多基因整合型载体转化酿酒酵母生物合成白藜芦醇

目的:以整合型载体p RS303K为框架,以来源于拟南芥的4-香豆酰辅酶A连接酶基因(4cl)和巨峰葡萄的白藜芦醇合酶基因(rs)为目标基因,采用一步等温法构建了表达白藜芦醇的整合型酵母表达载体p RS303KT4C-TRC。方法:采用Li Ac/SS carrier DNA/PEG转化法把表达载体成功转化酿酒酵母工业型菌株EC1118,经筛选和PCR鉴定获得酵母工程菌株EC1118-303K-T4C-TRC。酵母工程菌株采用添加和不添加抗生素的发酵培养。结果:在培养基添加抗生素和不加抗生素的发酵液中白藜芦醇的含量分别为3.4110 mg/L和3.4710 mg/L,两者差异不显著。结论:两个关键酶基因成功整合到酵母的染色体基因组中并得到表达,工程菌株在传代中不受选择压力影响,稳定组合表达白藜芦醇。     

白藜芦醇在酿酒酵母中的组合表达

将克隆自拟南芥的4cl基因和巨峰葡萄的rs基因,利用降落重叠延伸PCR的方法,成功构建了含有G418抗性筛选标记的酵母表达载体pRS42K-4CL以及含有潮霉素抗性筛选标记的酵母表达载体pRS42H-RS。采用LiAc/SS carrier DNA/PEG法将含有目的基因的2个载体共同转化至酿酒酵母工业菌株EC1118中,通过PCR及酶切鉴定等方法验证重组工程菌。以对香豆酸为底物,将获得的酿酒酵母工程菌于YPD液体培养基中发酵(25℃,150 r/min,96 h),发酵液用乙酸乙酯抽提后采用高效液相色谱(HPLC)法进行检测,其结果显示发酵产物中白藜芦醇的含量为0.78 mg/L。这表明,拟南芥的4cl基因与巨峰葡萄的rs基因在酿酒酵母工程菌中成功得到了表达,并且表达产物利用对香豆酸为前体物质合成了目标产物白藜芦醇。该研究为进一步实现白藜芦醇在酵母中的工业化生产奠定了基础。     

重组酿酒酵母合成白藜芦醇的研究

为了获得一种酵母快速合成白藜芦醇的体系,本研究分别从虎杖和烟草中克隆获得白藜芦醇合成途径的关键酶基因:芪合酶基因STS和4-香豆酰辅酶A连接酶基因4CL,引入3个连续重复的GSG作为连接肽,采用Overlap PCR扩增技术构建了融合基因4CL-(GSG)3-STS,进一步获得重组表达载体p ESC-TRP-4CL-(GSG)3-STS后转化至酿酒酵母中,之后利用HPLC分析检测重组酿酒酵母代谢产物,最后对重组菌合成白藜芦醇的诱导时间、底物添加浓度和添加方式进行了优化研究。结果表明:所构建的重组酿酒酵母菌体生长48 h后进行诱导表达,同时添加浓度为6 mg/L底物4-香豆酸,并且每隔2 h添加一次,8 h后白藜芦醇产量即可达7.01 mg/L。利用本体系合成白藜芦醇具有操作简单、生产周期短的特点,为进一步实现微生物大规模生产白藜芦醇提供了基础。     

高产β-葡萄糖苷酶工程菌株的构建及其在2,6-二甲氧基对苯醌发酵制备中的应用

构建高产β-葡萄糖苷酶的工程菌株并将其应用到2,6-二甲氧基对苯醌的发酵制备中。通过聚合酶链式反应从酿酒酵母CS1401的总DNA中扩增得到β-葡萄糖苷酶基因,并与载体p PICZαA连接后导入毕赤酵母X33中进行甲醇诱导表达;对表达成功的重组菌株进行β-葡萄糖苷酶活力测定;同时将酿酒酵母CS1401和重组菌株接种到小麦胚芽培养基中进行发酵并测定2,6-二甲氧基对苯醌的发酵产量。结果表明,酿酒酵母CS1401的β-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母X33工程菌株中得到高效表达,酶活力达到4.5 U/m L,为酿酒酵母CS1401的5倍;2,6-二甲氧基对苯醌的摇瓶发酵产量达到935.7 μg/g,比酿酒酵母CS1401提高了0.4倍。因此,高产β-葡萄糖苷酶的重组工程菌株在2,6-二甲氧基对苯醌的发酵制备中具有一定的应用前景。     

热带假丝酵母木糖还原酶在酿酒酵母细胞表面展示

利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表面展示系统,将来源于热带假丝酵母(Candida tropicalis)的木糖还原酶基因xyl1嵌入带有His-Tag的酿酒酵母α-凝集素展示载体pICAS-His,构建重组质粒pICAS- His-Ctxyl1,并转化到酿酒酵母宿主菌酿酒酵母MT8—1,通过流式细胞仪快速检测和筛选,得到重组菌株MT8- 1/pICAS-His—Ctxyl1。将重组酵母用于葡萄糖(15g/L)和木糖(5g/L)的混合糖发酵研究,结果表明,重组酿酒酵母MT8/1/pICAS-His—Ctxyl1细胞具有良好的生长和产酶特性,同时能转化木糖生产木糖醇,在培养基中2.5g/ L木糖转化生成2.5g/L木糖醇,转化率达98.7%。     

不同酵母提升霞多丽葡萄酒品质的对比分析

本文研究了CEC01、EC1118、Str不同酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)对霞多丽酿酒葡萄品质的影响。霞多丽酿酒葡萄经过采摘、分选、除梗、压榨、成分调整、静置、活化酵母(CEC01、EC1118、Str)、酒精发酵、分离倒罐、澄清、密闭储存传统酿造工艺酿造,进行感官评价,检测分析常规理化指标、香气物质。结果表明,酿酒酵母CEC01酿造葡萄酒感官质量总分82.00分高于酿酒酵母EC1118、Str总分。说明CEC01酿造的葡萄酒感官质量较佳。酿酒酵母CEC01酿造的霞多丽干白葡萄酒的残糖为1.50g/L低于酿酒酵母EC1118、Str残糖,酒精度为12.90%vol高于酿酒酵母EC1118、Str酒精度。酿酒酵母CEC01发酵过程中平均总酸、平均总酚含量呈降低趋势,说明其在降酸方面发挥着重要作用。酿酒酵母CEC01酿造葡萄酒醇类香气物质相对含量为62.83%,酸类香气物质相对含量为1.45%,酯类香气物质相对含量为35.68%。酿酒酵母EC1118、Str酿造葡萄酒醇类香气物质相对含量为75.48%、78.62%,酸类香气物质相对含量为2.33%、1.58%,酯类香气物质相对含量为22.17%、19.73%,CEC01葡萄酒感官质量最佳。     

新疆无核白葡萄酿制葡萄酒的研究

以无核白葡萄为原料,在葡萄净汁和带皮渣中分别添加DV10、EC1118、SB 3种酵母,发酵制备无核白葡萄酒。通过感官评价和理化指标检测,分析比较了发酵原料和选用酵母对无核白葡萄酒品质的影响,结果表明:无核白葡萄净汁经EC1118酵母发酵,酒中单宁(2.13 g/L)、总酚(2.21 g/L)、挥发酸(0.21 g/L)的含量较低,总酸(4.88 g/L)和干浸出物(22.25 g/L)的含量较高,酒色呈浅禾杆黄色,澄清透明,酒香与果香融合、口感协调柔和,典型性突出,制成的无核白葡萄酒品质好。     

粘红酵母酪氨酸解氨酶在大肠杆菌中的异源表达

酪氨酸解氨酶是苯丙氨酸代谢途径的关键酶之一。酪氨酸经其催化生成对香豆酸,可进一步生成白藜芦醇、柚皮素等具有抗氧化、抗衰老作用的苯丙素类天然产物。作者选取来源于粘红酵母(Rhodotorula glutinis)的酪氨酸解氨酶,对其基因进行大肠杆菌(Escherichia coli)密码子偏好性优化,合成基因后于E.coli BL21(DE3)中成功表达。经过硫酸铵分级沉淀、QFF阴离子交换层析、分子筛纯化后得到了纯化的酪氨酸解氨酶,比酶活达到1.78 U/mg。在相同的培养条件下,以不同的质粒作为表达载体,获得了不同的对香豆酸产量。其中以酪氨酸为底物发酵24 h,当以p ET-32a(+)作为表达载体时,获得最高的对香豆酸产量196.3 mg/L。经密码子优化后的酪氨酸解氨酶基因可更好地应用于苯丙素类物质的合成途径构建,不同载体的应用也为生物法生产对香豆酸提供了更多的选择依据。     

生物合成对香豆酸大肠杆菌工程菌的构建

对香豆酸是一种具有预防心血管疾病、抗氧化和抗菌消炎等生物活性的酚类物质,同时,它也是高价值苯丙烷类保健营养品(如白藜芦醇)的前体。本研究希望创制出一种生物合成对香豆酸的方法,以缓解对香豆酸的供求问题。把带有粘红酵母(Rhodotorula glutinis)酪氨酸解氨酶(Rg TAL)基因的组成型表达载体转化大肠杆菌ATCC31884,并通过PCR鉴定后,获得重组菌株。对重组菌株进行发酵培养,对发酵液进行高效液相色谱检测,确定工程菌具有生物合成对香豆酸的能力。随后通过优化L-酪氨酸的添加量和工程菌的发酵时间,最终确定,底物L-酪氨酸的添加量为0.5 m M,发酵时间为36 h,检测发酵液中的对香豆酸含量最高,为161.23 mg/L。这表明,Rgtal基因在重组大肠杆菌中成功得到了表达,并且能利用自身代谢和外源添加的L-酪氨酸生物合成对香豆酸。     

在酿酒酵母中共表达sXYLA和XKS1及木糖发酵的初步研究

为改善重组酵母发酵木糖生产乙醇的能力,将定点突变改造后的Thermus thermophilus木糖异构酶基因sXYLA克隆到酵母表达载体pYX212并用于转化酸酒酵母Saccharomyces cerevisiae YPH499进行表达研究。酶活检测表明,改造后的木糖异构酶活性是未改造的1.91倍。在此基础上将改造后具有良好特性的木糖异构酶基因sXYLA和来自酸酒酵母的木酮糖激酶基因XKS1耦联,构楚得到重组表达质粒pYX-sXYLA- XKS1,在酿酒酵母YPH499中实现组成型共表达。结果表明,在84 h时重组菌发酵液酶活达到最高,木糖异构酶为0.624 U/mg蛋白,木酮糖激酶为0.688 U/mg蛋白。以葡萄糖和木糖为混合碳源初步进行半通氧发酵,代谢产物分析表明酸酒酵母重组菌木糖的消耗为4.75 g/L,乙醇的产量为0.839 g/L,分别比出发菌提高20.9%和14.8%,为酿酒酵母利用木糖发酵乙醇奠定基础。     

重组枯草芽孢杆菌分泌表达腺苷酸脱氨酶

目的：利用基因重组技术,构建腺苷酸脱氨酶高效表达的重组菌株。方法：以前期构建的产腺苷酸脱氨酶重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET28α-AMPD中来源于鼠灰链霉菌（Streptomyces murinus）目的基因为模板,设计特异性引物扩增腺苷酸脱氨酶基因,亚克隆至游离型表达载体pHY-WZX,转化枯草芽孢杆菌WB600。结果：成功筛选获得了一株产腺苷酸脱氨酶重组枯草芽孢杆菌WB600/pHY-AMPD,进一步在摇瓶中探究了发酵培养基成分对重组酶发酵的影响。获得了较优发酵培养基为：葡萄糖10 g/L、 酵母膏30 g/L、CaCl2 0.5 g/L、柠檬酸三钠1 g/L、NaH2PO4 10 g/L、K2HPO4 10 g/L、(NH4)2SO4 5 g/L,37 ℃、200 r/min发酵60 h摇瓶发酵液酶活力可达到（2 230±50） U/mL。结论：本研究实现了鼠灰链霉菌来源的腺苷酸脱氨酶基因在枯草芽孢杆菌中表达。     

酿酒酵母乙醇脱氢酶Ⅱ基因反义干扰及对乙醇发酵的影响

通过构建酿酒酵母沉默表达载体PURH-ADH2,使ADH2基因在PGK强启动子、CYC1终止子在特定区域内进行干扰和表达。采用Bam HI和Xmal I限制性内切酶对SADH2基因和PURH质粒进行双酶切,构建反义重组表达质粒PURH-SADH2,通过高效酵母转化法和电转法将重组质粒组件转化至酿酒酵母SY01细胞中,获得阳性克隆菌株JY01。酿酒酵母JY01突变菌株与出发菌株SY01和Y01发酵试验结果相比,JY01甘油脱氢酶酶活比出发菌株Y01与SY01分别下降了16.31%和13.5%;当酿酒酵母Y01、SY01和JY01菌株发酵36~60 h时,JY01菌株甘油含量相比Y01分别下降了16.34%、14.25%、14.89%;当酿酒酵母突变菌株发酵48 h时,Y01、SY01和JY01的乙醇浓度分别为6.243 g/100 m L、7.145 g/100 m L和7.288 g/100 m L,酿酒酵母JY01发酵液乙醇量比比原始菌株Y01乙醇含量提高了14.33%。结果表明通过反义干扰ADH2基因5’UTR序列,能有效干扰酵母工程菌株ADH2转录与表达,削弱甘油积累途径,促进乙醇代谢途径。     

不同酵母对无花果酒高级醇、氨基酸的影响研究

以菌株EC1118、KD、X16、D254、BO_213发酵的无花果酒为研究对象,通过气相色谱对不同商业酵母发酵的无花果酒中高级醇进行分析比较,并对无花果汁及酒中氨基酸的含量进行分析比较,通过聚类分析将不同酵母发酵的酒进行聚类,筛选出较优的菌株。结果表明:5株酵母发酵的无花果酒中主要检测到正丙醇、异丁醇、异戊醇、苯乙醇,各菌株发酵的酒中高级醇总量依次为:EC1118 KD X16 D254 BO_213,异戊醇是各菌株发酵酒中主要的高级醇,无花果汁及酒中均检测到17种氨基酸,总游离氨基酸含量依次为:无花果汁 X16BO_213 EC1118 KD D254,各菌株的总游离氨基酸含量存在显著差异(p 0. 05),菌株X16发酵的酒中总游离氨基酸和必需氨基酸含量显著(p 0. 05)高于其他菌株分别为465. 72、87. 62 mg/L;聚类分析将菌株X16发酵的无花果酒聚为一类。通过对各样品进行分析,最终筛选出较优的酿酒酵母X16。     

高效表达木糖醇脱氢酶基因酿酒酵母的构建及木酮糖发酵的初步研究

通过RT-PCR方法克隆得到Candida tropicalis木糖醇脱氢酶基因xyl2,将该基因连入酵母表达载体pYES2的诱导型启动子GAL1下,构建表达质粒pYES2-xyl2;同时用从Pichia pastoris中克隆获取的甘油醛磷酸脱氢酶基因GAP换下GAL1基因,构建含组成型启动子GAP基因的表达质粒pYES2-GAP-xyl2;通过电转化法将其依次转入酿酒酵母S.cerevisiae INVSc1,山梨醇培养基上筛选的转化子经木糖醇梯度驯化培养,筛选出1株耐木糖醇浓度为20%的酿酒酵母重组菌株ZCX4和1株在半乳糖诱导下耐木糖醇浓度为15%的重组菌株YDX2。酶活测定表明,重组菌株ZCX4比酶活0.621 U/mg(蛋白),是YDX2比酶活的2.29倍。摇瓶发酵结果显示,重组菌株ZCX4木糖醇消耗76.46 g/L,木糖醇消耗率为76.46%,是重组菌株YDX2木糖醇消耗率的1.63倍,说明木糖醇脱氢酶实现了高效表达。     

乙醇脱氢酶I基因敲除的酿酒酵母重组菌构建的初步研究

本实验根据酿酒酵母乙醇代谢途径,构建一株低乙醇产量的酿酒酵母基因工程菌株,以满足人们对低醇啤酒的需要。利用抗性基因筛选基因敲除突变体的方法,通过引物L1和L2扩增潮霉素B基因(两翼与酿酒酵母同源),按常规醋酸锂法转化酵母细胞后,筛选标记与酵母adhI基因发生同源重组,得到一株ADHI酶活性降低的工程菌株。发酵实验结果表明,转化菌株乙醇含量平均值为1.8%(V/V),较原始菌株低了65%。说明转化菌株体内乙醇生成途径受到干扰。     

乙醇脱氢酶Ⅰ基因敲除的酿酒酵母重组菌构建的初步研究

本实验根据酿酒酵母乙醇代谢途径,构建一株低乙醇产量的酿酒酵母基因工程菌株,以满足人们对低醇啤酒的需要.利用抗性基因筛选基因敲除突变体的方法,通过引物L1和L2扩增潮霉素B基因(两翼与酿酒酵母同源),按常规醋酸锂法转化酵母细胞后,筛选标记与酵母adh Ⅰ基因发生同源重组,得到一株ADH Ⅰ酶活性降低的工程菌株.发酵实验结果表明,转化菌株乙醇含量平均值为1.8%(V/V),较原始菌株低了65%.说明转化菌株体内乙醇生成途径受到干扰.     

重组解脂耶氏酵母生产谷氨酰胺转胺酶酶原的发酵优化

谷氨酰胺转胺酶(EC2.3.2.13,TGase)是一种重要的食品酶,广泛应用于食品组分的质构、起泡性及乳化性等功能性质的改善。以一株分泌谷氨酰胺转胺酶酶原(pro-TGase)的重组解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica BBETG为研究对象,结合单因素实验与正交实验对其发酵培养基进行优化,以期实现pro-TGase的高产。结果表明,较优的发酵培养基配方为:甘油15 g/L、酵母膏20 g/L、氯化铵2.64 g/L、KH2PO4 0.32 g/L、无水MgSO4 0.25 g/L、VB13.34×10-4 g/L,初始pH值8.0。在该培养基中,重组菌于28℃发酵120 h,获得的pro-TGase经体外活化,酶活达8.47 U/mL,较初始发酵培养基产量提高393%。     

共表达xyl1、xyl2和tal1重组酿酒酵母的构建及木糖发酵研究

将来自树干毕赤酵母的木糖还原酶基因(xyl1)、木糖醇脱氢酶基因(xyl2)和酿酒酵母自身的木糖转醛酶基因(tal1),通过串联共表达的方法构建到表达载体pAUR123上,构建了1株重组酿酒酵母。该菌在打通木糖向木酮糖转化通路基础上,超表达木糖转醛酶。该菌以木糖为唯一碳源进行限氧发酵,能初步利用木糖。结果表明,木糖的利用率为77.4%,但乙醇产率仅为0.04 mg/mL。同时探讨了3种酶共表达对酿酒酵母发酵木糖生成乙醇的影响,发现3种酶对木糖的利用起关键性的作用,其过量表达导致木糖醇大量积累,乙醇得率降低。     

葡萄糖氧化酶基因在解脂耶氏酵母中的表达及发酵优化

葡萄糖氧化酶(β-D-glucose:oxygen 1-oxidoreductase;EC 1.1.3.4,简称GOD)是生物领域中至关重要的工具酶之一,被广泛应用于食品工业、饲料工业、纺织、医药等行业中。作者构建了一株重组解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica 1-28,分泌GOD,并进一步运用单因素实验与正交实验在摇瓶水平对其发酵培养基进行了优化。实验结果显示,最佳发酵培养基配方为:甘油20 g/L,酵母膏2.64 g/L,氯化铵2.64 g/L,无水硫酸镁0.13 g/L,磷酸二氢钾0.32 g/L,维生素B13.34×10-4g/L,初始pH值6.0。优化后GOD发酵产量达到11.0 U/mL,较初始发酵培养基GOD产量提高了72%。在此基础上进行3 L罐发酵,重组菌在甘油补料30 g/L,pH为5.0时,28℃发酵190h,发酵液酶活达到81.6 U/mL。     

酿酒酵母的基因改良

酿酒酵母的发酵性能直接影响到酒的质量与生产成本。利用基因工程改良酿酒酵母可提高其生产性能。基因改良酿酒酵母的研究和应用有：①增加酿酒酵母发酵性能的基因改良，如：构建含α-乙酰乳酸脱羧酶基因的低双乙酰工程酵母；含乙醇乙酰酶基因的高生香工程酵母；含糖化酶、葡聚糖酶等基因的高发酵度工程酵母；高絮凝性工程酵母和嗜杀酵母。②增强或缺失酵母自身基因的菌种改良，如构建高级醇低生成量的工程酵母和构建双乙酰低生成量的工程酵母。