固氮斯氏假单胞菌四碳二羧酸转运调控基因dctB的功能研究

为研究固氮斯氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）A1501四碳二羧酸转运相关基因dctB的生物学功能,构建了携带功能完整的dctB基因片段的广宿主质粒pLL2922,通过三亲接合将该质粒转移至dctB突变株及野生型菌株A1501,并对其以琥珀酸、延胡索酸、苹果酸等四碳二羧酸为唯一碳源的培养基中的生长情况与固氮活性进行了测定。结果表明：dctB突变株不能利用琥珀酸和延胡索酸进行生长和固氮,但能以苹果酸为唯一碳源进行生长和固氮。携带功能完整dctB的广宿主质粒pLL2922,可以互补dctB位点的突变,并部分恢复突变株的四碳二羧酸转运和固氮能力。将该质粒转入A1501野生型菌株可以提高A1501的固氮活性,在琥珀酸,延胡索酸,苹果酸为唯一碳源的培养基上固氮活性比野生型菌株提高62．8％,33．9％,27．8％。表明dctB基因对于四碳二羧酸的转运及固氮能力均具有重要作用。     

固氮斯氏假单胞菌固氮调节基因ntrB的功能研究

利用三亲接合的方法将含有ntrB基因部分序列的自杀载体导入固氮斯氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）A1501中,获得了mrB基因的非极性突变株（AdnB）。RT-PCR实验证明,AdnB菌株中与ntrB连锁的下游基因ntrC能正常转录;ntrB基因的非极性突变导致细胞完全丧失固氯能力,但其突变株能在含NH4^＋的基本培养基K中正常生长;在以硝酸盐为唯一氯源时,AdnB比野生型A1501的细胞生长延迟约14～18h,认为ntrB基因与硝酸盐的氮代谢有关。功能互补实验结果表明,AdnB的功能互补菌株能完全恢复细胞的固氮作用和对硝酸盐的利用。     

洋葱假单胞菌G63脂肪酶基因及其伴侣基因的克隆和同源高效表达

从油污土壤中筛选到一株脂肪酶活性较高的洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)G63.运用PCR的方法从该菌株中克隆了脂肪酶基因(lipA)及其伴侣基因(lipB).该脂肪酶基因开放式阅读框(ORF)为1092bp,编码364个氨基酸残基.经KpnⅠ/HindⅢ酶切,将其克隆到广泛宿主质粒pBBR1Tp载体上,构建成质粒pBBR1-lipAB.通过三亲杂交,在辅助质粒pRK2013的帮助下,转入原宿主菌P.cepacia G63中,构建成lipA基因同源高效表达的基因工程菌.该菌株在连续转接5次,培养45h后质粒保持率为82.6%,适用于规模化发酵生产.摇床发酵表明,工程菌在60h时酶活达到150.63 U/mL,较原始菌株提高3.6倍.     

导入四碳二羧酸转移酶基因对费氏中华根瘤菌共生固氮效率的影响

将来自苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的四碳二羧酸转移酶基因(dctABD)经pIJ2925克隆到广宿主、稳定性质粒pTR102上,获得诱导型表达的重组质粒pHN202.在此基础上再引入来自pDB30所含的发光酶基因(luxAB)作分子标记,以pTR102为基础构建成带有dctABD和luxAB的重组质粒pHN205.经三亲本接合转移,将重组质粒pHN205导入费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)HNO1,GR3和YC4.与出发菌相比较的盆栽试验结果表明:HN01(pHN205)和GR3(pHN205)分别在宁镇一号和川早一号大豆上能显著提高植株地上部分干重(生物量)和总氮量, YC4(pHN205)在黑龙33大豆上能同时显著提高植株地上部分干重(生物量),总氮量和根瘤鲜重.本研究结果表明:导入dctABD基因对共生固氮效率的增效性与受体根瘤菌和大豆品种等因素有关.以luxAB为报告基因进行的转移接合子培养条件下分离单菌落和共生条件下形成根瘤的发光活性检测结果表明:pHN205可在供试费氏中华根瘤菌中稳定遗传.     

水稻白叶枯病菌受寄主诱导基因的鉴定

用一个具链霉素（Ｓｍ）抗性并含无启动子ＣＡＴ基因的广宿主启动子探针质粒ＰＩＪ３１００，用鸟枪法在ＣＡＴ基因上游的ＢａｍＨ１克隆位，或插入水稻白叶枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｏｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｚａｅ），用ＢａｍＨ１完全酶切的染色体ＤＮＡ片段，将重组质粒转化大肠杆菌ＥＤ８７６７在含链霉素的ＬＢ单板上筛选转化子。得到容量为６０００个转化子的克隆群体，其中２％的克隆含有水稻白叶枯病菌启动子活性片段，在平板上表现氯霉素（Ｃｍ）抗性。在帮助质粒ＰＲＫ２０１３的帮助下，通过三亲支配，将含有水稻白叶枯病菌启动子片段的重组质粒转移进野生型的水稻白叶枯病菌中去，在含链霉素的ＰＳＡ平板上筛选１６００个接合子，其中一个在平板上表现氯霉素抗性及含有组成表达的水稻白叶枯病菌启动子。随机选取２００个平板上对氯霉素敏感的接合子，接种用氯霉素处理的水稻感病品种金南风，得到１５个比对照明显致病的克隆。用其中一个含受水稻特异诱导启动子的重组质粒为探针，在水稻白叶枯病菌野生菌基因文库中筛选到２７个阳性克隆。     

利用Cre/lox重组系统在转基因动物中筛选高效表达外源基因的"友好"基因座

本实验的目的是利用Cre／lox重组系统进行“友好”基因座的筛选,即利用一个两端带有lox位点的标记基因去转染动物细胞或生产转基因动物,获得可以高效表达外源基因的“友好”基因座。一旦筛选到好的基因座,就建成了一个可以在动物体稳定地高效表达外源基因的技术平台。为此,利用野生型loxP位点和含有一个点突变的lox511位点分别构建两个载体pSL-loxGFP和pSL-loxIFN。首先将含有GFP和新霉素基因的质粒pSL-loxGFP DNA转染牛胎儿成纤维细胞,并用G418筛选,挑选出发绿色荧光的细胞克隆。经增殖培养之后,再将含有鸡γ-干扰素基因的质粒pSL-loxIFN和含有Cre重组酶基因的质粒pBS185 DNA共转染发荧光的细胞克隆,筛选出发生重组后不再发光的细胞克隆。用PCR法检测了两个不发荧光的细胞克隆及发荧光的细胞克隆,并使用质粒pSL-loxIFN、质粒pSL-loxGFP及牛基因组作为对照。检测结果显示,在Cre重组酶的作用下,两个不发荧光的细胞克隆中,一个发生了基因置换,另一个发生了基因删除。以上实验表明,巧妙地用Cm／lox重组系统,可以构建一套使外源基因在动物体内定点地高效表达的技术体系。     

导入四碳二羧酸转移酶基因对费氏中华根瘤菌共和固氮效率的影响

将来自苜蓿中华根瘤菌（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）的四碳二羧酸转移酶基因（ｄｃｔＡＢＤ）经ｐＩＪ２９２５克隆到广宿主、稳定性质粒ｐＴＲ１０２上,获得诱导型表达的重组质粒ｐＨＮ２０２。在此基础上再引入来自ｐＤＢ３０所含的发光酶基因（ｌｕｘＡＢ）作分子标记,以ｐＴＲ１０２为基础建成带有ｄｃｔＡＢＤ和ｌｕｘＡＢ的重组质粒ｐＨＮ２０５。＃? ｄｇ ｕｓ ｓｇ ｒｕｖ ｗｇｋ ｌｆｔｑ,ｕ     

快生型大豆根瘤菌（Rhizobium fredii）3．7Kb增效片段的亚克

利用柯氏质粒ｐＬＡＦＲ１为载体构建了快生型大豆根瘤菌Ｂ５２菌株的基因文库，并通过植物结瘤试验筛选到一个３．７Ｋｂ增效片段，将其导入慢生型大豆根瘤菌２２１０，能提高其共生固氮效率。所得高效菌株ＨＮ３２在黑龙江、四川和广西大面积应用，平均增产１１．４％（５）。本文测定了３．７Ｋｂ片段的核苷酸序列，计算机分析发现含有两个开放阅读框架（ＯＲＦｓ）。ＯＲＦ１编码含１９０个氨基酸的多肽，与已报道基因和多肽的同源性很低，但其Ｎ端１９个氨基酸与发根农杆菌的乳糖转移酶高度同源。ＯＲＦ２编码含２３５个氨基酸的多肽，与碗豆根瘤菌的ｈｕｐＥ及苜蓿根瘤菌的糖基转移酶基因显示５４％的同源性。     

一个巨大的抗真菌抗生素基因簇及其与植物生物技术的潜在关系

从链霉菌ＦＲ－００８中克隆出一个七烯大环内酯抗生素的生物合成基因簇，基因置换试验证实克隆的基因片段与抗生素生物合成直接相关。ＦＲ－００８抗生素含有一个３８员由聚酮所衍生的内酯大环，由编码红霉素聚酮合酶的活性域基因片段为探针所进行的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交试验证明，链霉菌ＦＲ－００８的聚酮合酶（ＰＫＳ）的基因簇占据１０５ｋｂ连续和具有重复功能单元（模块）的序列；假设每个ＰＫＳ模块为５ｋｂ，这与ＦＲ－００８碳链形成需要２１个缩合过程的预期数值极其吻合。链霉菌ＦＲ－００８的基因克隆系统（包括转化、转座、从大肠杆菌向链霉菌的属间接合转移、基因置换和基因中断体系和限制性缺陷菌株）均已得到发展，使我们能够充分利用基因工程技术来操纵七烯大环内酯的生物合成并产生新的抗生素衍生物。同时利用该基因簇中的部分ＰＫＳ基因序列构建了一个可用于转化植物的质粒ｐＨＺ３２１，为尝试在水稻等植物中表达链霉菌Ⅰ型ＰＫＳ基因以探索高Ｇ十Ｃ（７６％）含量的链霉菌ＰＫＳ基因能否在植物中表达提供了材料和工具。用此质粒来转化植物的研究，将为进一步利用这个巨大的抗真菌抗生素基因簇进行植物抗真菌的基因工程育种提供理论依据。     

苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白基因vip3A的研究

根据已知vip3A基因序列设计一对特异性引物VIP3／VIP5,对218株Bt菌株进行PCR鉴定,有51株含有vip3A类基因,其中12株为不同亚种的标准菌株,有4株标准菌株不含有该基因。从Bt C9菌株中分离克隆了vip—C9基因,并插入表达载体pET—21b,转化大肠杆菌BL21,诱导表达出分子量88．6kDa的可溶性蛋白,表达产物对甜菜夜蛾和棉铃虫具有较高的杀虫活性,LC50分别为0．42ng／mg和25．95ng／mg,对小菜蛾活性较低。构建了缺失蛋白Vip—C9—N(N端去除39个氨基酸组成的信号肽序列),杀虫活性测定结果表明其对甜菜夜蛾的活性显著降低,说明N端39个氨基酸对甜菜夜蛾的活性是必需的。     

共表达FMDV P1-2A和3C重组鸡痘病毒疫苗与核酸疫苗的实验免疫研究

将口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因分别插入到鸡痘病毒表达载体质粒pUTA-16Lac Z的复合启动子和单一启动子的下游,构建共表达重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL3CP1,与282E4株FPV共转染鸡胚成纤维细胞,经RT-PCR、IFA及Western blotting检测,成功获得能正确表达目的蛋白的重组鸡痘病毒株vU-TAL3CP1。并与FMDV重组核酸疫苗免疫小鼠实验表明,各实验免疫组均能诱导小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫反应,其中以重组鸡痘病毒与核酸疫苗联合免疫效果好于其它实验各组。     

Ru单原子负载g-C3N4催化剂的制备及其光催化固氮性能研究

采用固相原位还原法成功合成了负载钌(Ru)单原子的石墨相氮化碳(g-C₃N₄)催化剂。研究结果表明,Ru以单原子形式分散在g-C₃N₄材料表面上,Ru的负载使g-C₃N₄的3-s-三嗪单元结构的有序度降低,通过傅里叶变换红外吸收光谱(FTIR)测试分析可知催化剂中含有氰基,氰基导致了分子结构缺陷。Ru和氰基均为电子受体,可加速光生电子的转移并作为催化活性位点。负载Ru单原子后,g-C₃N₄的光吸收范围变宽,光吸收强度增强,使得Ru单原子负载g-C₃N₄具有良好的光催化活性,光催化固氮效率高达113.23μg·g^-1 cat·h-1,是单相g-C₃N₄催化剂的2.7倍。同时,Ru原子负载的g-C₃N₄还显示出很好的稳定性,经5次循环实验后光催化固氮效率仍能维持在106.75μg·g^-1 cat·h^-1。此外,通过光致发光光谱(PL)、电化学阻抗谱(EIS)等表征手段探究了Ru单原子g-C₃N₄的光催化固氮机理,其中氮气、超纯水和光照是使催化剂发挥光催化固氮作用的必要条件。     

藻蓝蛋白对Hela细胞CD59基因表达调控作用的研究

探讨了钝顶螺旋藻藻蓝蛋白(PC)对Hela细胞CD59基因表达的调控作用.以正常人CD59cDNA基因为模板,经PCR扩增后重组入真核表达质粒载体pALTER-MAX,然后利用阳离子脂质体(Lipfectamine-2000)将重组质粒和PcDNA共转染人子宫颈癌细胞(Hela)和对照用正常中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)进行表达.用不同浓度的钝顶螺旋藻藻蓝蛋白作用于转染细胞,通过核酸分子杂交技术、免疫荧光标记法和ELISA法对细胞中CD59分子的表达进行检测.结果表明:成功构建了重组质粒pALTER-MAX-CD59,并将其导入真核细胞(Hela,CHO),经G418筛选获得了CD59分子高效表达的细胞克隆.用藻蓝蛋白作用于筛选出的转基因细胞,证实藻蓝蛋白可促进Hela细胞表面CD59蛋白的表达并抑制Hela细胞的增殖,而对于正常CHO细胞无明显作用.     

Protamine and chloroquine enhance gene delivery and expression mediated by RNA-wrapped single walled carbon nanotubes

The use of non-viral vectors as delivery systems in gene therapy has been extensively studied recently owing to their advantages over viral vectors. Here, we propose a new gene delivery system based on the use of RNA-wrapped single-walled carbon nanotubes (SWCNTs) complexed with the cationic protein, protamine and the drug chloroquine. Protamine was selected as a cationic protein acting as bridge between negatively charged RNA-wrapped SWCNTs and plasmid DNA. Protamine also contains a nuclear localization signal which enhances the expression of the transfected gene. The drug chloroquine, a lysosomotropic compound which has been reported to increase the transfection efficiency, was attached to RNA-wrapped SWNTs by ionic interactions. The simultaneous delivery of the drug chloroquine with plasmid DNA clearly showed an enhanced gene delivery and expression. The levels of gene expression were quantified using the luciferase reporter gene as model. Optimal conditions for transfection and gene expression were obtained and cytoxicity of the carbon nanotube complexes measured. The optimal complexes were shown to efficiently deliver plasmid DNA for efficient gene expression and may thereby be useful as gene delivery systems for gene therapy.     

共表达VP3与hIL-18基因真核重组质粒的构建及对人结肠癌细胞的影响

先将鸡贫血病毒VP3基因插入真核表达载体pVAXl的多克隆位点，再将pVAX1载体上的IRES启动子及新霉素基因一同切下插入pVAXl的VP3基因下游，然后切下新霉素基因，将pIRES1基因插入其中，构建成pVVP3IL-18，将pVVP3IL-18转染Heda细胞。间接免疫荧光表明，在细胞膜和细胞浆观察到了特异的黄绿色荧光，证明表达了hIL-18。pVVP3IL-18转染人结肠癌细胞HCY-116后，经AO／EB染色及电镜观察，可见大量细胞凋亡。说明真核重组质粒pVVP3IL-18可在HeLa细胞中表达，并可在体外诱导人结肠癌细胞HCT-116凋亡。     

重组腺病毒介导的人凝血Ⅸ因子cDNA在奶山羊乳腺中的分泌表达

利用含ｈＦＩＸｃＤＮＡ和腺病毒片段的质粒ｐＡｄＣＭＶｈＦＩＸ与质粒ｐＪＭ１７共转染２９３包装细胞，制备含ｈＦＩＸ的重组腺病毒颗粒，经纯化、浓缩后通过直接转染活体奶山羊乳腺小叶的方法，建立了ｈＦＩＸ蛋白的乳腺表达系统。转染处理４天后，ｈＦＩＸ蛋白在羊奶中的最高表达量为２１ｎｇ／ｍｌ乳汁，活性检测表明乳汁中的人凝血ＩＸ因子蛋白８０％以上具有生物学活性。此研究结果证实了人凝血ＩＸ因子全长ｃＤＮＡ在奶山羊乳汁中分泌表达的可行性，同时也为验证外源基因在奶山羊乳腺组织中的分泌表达提供了一个快速检测系统。