式乳杆菌保加利亚亚种thyA基因缺陷型菌株的构建

目的:获得由插入序列ISS1构建的德式乳杆菌保加利亚亚种胸腺嘧啶合成酶thy A基因缺陷型菌株。方法:利用两端带有ISS1的载体p Ghost9:ISS1,经复制型转座构建突变体,以50μg/m L脱氧胸苷、梯度浓度三甲氧苄胺嘧啶(TMP)连续富集传代培养,以添加终质量浓度50μg/m L脱氧胸苷的SA平板以及未添加脱氧胸苷的SA平板筛选thy A基因缺陷型菌株。结果:获得生物学性状稳定,回复突变率低的thy A基因插入突变株。     

植物乳杆菌降胆固醇Lp10菌株的rhaD基因敲除株的构建

以转录组数据为依据推测植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中rhaD基因参与胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)合成代谢中的鼠李糖代谢过程,从而通过调节胞外多糖合成并利用其吸附作用达到降胆固醇效果。为了进一步验证rhaD基因的功能,本论文研究利用同源重组技术,构建rhaD基因敲除载体,采用电击转化方法将构建的敲除载体导入植物乳杆菌Lp10菌株感受态细胞,并在抗性平板上筛选转化子,以转化子的基因组DNA为模板进行PCR及测序鉴定,再利用邻苯二甲醛法测定突变株与初始菌株的降胆固醇能力。结果表明,敲除载体pNZ5319-rhaD被成功构建,测序结果显示rhaD基因被成功敲除;敲除菌株的降胆固醇能力略有上升。本论文研究结果不仅为植物乳杆菌基因敲除载体的构建提供了实验技术支持,同时为植物乳杆菌降胆固醇相关功能基因的验证分析奠定了理论依据。     

四川泡菜中植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因克隆与表达

目的:对植物乳杆菌中亚硝酸盐还原酶基因进行克隆并表达,并测定酶的活力。方法:根据Gen Bank中亚硝酸盐还原酶(NIR)基因序列,设计引物。提取植物乳杆菌的DNA,采用PCR技术扩增nir基因,TA克隆构建获得重组质粒p MD19-nir,分析其核苷酸序列同源性。通过双酶切连接到表达载体p ET-32a(+)中,获得重组表达载体p ET-32a-nir,构建成功后转化到E.coli BL(DE3)中进行表达研究。经IPTG诱导表达,得重组蛋白,超声波破碎,提取粗酶液,测定酶活力。结果:克隆的目的基因序列长度为1638 bp。获得重组蛋白分子量为80 ku,酶活力为4.2 U/mg。结论:成功克隆了植物乳杆菌中的亚硝酸盐还原酶基因,成功的导入到E.coli BL(DE3)中,表达产物有酶活。     

同源重组法构建副干酪乳杆菌组氨酸蛋白激酶基因缺失突变株

构建副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)组氨酸蛋白激酶prcK基因缺失突变株,为prcK基因功能研究提供实验工具。采用同源重组技术构建质粒p KLKRT(含prcK::Tet~r基因),将其电转化进入L.paracaseiHD1.7中,使prcK::Tet~r基因同源重组到L.paracasei HD1.7的染色体上,通过四环素耐药、氨苄青霉素敏感等特性筛选出含有prcK::Tet~r基因的新L.paracasei HD1.7。结果表明,经聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)验证及酶切验证后确定质粒p KLKRT构建成功,并成功转化入L.paracasei HD1.7中,经PCR确认L.paracasei HD1.7 prcK基因缺失突变株构建成功。该突变株产生的细菌素效价比出发菌株低23.61%。采用同源重组方法成功构建L.paracasei HD1.7 prcK基因缺失突变株,为研究L.paracasei HD1.7群体效应相关基因的分子机理奠定基础。     

干酪乳杆菌yhaI基因敲除菌株的构建及其耐药表型的分析

为了深入研究干酪乳杆菌Zhang在抗生素环境中适应性进化机制,构建yhaI基因敲除体系,并对突变体的耐药表型进行研究。运用PCR技术分别扩增yhaI基因的同源臂序列,构建带有内部缺失yhaI基因的敲除载体。采用Cre/lox基因重组系统,筛选双交换子L.casei Zhang-G-1200-yhaI::lox66-P32-cat-lox71,构建突变株L.casei Zhang-G-1200-Che yhaChe I,通过稀释法研究突变株的耐药表型。通过PCR和PCR产物经测序验证,yhaI基因缺陷的菌株构建成功。耐药表型结果表明,突变株在庆大霉素浓度为8和16 μg/mL时,浊度变为原始菌株的1/2;在庆大霉素浓度为16 μg/mL时,活菌数变为原始菌株的7/10。成功构建干酪乳杆菌Zhang的基因敲除体系,为研究干酪乳杆菌Zhang的基因功能提供了技术平台。     

干酪乳杆菌yhaⅠ基因敲除菌株的构建及其耐药表型的分析

为了深入研究干酪乳杆菌Zhang在抗生素环境中适应性进化机制,构建yha I基因敲除体系,并对突变体的耐药表型进行研究。运用PCR技术分别扩增yha I基因的同源臂序列,构建带有内部缺失yha I基因的敲除载体。采用Cre/lox基因重组系统,筛选双交换子L.casei Zhang-G-1200-yha I::lox66-P32-cat-lox71,构建突变株L.casei Zhang-G-1200-Che yhaChe I,通过稀释法研究突变株的耐药表型。通过PCR和PCR产物经测序验证,yha I基因缺陷的菌株构建成功。耐药表型结果表明,突变株在庆大霉素浓度为8和16μg/m L时,浊度变为原始菌株的1/2;在庆大霉素浓度为16μg/m L时,活菌数变为原始菌株的7/10。成功构建干酪乳杆菌Zhang的基因敲除体系,为研究干酪乳杆菌Zhang的基因功能提供了技术平台。     

德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株自溶活性的比较研究

采用核酸溶出检测法检测了德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株在不同生长阶段下的自溶活性变化,并比较了12株菌株在对数生长中期的自溶活性差异。结果表明,德式乳杆菌保加利亚亚种对数生长期的菌体细胞自溶活性最高,稳定期和衰退期的菌体细胞自溶活性依次降低;不同菌株在对数生长中期的自溶活性差异显著,筛选到3株高自溶活性菌株和4株低自溶活性菌株;扫描电镜观察显示高自溶活性菌株自溶菌体细胞表面出现孔洞,而低自溶活性菌株自溶菌体细胞表面出现轻微萎缩。本研究为德氏乳杆菌保加利亚亚种自溶活性的调控和改造以及开发优良酸乳发酵剂提供了理论依据。     

德式乳杆菌保加利亚亚种的乳清蛋白利用能力比较

为了探究德式乳杆菌保加利亚亚种对乳清蛋白的利用能力,研究了8株德式乳杆菌保加利亚亚种菌株在乳清蛋白培养体系中的生长和产酸情况,发酵过程中氨肽酶Pep N、Pep C和Pep X活力变化及乳清蛋白主要组分β-乳球蛋白、α-乳白蛋白和牛血清白蛋白的利用情况,探讨了不同菌株氨肽酶活力变化与乳清蛋白水解能力之间的相关性。结果表明,在乳清蛋白培养体系中,最适宜菌株生长的初始p H是5. 5,该条件下菌株在3 h内快速生长到达稳定期。在发酵过程(12 h)中,3种氨肽酶活力均表现出先升高后降低的变化趋势,但不同菌株的酶活力之间存在显著差异性。8株菌株均表现出对α-乳白蛋白较强的水解能力(26. 93%～31. 33%),但对于β-乳球蛋白的水解能力存在菌株差异性,β-乳球蛋白的变异体A和B的水解率分别是10. 56%～22. 82%和9. 04%～23. 83%。菌株的氨肽酶活力与β-乳球蛋白的水解能力之间存在一定相关性,DQHXNS8L6和DQHXNS15M2在3 h内即能达到最高的氨肽酶活力并有效水解β-乳球蛋白,具有发酵乳清蛋白饮料的应用潜力。     

苯丙氨酸生物合成的整体代谢网络调控基因的敲除

csrA基因产物是大肠杆茵芳香族氨基酸生物合成途径中碳中心代谢有关的一种全局性调控蛋白质.采用Red敲除系统介导的同源重组的方法定位缺失大肠杆茵染色体csrA基因,经PCR、DNA测序等多种方法证实了基因剔除的可靠性.csrA基因剔除后,大肠杆菌芳香族氨基酸生物合成中受csrA表达产物负调控的关键酶的酶活力有所提高,而正调控的关键酶基因活性降低,突变菌株发酵生产苯丙氨酸的能力提高近13％.     

瘤胃中干酪乳杆菌的亚油酸异构酶基因的克隆与表达

以从黄牛瘤胃中分离到的一株具有将亚油酸转化为c9,t11-共轭亚油酸(conjugated linoleic acid,CLA)的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Fx为出发菌株,提取其基因组DNA,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增得到1 700 bp大小的亚油酸异构酶(linoleic acid isomerase,LAI)基因片段,将该基因片段纯化后进行TA克隆,得到重组质粒p UCm-T-LAI,将重组质粒p UCm-T-LAI和表达质粒p ET-Dsb A同时进行双酶切,连接得到重组表达载体p ET-Dsb A-LAI,经PCR鉴定和酶切后,将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21中,得到具有LAI活性的重组菌株,能将亚油酸转化为c9,t11-CLA,表明从Lactobacillus casei Fx成功克隆LAI,该研究将有助于深入了解不同瘤胃细菌特异性合成不同CLA异构体的LAI基因差异。     

一种XRE家族转录调节因子对干酪乳杆菌适应抗生素环境的影响

为了深入研究干酪乳杆菌Zhang(Lactobacillus casei Zhang,L. casei Zhang)在抗生素环境中适应性进化机制,构建基因敲除体系,并对突变体的耐药表型进行研究。运用PCR技术分别扩增XRE家族转录调节因子基因的同源臂序列,构建带有内部缺失LCAZH_0458基因的敲除载体。采用Cre/lox基因重组系统,筛选双交换子L. casei Zhang-G/A-1200/600-0458::lox66-P32-cat-lox71,构建突变株L. casei Zhang-G/A-1200/600_Δ0458。此外,作者通过稀释法研究了野生菌株和突变株的耐药表型。耐药表型结果表明,与野生菌株相比,突变株在庆大霉素质量浓度为8μg/mL和16μg/mL时,浊度提高约2倍。在阿莫西林环境下,浊度和活菌数均未发生改变。LCAZH_0458对干酪乳杆菌适应庆大霉素环境有一定的调节作用。     

spo0A基因缺失对克劳氏芽孢杆菌发酵生产性能的影响

通过基因敲除的方法构建spo0A基因缺失菌株,并评价spo0A基因缺失对克劳氏芽孢杆菌（Bacillus clausii）QL-1发酵生产性能 的影响。 经重叠延伸PCR和基因同源单交换技术,获得spo0A基因缺失突变株B. clausii QL-1△spo0A;通过系统比较spo0A基因敲除前 后芽孢生成率、生物量及淀粉酶酶活的改变,发现B. clausii QL-1△spo0A菌株不产芽孢、生物量提高了24%,且B. clausii QL-1△spo0A 发酵72 h淀粉酶酶活为1.58×105 U/g,淀粉酶活提高83.72%。 说明克劳氏芽孢杆菌spo0A基因缺失对菌体生物量、芽孢生成率及代谢 产物的生成等具有重要影响。     

天门冬酰胺酶基因在黑曲霉中的同源表达

根据NCBI中的黑曲霉天门冬酰胺酶基因asp序列(GI:145231287)设计特异性引物,从黑曲霉CICC2462基因组中扩增asp基因编码区,构建其黑曲霉表达载体p SZHG-Asp。通过农杆菌介导法转化黑曲霉,筛选以asp基因置换糖化酶基因gla A的同源重组转化子。对转化子的表达产物进行SDS-PAGE分析和酶活检测。获得8株在gla A位点发生基因置换的同源重组转化子,并对其中4株的上清液进行检测。SDS-PAGE结果显示,在42 000处有目的蛋白质条带,重组菌株的目的蛋白质表达量为185~417μg/m L,发酵液最高酶活为21 111 U/m L。     

同源片段长度对副干酪乳杆菌同源重组频率的影响

目的:探索同源片段大小与副干酪乳杆菌同源重组率之间的关系。方法:分别构建以氨苄青霉素和四环素抗性标记基因为遗传转化筛选标记的,用于敲除prc K,prc R基因的4个同源重组质粒p2NIL-KA(625 bp,650bp),pUC18-KT(1 350 bp,1 350 bp),p2NIL-RT(433 bp,474 bp),pUC18-RT(1 350 bp,1 350 bp),并分别电转化于副干酪乳杆菌HD1.7感受态细胞中,检测筛选同源重组转化子,计算发生同源重组的频率。结果:成功构建同源重组质粒,p2NIL-KA(625 bp,650 bp),pUC18-KT(1 350 bp,1 350 bp),p2NIL-RT(433 bp,474 bp),pUC18-RT(1 350 bp,1 350 bp)同源重组频率分别为0,1.85%,0,1.78%。结论:当同源片段长度为1 350 bp或更长时,可与副干酪乳杆菌染色体进行同源重组。     

植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因在大肠杆菌中表达

构建乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因的重组质粒并表达。以植物乳杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增亚硝酸盐还原酶基因,连接到表达载体pET-32a(+)上,构建的重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,菌体总蛋白经SDS-PAGE鉴定显示重组质粒诱导表达产物有特异性蛋白条带。该表达产物经细菌亚硝酸盐还原酶试剂盒测定显示有明显的酶活性。实验结果为深入研究植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶提供有益的参考。     

启动子替代构建克雷伯氏菌普鲁兰酶高产菌株

应用启动子替代技术将普鲁兰酶产生菌克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)HN9的普鲁兰酶基因的启动子替换为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的P43启动子,构建高产酶菌株。通过融合PCR,将由3个DNA片段融合得到启动子替代同源重组片段,该3个DNA片段分别是带有克雷伯氏菌普鲁兰酶基因启动子上游部分同源序列的四环素抗性基因(Tet)的上游片段Tet1、带有枯草芽孢杆菌P43启动子部分上游同源序列的Tet下游片段Tet2和带有克雷伯氏菌普鲁兰酶基因上游同源序列的P43启动子部分序列的Pro。经电转化将同源重组片段导入克雷伯氏菌中,转化子的普鲁兰酶基因表达水平比出发菌株提高10.23~11.45倍,摇瓶发酵酶活力提高8.97~10.52倍。结果表明,应用高效组成型启动子P43替代原始菌株的普鲁兰酶基因的启动子能够显著提高普鲁兰酶基因的表达量和发酵酶活力。     

基于尿嘧啶磷酸核糖转移酶为负向筛选标记的生酮古龙酸杆菌基因组无痕修饰系统的构建

通过构建尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因(upp)敲除打靶质粒,采用同源重组的方法获得了生酮古龙酸杆菌(Ketogulonigenium vulgare)的upp基因缺失突变株K.vulgareΔupp,可作为基因组无痕修饰系统底盘细胞的upp基因表达载体,转化突变株K.vulgareΔupp,获得upp基因回补菌株PBB-upp,并验证了upp作为负向筛选标记的可行性。实验结果表明:突变株Δupp在1 mg/m L的5-氟尿嘧啶培养基上可生长,野生型和回补菌株PBB-upp不能生长,3株菌对5-氟尿嘧啶的抗性存在显著差异,说明可以将upp基因作为负向筛选标记,与正向筛选标记相结合,在upp基因缺失的底盘细胞基础上通过两次同源重组,实现基因组的无痕修饰与改造。     

多重耐药维氏气单胞菌porin基因敲除的构建及其耐药特性研究

目的 研究微孔蛋白基因porin对维氏气单胞菌(Aeromonas veronii,A. veronii)耐药性的影响以解析A. veronii的耐药机制。方法 以多重耐药的A. veroniiWL-3为研究对象,采用同源重组双交换的方法构建Δporin敲除株,利用比浊法测定其生长曲线,通过药敏纸片法分析其耐药性。结果 以A. veronii WL-3基因组DNA为模板,利用overlap聚合酶链式反应技术扩增获得上下同源臂融合片段,并连接至自杀质粒pDM4中,重组成敲除质粒pDM4-Δporin。将pDM4-Δporin转化至感受态大肠杆菌SM10中,通过接合转移转入A. veronii WL-3中。通过同源重组双交换构建A. veronii WL-3Δporin敲除株。生长曲线显示与野生株相比,Δporin菌株的生长速度并无明显变化;抗生素耐药特征分析显示敲除porin基因会降低A. veronii对头孢氨苄、新霉素、四环素、环丙沙星等10种抗生素的敏感性,提高对多粘菌素B的敏感性。结论 基因porin不是A. veronii生长所必需的,但会影响A. veronii对部分抗生素的...