一株关中热泉液口普鲁兰酶产生菌的筛选鉴定及部分酶学性质研究

[目的]筛选性能良好的产普鲁兰酶的菌株,对菌株进行多项分类鉴定,初步分离所产生的普鲁兰酶并进行性质研究。[方法]利用糯米粉作唯一碳源分离纯化普鲁兰酶产生菌,通过形态特征观察、生理生化测定、16S r RNA序列分析等实验确定菌株的分类地位。利用硫酸铵沉淀法得到粗酶,分析了酶的最适温度、最适p H、温度和p H稳定性、Na Cl等的耐受性。通过加入普鲁兰多糖诱导物优化培养基,提高普鲁兰酶产量。[结果]从我国陕西地下热泉样品中分离得到的一株普鲁兰酶产生菌WSCF46,经过多项分类鉴定显示其是与Vibrio parahaemolyticus亲缘性最近。菌株WSCF46所产的普鲁兰酶反应最适p H为5.0,最适温度60℃,经诱导培养优化后平均酶活达2.7U/m L。[结论]多项分类结果鉴定菌株为Vibrio parahaemolyticus strain ATCC17802,该菌株产普鲁兰酶相关报道在国内为首次。普鲁兰酶产量较其他来源的酶相比较高,具有进一步研究价值。     

产耐热普鲁兰酶菌株的分离、筛选与鉴定

从某火山口的土壤样品中分离筛选得到了一株产耐热普鲁兰酶菌株T-10,酶活力为1.22 U/m L。经形态特征观察、生理生化特征实验以及16S r DNA序列同源性分析,确定该菌株为解淀粉芽孢杆菌。酶学性质研究表明:该普鲁兰酶的最适温度是60℃,在70℃保温4 h后活力残留60%以上;最适p H值为6.0,p H 3.0~8.0在室温保存4 h后相对酶活力大约为70%。目前,鲜有发现产耐热普鲁兰酶的菌株为解淀粉芽孢杆菌,其具备良好的应用前景。     

Paenibacillus puldeungensis LK18普鲁兰酶基因的克隆表达及酶学性质研究

本研究根据类芽孢杆菌的普鲁兰酶基因的保守区设计兼并引物,从Paenibacillus puldeungensis LK18中扩增出普鲁兰酶基因(pul A),将其连接至p ET-28a(+)载体上,构建出重组表达载体p ET-28a(+)-pul A,转入到EscherichiacoliBL21(DE3)中,成功地表达了重组普鲁兰酶。结果表明:该普鲁兰酶基因全长1968 bp,编码655个氨基酸。通过Ni柱亲和层析纯化出重组蛋白,测定其比酶活为508.8 U/mg,分子量约为76.95 ku。该重组酶的最适反应温度为45℃,在35℃～40℃下保温120 min后剩余酶活达60%以上;最适作用p H为6.0,在p H 6.0～8.0条件具有较好的稳定性;10 mmol/L的K+和Mg~(2+)对该重组普鲁兰酶有激活作用,而Zn~(2+)、Mn~(2+)、Ni~(2+)、Fe~(2+)、Cu~(2+)、Co~(2+)、Ca~(2+)等对其有不同程度的抑制作用。本研究成功地构建出一株可高效表达普鲁兰酶的重组菌株,具备一定的工业应用价值。     

嵌合突变嗜酸普鲁兰芽孢杆菌普鲁兰酶结构域B对酶学性质及功能的影响

为考察嗜酸普鲁兰芽孢杆菌(Bacillus acidopullulyticus)普鲁兰酶结构域B对热稳定性及其他酶学特性和功能的影响,采用嵌合蛋白技术将B.acidopullulyticus普鲁兰酶的结构域B置换为Geobacillus thermoleovorans普鲁兰酶结构域B。嵌合突变体在60℃下的半衰期由34.9 min提高至168.4 min,解折叠一半时的温度由65℃提高至72℃,嵌合突变体较野生型具有更加优良的动力学稳定性和热动力学稳定性。结构域B置换后,最适pH碱向偏移至pH6.5,最适温度提高至70℃。比酶活及底物特异性实验结果显示,嵌合突变削弱了酶分子与普鲁兰多糖的结合,转而有利于与糊精及可溶性淀粉的结合。淀粉糖化结果显示,嵌合突变不影响突变体的实际应用性能。上述结果表明,B.acidopullulyticus普鲁兰酶结构域B对酶蛋白酶学性质影响显著,可通过同源置换构建适合于不同淀粉糖化工艺的突变体。     

一株产普鲁兰酶菌株的筛选鉴定、酶学性质及海带多糖酶解产物的抗氧化活性

本研究从连云港海泥中筛选产普鲁兰酶菌株,利用形态学、生理生化特征、基因序列(16S rRNA和 gyrB)进行分析鉴定。利用产酶菌株发酵制备普鲁兰酶,初步纯化后分析其酶学性质。利用该普鲁兰酶粗提物对海带多糖进行水解,并对其水解产物进行抗氧化活性分析。结果表明:筛选得到一株产普鲁兰酶的巨大芽孢杆菌P6(Bacillus megaterium),经发酵纯化后普鲁兰酶比活力为62.3 U/mg,分子量约为43 kDa。该酶的最适反应温度为45 ℃,最适pH为6.5,在温度40 ℃下保温5 h,相对残余酶活达95%以上,而60 ℃下保温1 h,酶全部失活。在pH6~7.5之间保温12 h后,该酶仍有40%以上的相对残余酶活。DPPH和·OH自由基清除实验表明:海带多糖经普鲁兰酶水解后抗氧化活性显著增强(p<0.05),为普鲁兰酶在食品工业中的应用研究提供了新的方向。     

嗜热脂肪芽孢杆菌木聚糖酶A的H297F定点突变、表达及酶学性质变化

利用重叠延伸PCR技术对嗜热脂肪芽孢杆菌木聚糖酶XynA活性中心附近的H297位点突变为F。将XynA及XynA_(H297)F在大肠杆菌BL21(DE3)中实施了表达、纯化以及酶学性质研究。比较研究野生型木聚糖酶XynA和突变体XynA_(H297)P的酶学性质发现,突变前后木聚糖酶的最适反应pH值均为5.5,在pH 4~10的缓冲液中处理20 h后残余酶活均在90%以上,均具有较好的pH稳定性。XynA最适反应温度为70℃,80℃处理20min后只有10%的残余酶活;XynA_(H297)最适反应温度为75℃,且相同处理条件下XynA_(H297)仍具有30%左右的残余活性,说明突变体的热稳定性有一定程度提高。与XynA相比,XynA_(H297)F的动力学参数Km、Vmax和Kcat均增大,说明突变后酶对底物的亲和力降低,但催化速率有所提高。     

Thermotoga maritima普鲁兰酶的基因克隆与酶学性质研究

以海栖热袍菌(Thermotoga mariti ma)MSB8基因组DNA为模板,PCR扩增出普鲁兰酶基因pulA,克隆入表达载体pET28a,转化EscherichiacoliBL21-CodonPlus(DE3)-RIL,经IPTG诱导,测定普鲁兰酶酶活性。结果表明,重组转化子的细胞破碎液有普鲁兰酶活性,SDS-PAGE电泳结果显示出分子量约为96ku特异性蛋白质条带。酶学性质分析表明,其最适反应温度达到95℃,在30~80℃均保持最大酶活力的80%以上,最适反应pH值为6.0,且在碱性条件下稳定。     

产普鲁兰酶蜡样芽孢杆菌的分离鉴定及酶学性质研究

利用选择性培养基从广西南宁淀粉加工厂附近土壤中分离出一株具有产普鲁兰酶能力的野生菌株GXBC-2。该菌株革兰染色为阳性,形成芽孢,菌体细胞杆状,结合生理生化特征和16S rDNA序列分析,初步鉴定该菌株为Bacillus cereus GXBC-2。对该菌所产普鲁兰酶的性质研究表明:酶的最适反应温度为50℃,在30～50℃范围内稳定,最适pH为7.0,稳定pH范围为6～8.5。产物经HPLC分析证明,该酶能水解普鲁兰糖产生麦芽三糖,对可溶性淀粉不起作用,所以该酶属于I型普鲁兰酶。     

耐热普鲁兰酶真菌的筛选、鉴定及酶学性质研究

本研究从西藏羊八井热泉下游淤泥中筛选得到了一株高产耐热普鲁兰酶菌株YBJ10-2,经诱导后其最高产酶量可达55.732U/mL,是目前国内外发现的产酶量较高的真菌。根据形态特征及18S rDNA序列同源性分析,初步判定菌株YBJ10-2属于球孢枝孢菌。该菌株发酵所产耐热普鲁兰酶在65-75℃和pH 5.0-8.0条件下较稳定,最适pH值为6.5,最适温度为72℃,对普鲁兰糖和支链淀粉催化能力最强,具有广阔的开发应用前景。     

压热-酶解法制备青芒果抗性淀粉

本研究采用压热-酶解法制备青芒果抗性淀粉,实验以青芒果淀粉为原料,在压热条件和α-淀粉酶作用的基础上,研究普鲁兰酶酶浓度、酶解温度、酶处理p H和酶解时间对青芒果抗性淀粉含量的影响。正交实验结果表明,压热-酶解法制备青芒果抗性淀粉的最佳条件为鲁兰酶添加量30 U/g、酶解p H5、酶解时间15 h、酶解温度60℃,该条件下,青芒果抗性淀粉产率最高可达7.368%。     

一株不动杆菌产普鲁兰酶的分离纯化及酶学性质的研究

微生物所产的普鲁兰酶用途广泛,但国内对普鲁兰酶的研究水平不够深入,使其工业化应用受到了极大的限制。通过硫酸铵分级沉淀,Sephadex G-75层析和DEAE SepHarose Fast Flow强阴离子柱层析技术,对提取的普鲁兰酶进行初步的分离纯化,得到普鲁兰酶纯酶。对该酶的酶学性质进行研究,结果表明,普鲁兰酶最适的硫酸铵分级沉淀浓度为60%,该普鲁兰酶的最适温度为50℃;酶的最适作用pH为8.0;在55℃至60℃之间酶活力稳定最好;在pH7.0-9.0范围内保持较稳定的活性;Ca~(2+)对酶激活作用最强,Ba~(2+)对酶的抑制作用较强;普鲁兰糖作底物时该酶活性最强。     

关中地区地下热泉普鲁兰酶产生菌的分离及其酶学性质

从关中地区的西安市区、临潼区、长安区,以及杨凌周边地区,分别采集地下热泉泉水水样,采用培养法分别得到105株普鲁兰酶产生菌,对其中21株进行16S r DNA基因片段序列分析。比对表明,克雷伯菌属(Klebsiella)和芽孢杆菌属(Bacillus)在热泉生态系统中处于优势地位。根据统计结果,所分离的菌株在种间和种内均有显著的酶活力差异。其中GP-1最适温度为50℃,最适p H 4.0,在50℃时有良好的稳定性,保温30 min仍有92%剩余酶活。     

嗜热古菌Thermococcus sp.HJ21产高温普鲁兰酶条件和酶学性质

对一株分离自热液口的超嗜热古菌(Thermococcus sp. HJ21)菌株产普鲁兰酶的条件及酶学性质进行了研究.结果发现:该菌株在18 h产酶量达到最高.在发酵温度为88 ℃、培养基初始pH 6.5,以及NaCl质量浓度为2.5 g/dL时,产酶较高.麦芽糖、酵母粉和蛋白胨有利于普鲁兰酶的产生.该酶的最适作用温度为95 ℃,在80～100 ℃之间仍可保持较高的酶活性;该酶具有较好的热稳定性,100 ℃保温2 h,仍有50%以上的残余酶活.该酶的最适作用pH为6.0,并且在pH 5.0～7.0之间可以保持较高酶活性;在pH 5.0～7.0之间较稳定,在pH 6.5时稳定性最好.Ca2+和Na+对普鲁兰酶具有较强的激活作用,而Al3+、Ni2+、Hg2+、Cu2+等则强烈抑制酶的活性.     

一种耐酸热普鲁兰酶生产菌种的分子构建及发酵研究

将长野芽胞杆菌的普鲁兰酶基因经密码子优化后,组建了人工合成的二联启动子Pga2,并将它克隆到枯草芽胞杆菌穿梭质粒p MK4-BPB以及自杀质粒p GE-BPB中;经转化和筛选获得了中性蛋白酶基因npr E被敲除的普鲁兰酶生产菌株CH-1;该重组菌在基础培养基中所产普鲁兰酶的酶活达到30.3 U/m L;经过对培养基组分及发酵条件(培养温度、起始p H,起始接种量等)进行优化,确定了发酵的最适碳源为45 g/L的蔗糖,氮源为60 g/L的麸皮+豆粕时,设定初始培养基的p H为6.2,在培养温度为32℃时进行发酵,CH-1发酵产重组普鲁兰酶酶活高达268 U/m L。     

N-糖基化修饰对极端嗜热酸性α-淀粉酶ApkA酶学性质的影响

为探索N-糖基化修饰对极端嗜热酸性α-淀粉酶Apk A酶学性质的影响,同时为构建酵母工程菌奠定基础,将Apk A缺失信号肽突变体Apk Ads及含有2个潜在N-糖基化修饰位点的突变体Apk Ads D182N/G373S在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中进行表达。Apk Ads和Apk Ads D182N/G373S在Pichia pastoris GS115中大量表达并分泌到胞外,Apk Ads的表观分子质量约为45 k D,Apk Ads D182N/G373S的表观分子质量约为55 k D。酶学性质分析表明,与Apk Ads相比,Apk Ads D182N/G373S的酶学性质发生了一定的变化。其最适反应p H值由6.5降低至5.5~6.0,酸性条件下稳定性增强;最适反应温度由90℃提高至100℃;于90℃的半衰期由5 h增加至5.5 h,于100℃保温10 min后的相对酶活力由32.03%增加至49.04%。结果表明N-糖基化修饰可适当提高Apk A的酸性条件下酶活力和稳定性、最适反应温度、热稳定性。突变体Apk Ads D182N/G373S的酶学性质使其适于淀粉液化工艺的应用。     

新型耐热耐酸普鲁兰酶的分离纯化与酶学特性分析

从泡盛曲霉(Aspergillus awamori)XF发酵液中分离纯化普鲁兰酶(PulXF)并研究其酶学性质。通过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析、凝胶过滤层析和疏水层析,纯化得到一种电泳纯的PulXF。纯化倍数8.16倍,比活力为309.28 U/mg。SDS-PAGE检测得单条带,表明PulXF为单亚基蛋白,分子量63.7 kDa。在50~80 ℃,pH4.5~8.0范围内,酶能保持高活性,最适反应温度60 ℃,最适pH5.0。在较广的pH范围内(pH3.0~8.0),28 ℃下,经过24 h酶活能保持80%以上活性。K_m值和V_max分别为0.92 mg/mL和11.90 μmol/min。酶活测定及TLC分析显示PulXF对普鲁兰多糖有强水解活性,终产物麦芽三糖;对支链淀粉和可溶性淀粉有较弱活性,对直链淀粉、α-环糊精、β-环糊精和糖原无活性。表明从泡盛曲霉XF分离的PulXF属于I型普鲁兰酶。Ca2+、Zn2+和Mg2+能够促进酶的活性,其中Ca2+激活作用最强。而PulXF在5%浓度的SDS、CTAB、Tween 80和30%的乙醇中保持高稳定性。基于PulXF在苛刻环境下的高稳定性及高活性,很有希望在淀粉加工、食品饮料等领域以及需要在高温、高酸环境下使用的生物技术工业中使用。     

Sulfolobus tokodaii strain 7高温酸性α-淀粉酶基因在大肠杆菌中克隆表达及其酶学性质

以超嗜热古菌Sulfolobus tokodaii strain 7基因组DNA为模板,通过PCR扩增高温酸性α-淀粉酶基因ST0817,将此基因克隆至表达载体pET15b,并转化大肠杆菌Escherichia coli BL21-CodenPlus(DE3)-RIL,获得重组大肠杆菌工程菌。通过热处理、镍柱亲和层析和分子筛层析,得到纯化重组酶,SDS-PAGE分析表明,该酶分子量为53.0 kDa。酶学性质研究表明,该酶最适温度和pH分别为75℃和5.5;具有较强的热稳定性和pH稳定性,在85℃处理8 h保持50%左右活力,在pH 5.2处理120 min仍保持50%活力。此酶对不同底物水解活性不同,直连淀粉>可溶性淀粉>支链淀粉>β-极限糊精>糖原>环糊精>普鲁兰糖;该酶对有机溶剂、变性剂和金属离子具有一定抗性。     

定点突变提高克雷伯氏菌普鲁兰酶的耐酸性

通过分析Klebsiella variicola SHN-1普鲁兰酶的活性中心,并将K.variicola SHN-1普鲁兰酶与来自K.pneumoniae,Bacillus acidopullulyticus,B.naganoensis的普鲁兰酶氨基酸序列进行同源性比较,确定了H626D、R756E、H852D、R908E、I619N、F723Y、S850T、K851S八个突变位点,采用定点突变的方法获得了8个突变酶,经过酶学性质分析,发现H852D的最适反应pH由原来的pH 5.0降低为pH 4.7,且在pH 4.5下的稳定性得到提高。通过同源建模及结构分析发现,852位点突变为天冬氨酸后与周围的氨基酸多形成了2个氢键,因此提高了结构的稳定性,且由于活性中心p Ka值的改变,造成了普鲁兰酶最适pH发生了迁移。     

超嗜热细菌Thermotoga maritima酯酶Tm1350克隆、表达及其酶学性质研究

以超嗜热细菌Thermotoga maritima基因组DNA为模板,通过PCR法扩增酯酶Tm1350基因,构建重组质粒p ET15b-Tm1350,在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中实现表达,并采用p-NPA方法测定其酶活性。研究结果表明,酯酶Tm1350可以水解不同碳链长度(10C)的对硝基苯酚酯,其中对硝基苯酚戊酸酯(p NP-C5)是该酶最适合底物;该酶最适反应温度和p H分别为70℃和6.5,90℃处理5h,仍有50%以上的酶活力,具有较强的热稳定性。酯酶Tm1350对金属离子、抑制剂、变性剂和有机溶剂具有较强的抗性。     

嗜热脂肪土芽孢杆菌普鲁兰酶基因的异源表达及重组酶性质

用PCR方法扩增得到嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)XQ3506的普鲁兰酶编码基因Gs P,在大肠杆菌中进行异源表达。在没有外源信号肽的条件下,重组酶部分分泌到周质中,少量分泌到培养液中。重组酶表观分子量约为81 k Da,纯酶比活力为38.2 U/mg。重组酶最适温度为60℃,能短时耐受70℃高温;重组酶最适pH6.5,在pH5.5~7.5的范围内具有较好的稳定性;重组酶Km值为0.086μmol/L,Vmax为0.083μmol/min;K+和Mg~(2+)对重组酶有激活作用,而Ca~(2+)则有抑制作用。重组酶水解普鲁兰糖产物为单一麦芽三糖,对直链淀粉未发现降解作用,是一种I型普鲁兰酶。重组酶Gs P在直链淀粉、抗性淀粉生产和粉丝酶法生产工艺中有一定的应用前景。