Zur Aflatoxin B1-Bildung in K?sen

Zusammenfassung Um die Frage zu beantworten, ob Aflatoxine im Käse vorkommen können, mußten käsereitechnische Erfahrungen über toxinproduzierende Mikroorganismen gesammelt werden. Zunächst wurden 169 Käseproben des Handels auf das mögliche Vorkommen von Aflatoxin B₁ geprüft. Bei keiner der 19 Käsesorten, in der Hauptsache Tilsiter, Edamer, Romadur und Camembert, konnte dieses Toxin nachgewiesen werden.Bei Modelluntersuchungen zur Entwicklung von Aflatoxin B₁ wurden einzelne Käse mit aflatoxinbildenden Schimmelpilzen künstlich infiziert, das Toxin nach der Mycelbildung isoliert und quantitativ bestimmt.Der Kulturschimmel des Camembertkäses (Penicillium candidum) verhindert das Wachstum B₁-Aflatoxin bildender Pilze, so daß kein Aflatoxin B₁ nachweisbar war. Auch beim Romadur kann das Vorkommen von Aflatoxin B₁ wegen der Pilzwachstumshemmung, vermutlich durch die Schmierenbildung, ausgeschlossen werden.Dagegen gelang es, auf Tilsiterkäse mitAspergillus flavus undAspergillus parasiticus bei 18–30° C und mitPenicillium puberulum bei 5–20° C größere Mengen von Aflatoxin B₁ anzureichern. Hierbei muß die relative Luftfeuchtigkeit mehr als 79% betragen. 18 bzw. 5° C sind die unteren Grenzwerte für das Wachstum der betreffenden Schimmelpilze auf dem Käse. Unter optimalen Einflüssen (Temp. 26° C; rel. Luftfeuchtigkeit 99%) ist das Aflatoxin B₁ bereits 3–4 Tage nach Pilzbefall durchAspergillus flavus im Käse vorhanden. Durch Vergleiche der gefundenen Ergebnisse mit den Verhältnissen in Käsereien kann eine Bildung von Aflatoxin B₁ in Käse durch die genannten Organismen nicht ausgeschlossen werden, so daß weitere Untersuchungen erforderlich sind.

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About the formation of aflatoxin B₁ in cheese

Summary In order to answer the question whether aflatoxins can be present in cheese, observations on toxin-producing micro-organisms during manufacture of cheese had to be undertaken. 169 cheese samples, taken from the market, were tested for possible presence of aflatoxin B₁. In none of the 19 cheese varities, mainly Tilsiter, Edamer, Romadur, and Camembert, toxins could be found.By artificial infection of cheese with aflatoxin-producing fungi, the toxin was isolated after mycel-formation and quantitatively determined.The starter fungus of Camembert cheese (Penicillium candidum) pevents the growth of aflatoxin B₁ forming fungi so that no aflatoxin B₁ was detected. Also in Romadur cheese the presence of aflatoxin B₁ can be excluded due to growth prevention, probably by smear formation.It was possible, however, to obtain larger amounts of aflatoxin B₁ on Tilsiter cheese by growth ofAspergillus flavus andAspergillus parasiticus at 18–30° C. The relative humidity has to be more than 79%. 18° C resp. 5° C are the lower tolerance values for the growth of these fungi on cheese. Under optimal conditions (temperature: 26° C, relative humidity: 99%) aflatoxin B₁ is present in cheese 3–4 days after infection byAspergillus flavus. By comparing these results with the conditions in cheese factories, the formation of aflatoxin B₁ in cheese, caused by the organisms mentioned, cannot be excluded, so that further investigations are necessary.

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Auszug aus der Dissertation Lebensmittelchemiker Dieter Groll: Zur Aflatoxin-Entwicklung in Käse. Dissertation TH München 1969.

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Für die Unterstützung dieser Arbeit durch das Bundesministerium für Gesundheitswesen sei an dieser Stelle herzlich gedankt.     

Growth and biosynthesis of aflatoxin by Aspergillus parasiticus in cultures containing nisin

Summary Nisin, 200 or 5000 Reading units/ml, was added toAspergillus parasiticus cultures. The cultures were incubated at 28 °C for 3, 7 or 10 days and analyzed for mycelial dry weight, pH and accumulation of aflatoxin B₁ and G₁. During the first 3 days of incubation, dry weight, pH decrease and aflatoxin accumulation were suppressed by nisin, when compared with similar values for the nisin-free control. After longer incubation, differences in dry weight and pH values decreased, whereas accumulation of aflatoxin in the nisin-containing cultures surpassed that of the control.

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Wachstum und Aflatoxin-Biosynthese von Aspergillus parasiticus in Nisin-enthaltenden Kulturen

Zusammenfassung Nisin (200 oder 5000 Reading-Einheiten/ml) wurdeAspergillus parasiticus Kulturen zugegeben. Die Kulturen wurden bei 28 °C für 3, 7 oder 10 Tage bebrütet und auf Mycel-Trockengewicht, pH und Aflatoxin-Inhalt geprüft. Während der ersten drei Tage wurden das Wachstum und die Aflatoxin-Biosynthese durch Nisin etwas gehemmt, nach längere Incubation jedoch gefördert.

     

Kultur vonAspergillus parasiticus im Apfelsaft

Zusammenfassung Kulturen vonAspergillus parasiticus NRRL 2999 in Apfelsaft (aus Sirup) wurden Natriumbenzoat bzw. Kaliumsorbat (100, 200, 300 und 400 mg/l zugesetzt, danach wurden diese bei 25 °C, 3, 6, 9, 12, oder 15 Tage bebrütet und Myceltrokkengewicht, pH und Konzentration der Aflatoxine B₁ und G₁ bestimmt. Der pH-Anfangswert von 2,5 blieb in allen Fällen während der ganzen Inkubationsdauer unverändert. Natriumbenzoat unterdrückte bei allen getesteten Konzentrationen das Wachstum und förderte die Biosynthese von Aflatoxin G₁, während es die Anhäufung von B₁ wenig beeinflußte. Kaliumsorbat förderte das Wachstum bei 100 mg/kg, doch alle getesteten Konzentrationen inhibierten die Produktion der Toxine erheblich (keine nachweisbaren Mengen von B₁ und 3- bis 5 mal weniger G₁ als in der Kontrollreihe). Ausnahmslos wurde Aflatoxin G₁ stärker als B₁ angehäuft.

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The cultivation ofAspergillus parasiticus on apple juiceI. Influence of sodium benzoate and potassium sorbate on fungal growth and aflatoxin biosynthesis

Summary Sodium benzoate or potassium sorbate (100, 200, 300 and 400 mg/l) were added to cultures ofAspergillus parasiticus NRRL 2999 on apple juice (from syrup) and incubated quiescently at 25 °C for 3, 6, 9, 12 or 15 days. The cultures were analyzed for pH, mycelial dry weight and accumulation of aflatoxin B₁ and G₁. The initial pH of 2.5 remained constant in all instances throughout the incubation period. Sodium benzoate, at all concentrations, supressed fungal growth and stimulated the biosynthesis of G₁, whereas little influence was exerted upon the accumulation of B₁. Potassium sorbate stimulated fungal growth at 100 mg/l, while at all concentrations it considerably inhibited toxin production (no detectable amounts of B₁ and 3 to 5 times less G₁ than in controls). The concentration of G₁ surpassed that of B₁ without exception.

     

Zur Untersuchung von Milch und Milchprodukten auf die Aflatoxine B1, B2, G1, G2 und M1

Zusammenfassung Der vom Bundesgesundheitsamt vorgelegte Entwurf zur Bestimmung der Aflatoxine B₁, B₂, G₁ und G₂ wurde auf die zusätzliche Erfassung des Aflatoxins M₁ überpruft. Es wurde Wert darauf gelegt, die ursprüngliche Methode nur wenig zu ändern, um die zahlreichen Vorschläge zur Aflatoxin-Analytik nicht noch weiter zu vermehren. Mit verhältnisäßig geringen Änderungen können alle Aflatoxine, also B₁, B₂, G₁, G₂ and M₁ in flüissiger Milch, Milchpulver, Butter, Käse, Quark, Saline, Joghurt und Fruchtjoghurt quantitativ erfaßt werden.

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Investigations of aflatoxin B₁, B₂, G₁, G₂, and M₁ in milk and milk products

Summary The method proposed by the Federal Department of Health for the determination of aflatoxin B₁, B₂, G₁, and G₂ was tested for additional determination of aflatoxin M₁. With relatively small changes of the original method, all aflatoxins including. B₁, B₂, G₁, G₂, and M₁ can be determined quantitatively in milk, milk powder, butter, cheese, quark, cream, yoghurt and fruit yoghurt.

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37. Mitteilung: Zur Aflatoxinbildung in Milch und Milchprodukten.     

Release of aflatoxin from the mycelium of aspergillus parasiticus into liquid media

Summary Spores of an aflatoxinogenie strain ofAspergillus parasiticus were inoculated into a glucose-salts medium and incubated at 28° C for 5 days when both mold growth and aflatoxin production were nearly maximal. The mold mycelium thus produced was recovered by filtration, washed three times with distilled water, placed in a nitrogen-free liquid medium (so growth was not possible), and held for 45 h. Samples of medium were tested periodically for aflatoxin content to determine release of toxin by the mycelium. When the mycelium was in a medium with 5% glucose and was held at 7° C; 17, 33, 39, and 56% of the aflatoxin from the mycelium appeared in the liquid after 1, 9, 21, and 45 h, respectively. Aflatoxin B₁ was lost by the mycelium more slowly than were B₂, G₁, and G₂. At 28° C, values for the same time intervals were 27, 60, 70, and 76%, respectively, and at 45° C they were 32, 71, 71, and 79%. At 28 and 45° C, aflatoxins G₁ and G₂ were lost by the mycelium more rapidly than were aflatoxins B₁ and B₂. Elimination of glucose from the medium at 28° C hastened, and use of 50% instead of 5% glucose markedly reduced release of aflatoxin by the mycelium during early stages of the incubation period.

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Zusammenfassung Ein Medium mit Glucose und Salzen wurde mit Sporen eines Aflatoxin bildenden StammesAspergillus paraciticus geimpft und bei 28° C für 5 Tage im Inkubator gehalten, bis sowohl das Wachstum des Schimmelpilzes als auch die Produktion von Aflatoxine den Höhepunkt erreichten. Das Pilzmycel wurde abfiltriert, 3 mal mit destilliertem Wasser gewaschen und in ein Stickstoff-freies, flüssiges Medium gebracht, um ein weiteres Wachsen unmöglich zu machen. Stichproben wurden von dem Medium periodisch gezogen und der Gehalt an Aflatoxine bestimmt, um den Verlust an Toxin aus dem Mycel zu erhalten. Wenn das Mycel in einem Medium mit 5% Glucose bei 7° C gehalten wurde, dann erschien in der Flüssigkeit 17, 33, 39 und 56% des Aflatoxins aus dem Mycelium nach 1, 9, 21 und 45 Std. Aflatoxin Bi ging aus dem Mycelium langsamer verloren als B₂, G₁ und G₂. Bei 28° C waren die Werte für dieselben Zeiträume 27, 60, 70 und 76% und bei 40° C 32, 71, 71 und 79%. Bei 28° C und bei 45° C verlor das Mycelium die Aflatoxine G₁ und G₂ schneller als B₁ und B₂. Das Mycelium gab die Aflatoxine schneller bei 28° C ab, wenn das Medium frei von Glucose war. Wenn das Medium 50% Glucose anstatt 5% enthielt, wurde der Verlust an Aflatoxine vom Mycelium im Anfangsstadium der Inkubationsperiode wesentlich verringert.

     

Zur Aflatoxinbildung in Milch und Milchprodukten VII. Zur Problematik der Probenahme in aflatoxinhaltigen Lebensmitteln

Zusammenfassung Von einem Käselaib wurde bei mehr als 100 Proben — über die ganze Oberfläche verteilt — der Gehalt an Aflatoxin B₁, B₂, G₁ und G₂ halbquantitativ bestimmt. Erwartungsgemäß traten regional sehr unterschiedliche Konzentrationen an Aflatoxin auf. Daraus ergeben sich Schwierigkeiten für die Probenahme and für die rechtliche Beurteilung.

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On aflatoxin formation in milk and milk products VII. Difficulties in sampling of foods containing aflatoxin

Summary In more than 100 samples distributed over the whole surface of one cheese loaf, the content of aflatoxine B₁, B₂, G₁ and G₂ was determined half-quantitatively. As expected, there were very different concentrations of aflatoxines in different sections. From there, problems of sampling and legal evaluation arise.

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Vgl. von den vorausgegangenen besonders Mitteilung III. (1)     

Kultur vonAspergillus parasiticus im Apfelsaft II. Einflu? von Butylhydroxyanisol (BHA) and Butylhydroxytoluol (BHT) auf Pilzwachstum and Aflatoxin-Biosynthese

Zusammenfassung Aspergillus parasiticus NRRL 2999 wurde im Apfelsaft (aus Sirup) in Gegenwart von BHA bzw. BHT (100, 200, 300 oder 400 mg/1) bis zu 15 Tage bei 25 °C ruhend bebrütet. Myceltrockengewicht, pH and Konzentrationen der Aflatoxine B₁ und G₁ wurden in dreitägigen Abständen bestimmt. Der pH-Anfangswert von 2,5 blieb durchwegs unverändert. BHA unterdrückte das Wachstum and die Toxinanhäufung in der beobachteten Zeitspanne. Es kam jedoch zu konzentrationsabhängigen Wachstumsverzögerungen und zu früheren Toxin-Höchst-werten als in der Kontrollreihe, was auf eine Anpassung ans Milieu hinweist. BHT führte erst ab 200 mg/l zu einer ca. 25%igen Wachstumshemmung (Löslich-keitsgrenze von BHT zwischen 200 and 300 mg/1) und bei 200 mg/l zur ca. 45%igen Hemmung der Toxinanhäufung. Bei 100 mg/l wirkte BHT fördernd auf die Toxinsynthese (1,90 mal mehr G1 and 6,65 mal mehr B₁ als in der Kontrollreihe). Bei allen getesteten Konzentrationen von BHA bzw. BHT sowie in der Kontrollreihe wurde Aflatoxin G₁ starker als B₁ angehauft.

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The cultivation ofAspergillus parasiticus on apple juice II. Influence of butylated hydroxyanisole and butylated hydroxytoluene on fungal growth and aflatoxin biosynthesis

Summary Aspergillus parasiticus (NRRL 2999) was incubated in apple juice (from syrup), quiescently at 25 °C for up to 15 days in the presence of butylated hydroxyanisole (BHA) or butylated hydroxytoluene (BHT) at concentrations of 100, 200, 300, or 400 mg/l. Mycelial dry weight, pH and concentration of aflatoxin B₁ and G₁ were measured every 3 days with the initial pH of 2.5 remaining unchanged in all samples. BHA suppressed fungal growth and toxin accumulation during the observed incubation period. However, a concentration-dependent growth delay and earlier peaks of toxin accumulation suggested environmental adaptation of the mould. BHT (from 200 mg/l onwards), led to growth inhibition by about 25% (solubility limit of BHT lies between 200 and 300 mg/1), and at a concentration of 200 mg/1, it led to a reduction of toxin accumulation by approximately 45%. At 100 mg/l, however, BHT stimulated aflatoxin production (1.90 times more G, and 6.65 times more B₁ than in the controls). At all tested concentrations of BHA or BHT, as well as in the controls, the accumulation of aflatoxin G₁, without exception, surpassed that of B₁.

     

Heavy metal determination in sea water and in marine organisms with the aid of flameless AAS.

Zusammenfassung Nach einem Fütterungsversuch mit Aflatoxin B₁ an drei Milchkühen wurde aus der erhaltenen natürlich kontaminierten Milch Frischkäse, Camembert und Tilsiter hergestellt. a) Die Verteilung von Aflatoxin M₁ auf Molke und Käsebruch stimmt mit den in den Modellversuchen erhaltenen Ergebnissen zur Aflatoxin-M₁-Verteilung überein, setzt man eine annähernd gleiche Bruchherstellung und ein gleiches Molke/Bruch-Gewichtsverhältnis voraus. -b) Die Käseherstellung bewirkt eine Anreicherung des Milchtoxins im Käsebruch. Gegenüber der Kesselmilch weisen unmittelbar nach ihrer Herstellung Frischkäse einen 3,2 fachen, Camembert einen 3,3 fachen und Tilsiter einen 3,7 fachen höheren Aflatoxin-Ml-Gehalt auf, was auf eine Eiweißbindung schließen läßt. - c) Thermisieren von Frischkäse (5 min, 80° C) ergibt keine Aflatoxin-M₁-Verluste. -d) Während der ersten 2 Wochen der Reifung bzw. Lagerung nimmt der auf die Trockenmasse bezogene Toxingehalt im Käse zu. Die Zunahme betrug bei Frischkäse 24–28%, bei Camembert 45–54% und bei Tilsiter 23%. - e) Danach kommt es bei Frischkäse zu einer Aflatoxin-M₁-Abnahme von 4–12% sowie bei Camembert und Tilsiter zu einer solchen von ca. 25%. - f) Bei 3 Monate altem, unverpackt gelagertem Tilsiter ist der Aflatoxin-M₁-Gehalt der Rinde höher als der des Teiges. Auf die Trockenmasse bezogen, ergeben sich jedoch praktisch keine Unterschiede im Aflatoxin-M₁-Gehalt von Rinde und Teig. -g) Der Aflatoxin-M₁-Gehalt von lyophylisiertem Molkenpulver bleibt während einer 40tägigen Lagerung praktisch konstant.

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On the aflatoxin M₁ content of cheese during ripening and storage

Summary After receiving naturally contaminated milk from three cows fed with aflatoxin B₁, uncured cheese, camembert- and tilsit-cheese were prepared from this milk. a) The distribution of aflatoxin M₁ in whey and curd was in accordance with results, obtained in model experiments provided curd processing and the weight ratio between whey and curd was approximately the same. b) Cheese processing resulted in an enrichement of toxins in the curd. Compared to vat milk, the aflatoxin M₁ content of the cheeses immediately after processing was 3.2 fold higher in uncured cheese, 3.3 fold higher in camembert and 3.7 fold higher in tilsit cheese; this fact indicates a binding to protein. c) Heat treatment of uncured cheese (5 min, 80° C) did not reduce the aflatoxin M₁ content. d) During the first two weeks of ripening resp. storage the toxin content as a percentage of dry weight increased. The increase was by 24–28% in uncured cheese, 45–54% in camembert and 23% in Usit cheese. e) Then the aflatoxin M₁ content decreased in uncured cheese 4–12% and in camembert as well as in tilsit cheese by about 25%. f) In three month old tilsit cheese stored unpacked, the aflatoxin M₁ content of the rind was higher than in the center. Related to dry weight, however, there was practically no difference in the aflatoxin content of rind and center. g) The aflatoxin M₁ content of lyophylized whey powder remained practically constant during a storage period of 40 days.

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Auszug aus der Dissertation von Manfred Buchner: Über den Einfluß der Käseherstellung auf den Aflatoxin-M₁-Gehalt der Käse

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41. Mitteilung: Zur Aflatoxinbitdung in Milch und Milchprodukten

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Dem Institut für Wehrpharmazie und Lebensmittelchemie München (Leiter: Priv.-Doz. Dr. Trapmann) danke ich für die gewährte Unterstützung     

Zur Wirkung von Pimaricin auf Schimmelpilze und deren Aflatoxinbildung bei K?sen

Zusammenfassung Voraussetzung für die Anwendbarkeit des Pimaricins ist dessen Hitzestabilität (bis ungefähr 80° C) und die geringe Eindringtiefe (knapp 2,6 mm), so daß es für die konservierende Wirkung auf der Oberfläche der Käse für längere Zeit zur Verfügung steht. An 13 verschiedenen aflatoxinbildenden Schimmelpilzen wurde die Hemmung auf die Mycelentwicklung und damit auf die Aflatoxinbildung festgestellt, wobei die einzelnen Schimmelpilze unterschiedlich gehemmt werden. Bei Käsen war die Wirkung nicht eindeutig, da die native Oberfläche, der Käse (Rinde) nach Pimaricinbehandlung 8 Wochen vor dem Verschimmeln geschützt blieb, während daraus hergestellte Scheiben, in Pimaricinlösung getaucht, alsbald verschimmelten. Die Aflatoxinbildung selbst wird nur unterdrückt, wenn auch das Wachstum der Schimmelpilze unterbunden wird. Die Käse müssen daher möglichst frühzeitig behandelt werden, ehe es zu einer stärkeren Entwicklung der Schimmelpilze kommt. Die Aflatoxinproduktion setzt zwar erst bei einer nicht vollständigen Unterdrückung ein; es muß mit einer, wenn auch verminderten Aflatoxinbildung gerechnet werden.

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Effect of pimaricin on moulds and their aflatoxin formation in cheese

Summary The prior condition for the application of Pimaricin is its heat stability (up to 80° C) and the low penetration (around 2.6 mm), so that it is available for the effect on the cheese surface for a long period. With 13 different aflatoxin forming moulds, the inhibition on the mycel development and thereby on the aflatoxin formation was tested; the different strains were inhibited to various degrees. The effect on cheese was not definite, because the native cheese surface remained free of mould for 8 weeks after Pimaricin treatment, whereas cheese slices dipped into Pimaricin solution were covered with moulds very soon. The aflatoxin formation itself is only inhibited, if the growth of the moulds is inhibited. Therefore the cheeses have to be treated very early before strong growth of the moulds has started. The aflatoxin formation, however only starts at a certain growth period of the moulds, but at a not completed inhibition, a reduced aflatoxin formation has to be taken into consideration.

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Auszug aus: Erwin Zierer Zur Verhinderung der Aflatoxinbildung auf Käsen durch Pimaricin. Dissertation Techn. Universität München 1974.

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34. Mitt. Zur Aflatoxinbildung in Milch und Milchprodukten.