环介导等温扩增技术检测食品中酸土环脂芽孢杆菌

目的：利用环介导等温扩增技术建立食品中酸土环脂芽孢杆菌快速检测方法。方法：针对酸土环脂芽孢杆菌16S序列设计特异引物,再优选反应体系,用显色法检测实验结果。结果：该方法能够在63 ℃条件下1 h内检出食品中酸土环脂芽孢杆菌,所设计的引物有良好的特异性;灵敏度达6.7 CFU/mL（弱阳性）。结论：该方法具有高效、特异性强和敏感性高等特点,可满足酸土环脂芽孢杆菌快速检测筛选的要求。     

Rapid detection of Listeria monocytogenes in raw milk with loop-mediated isothermal amplification and chemosensor

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) allows a rapid amplification of nucleic acids under isothermal conditions. It can be combined with a rhodamine-based dual chemosensor for much more efficient, field-friendly detection of Listeria monocytogenes. In this report, LAMP was performed at 63 °C for 10 min, followed by a rapid reaction of DNA amplification and the byproduct, pyrophosphate ion, with a rhodamine-based dual chemosensor and Cu(2+) is visualized as a disappearance of red color. The detection limit of L. monocytogenes by the LAMP-chemosensor was 8 to 10 cells per reaction tube, and the total assay time including 10 min for rapid DNA extraction was approximately 30 min. Data on naturally contaminated raw milk samples indicated that the LAMP method was highly specific and sensitive, giving 100% concordance with the ISO 10560 reference method. The results showed that the LAMP-chemosensor method has the advantages of better sensitivity and speed and less dependence on equipment than the standard Polymerase Chain Reaction for specifically detecting low levels of L. monocytogenes DNA, and this can be useful in the field as a routine diagnostic tool. PRACTICAL APPLICATION: The LAMP-chemosensor method reported here provided a powerful tool for detection of L. monocytogenes in raw milk samples due to its specificity, sensitivity, and rapidity.     

环介导等温扩增技术在食品安全检测领域的应用研究进展

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年发展起来的一种新型核酸检测技术。其采用特异识别靶序列上6个位点的4条引物和一种具有链置换活性的DNA聚合酶,在等温条件下进行核酸扩增,与传统核酸检测技术(PCR法、实时荧光定量PCR法)相比,具有操作简单、特异性强、灵敏度高、可肉眼判读结果等优点。核酸检测是食品安全检测技术的一个重要手段,本文综述了LAMP技术在食品微生物检测、转基因成分检测、过敏原成分检测和动物源性成分检测领域的应用研究进展,探讨了LAMP技术在食品检测领域的发展前景,以期为食品快速、高通量检测技术建立提供参考。     

环介导等温扩增技术检测酸奶中嗜酸乳杆菌

目的建立环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测酸奶中嗜酸乳杆菌。方法以嗜酸乳杆菌16S r RNA保守区的基因序列为靶序列设计引物,优化建立LAMP反应体系和程序,并研究引物的特异性,同时确定嗜酸乳杆菌的灵敏度和检出限。结果本方法可通过凝胶电泳和离心后焦磷酸镁白色沉淀检测反应结果,检测时间为5.5 h,灵敏度为62 CFU/m L,人工污染酸奶样品的检出限为120 CFU/m L,12株非嗜酸乳杆菌细菌非特异检测结果均为100%。结论该方法灵敏性好、特异性强、操作简单、耗时短,可适合于酸奶中的嗜酸乳杆菌的快速测定。     

应用环介导等温扩增检测阪崎肠杆菌

建立环介导等温扩增检测阪崎肠杆菌的方法,通过肉眼可见的白色沉淀,判断检测结果。将阪崎肠杆菌(ATCC29544)的16S-23SrRNA间区序列作为靶基因,设计2对特异引物,优化反应条件,进行LAMP扩增。对产物进行酶切分析,与理论上的预期结果相一致。通过测序比对,与GenBank上报道的同源性达到99%。用25株食源性致病菌证实该引物特异性强。LAMP扩增20min,其灵敏度为4.3×102 fg/tube,结果表明,LAMP方法检测阪崎肠杆菌,灵敏度高、特异性强、耗时短、方法简便。     

可视化环介导等温扩增技术检测鸡鸭源性成分

目的建立生肉及熟肉制品中鸡、鸭源性成分的特异性基因LAMP可视化快速检测方法。方法根据鸡鸭物种特异性cytb、COX3基因的6个特异性区域设计LAMP引物,在反应前加入羟基萘酚蓝(HNB),在63℃条件下反应45 min;反应结果可以根据颜色变化直接判断,阳性为天蓝色,阴性为紫罗兰色。并对30个肉制品样品进行可视化LAMP和PCR方法平行检测。结果 LAMP方法的最低检出限为1 pg,特异性良好,同时对肉制品中目标物检测的检出限可达到0.01%。结论该方法用于肉制品中鸡鸭源性成分的快速检测,具有操作简单、无需贵重仪器、反应结果肉眼可观察、灵敏度高和特异性强等特点,适合于基层监管部门进行肉制品现场快速检测。     

环介导恒温扩增快速检测植物油中掺假地沟油方法的建立

以植物油中不应存在动物源性成分为鉴定依据,建立食用植物油中掺假地沟油的环介导恒温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)快速检测方法,以动物线粒体DNA为检测靶标,根据脊椎动物线粒体基因组高度保守序列设计了两条外引物(F3、B3)和两条内引物(FIP、BIP),采用LAMP实时荧光法和染色法对扩增产物进行比较分析,对甜菜碱和Bst DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)量进行了优化,并进一步评价方法的特异性、灵敏度和稳定性。结果表明,在1.6 μmol/L内引物(FIP和BIP),0.2 μmol/L外引物(F3和B3),6 mmol/L MgSO₄,1.6 mmol/L dNTP,10×Thermo pol Buffer,8 U Bst DNA聚合酶,扩增温度为65℃,扩增时间为1 h的优化条件下,能够一次同时扩增出牛、羊、猪和鸡等脊椎动物DNA序列,检出植物油中最低含量为0.01 ng/μL的动物源性DNA,优化后的LAMP方法特异性好,仅能扩增出动物源性DNA序列、重复性好、稳定性高,可用于油脂中动物源性成分的检测,为油脂鉴伪和地沟油的鉴别提供一种稳定、高效、适应性强的现场快速检测技术。     

花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子LAMP检测方法的建立

针对花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子的保守序列设计特异性引物,并进行条件优化,建立CaMV35S启动子的LAMP检测方法。该方法具有良好的特异性,检测灵敏度可达0.002%。对80份各类植物及其加工品进行检测,检测结果与实时荧光PCR法完全相符。CaMV35S启动子的LAMP检测方法,在检验检疫行业和食品加工业具有广阔的应用前景,对于加强转基因产品检测监管,促进进出口贸易具有重要意义。     

叠氮溴乙锭-环介导等温扩增法快速检测空肠弯曲菌活菌

目的建立叠氮溴乙锭(ethidium monoazide bromide, EMA)-环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)快速检测空肠弯曲菌活菌的方法。方法以空肠弯曲菌mapA基因为检测靶基因,纯培养物提取模板进行LAMP反应,检测空肠弯曲菌LAMP灵敏度、EMA曝光照射时间试验和使用浓度试验。结果空肠弯曲菌LAMP检测灵敏度为800 CFU/mL;曝光照射时间为5 min; EMA终浓度50μg/mL以下时不会抑制空肠弯曲菌活菌的DNA扩增,终浓度为1μg/mLEMA能有效抑制4×10~4CFU/mL空肠弯曲菌死菌扩增; 1%活菌混合体系中EMA-LAMP检测结果为阳性。结论 EMA-LAMP方法能有效快速检测空肠弯曲菌活菌。     

Thermal resistance of Alicyclobacillus acidoterrestris spores in different heating media

The aim of this work was to study the influence of temperature (85, 90, 95 and 100 °C), total soluble solids (SS: 10 and 20°Brix or % by weight of sucrose) and pH (3.5 and 4.0) on decimal reduction time ( D- value) of the Alicyclobacillus acidoterrestris strain DSM2498 spores in apple juice, orange juice and malt extract broth (MEB). The effects of SS and pH on D -values and z- values in each media were insignificant ( P  > 0.05). In apple juice, orange juice and MEB, z- values of A. acidoterrestris for pH 3.5 and pH 4.0 were 12.2 ± 1.3–14.2 ± 3.2 °C, 11.2 ± 0.3–9.4 ± 0.0 °C and 11.9 ± 0.8–10.3 ± 0.4 °C, respectively. z- values of apple juice, orange juice and MEB samples with SS = 10°Brix and SS = 20°Brix were 14.1 ± 3.2–12.2 ± 1.3 °C, 10.2 ± 0.7–10.5 ± 1.1 °C and 11.3 ± 1.5–10.9 ± 0.2 °C, respectively. However, D -values of all samples were affected by temperature significantly ( P  < 0.01). Average D -values of apple juice, orange juice and MEB were 101.2 ± 14.7, 34.4 ± 7.9, 20.3 ± 4.9 and 4.3 ± 1.3 min for 85, 90, 95 and 100 °C. This study demonstrated that A. acidoterrestris spores exhibited high resistance to thermal processing applications. pH and SS of the media did not affect thermal resistance.     

环介导恒温扩增法(LAMP)检测金黄色葡萄球菌

建立一种能够快速准确地检测金黄色葡萄球菌的LAMP方法。根据金黄色葡萄球菌的femA基因设计了引物,然后进行LAMP反应条件的优化、特异性和灵敏度的检测并与实际样品进行检出率的比较。LAMP方法特异性好,最佳反应温度为61℃,只对金黄色葡萄球菌进行扩增;灵敏度高,金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为8～9cfu/mL时仍能检出。LAMP方法检测金黄色葡萄球菌特异性强、灵敏度高、时间短且操作简便,有望成为快速检测金黄色葡萄球菌的新方法。     

环介导等温扩增技术快速检测椰毒假单胞菌的研究

建立环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测椰毒假单胞菌的方法。根据公布的椰毒假单胞菌16S～23SrRNA基因序列设计引物,建立了LAMP反应体系,在此基础上检测了蜡样芽孢杆菌菌液和人工污染蜡样芽孢杆菌的银耳样品,并将LAMP法与PCR法进行比较。结果表明,LAMP检测方法具有较高的特异性和敏感性,椰毒假单胞菌的检出限为5.4CFU/mL,是PCR方法检测灵敏度的1000倍,人工污染银耳样品中的椰毒假单胞菌的检出限为76CFU/g,样品中椰毒假单胞菌的检测过程(包括DNA提取、LAMP和电泳)可在2h内完成,因此LAMP可以简便快速有效地检测食品中的椰毒假单胞菌。      

微波提取苹果汁中脂环酸芽孢杆菌DNA的PCR检测方法研究

根据Genbank公布的酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 3922T)鲨烯环化酶序列自行设计一对引物,利用微波技术直接从果汁样品中提取目标菌DNA,对引物特异性、微波法提取DNA的扩增效果及检测灵敏度进行探讨。结果表明：微波功率1000W、处理时间30s、经5000r/min离心2min即可获得酸土脂环酸芽孢杆菌基因组DNA,所得模板质量符合聚合酶链式反应检测要求,目的条带清晰,检测时间仅为2h,检测限为200CFU/mL,有望真正应用于苹果汁生产的在线检测。     

环介导等温扩增检测技术的应用与方法改进

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近些年发展起来的一种新型核酸扩增技术,其原理是利用在线软件设计4条特异性引物,在具有强链置换活性的DNA聚合酶作用下,使模板两端引物的结合处循环出现环状单链结构,以实现恒温条件下的连续快速扩增,该方法具有特异性强、灵敏度高、耗时短且无需昂贵的热循环设备等优点。目前该技术在国内外已经广泛应用于细菌、病毒及寄生虫等病原体的检测以及鉴定胚胎性别。本文从LAMP技术的原理、方法改造、检测应用以及与其他检测方法的比较这4方面进行综述,为今后LAMP技术的应用提供理论依据并对未来的发展进行了展望。     

环介导等温扩增技术在病原微生物快速检测中的研究进展

病原微生物是危害人类健康的最主要影响因素之一, 快速、准确地鉴定病原微生物对保障人类健康具有重要意义。环介导等温扩增技术(loop-meditated isothermal amplification, LAMP)是一种新型的等温核酸扩增技术, 具有特异性高、灵敏度高、快速、经济、简便的优点。可以与其他新技术结合, 弥补其引物设计困难和易被污染的不足, 使其能够在更多领域应用, 尤其是在资源贫乏地区的基因检测以及食品的快速检测和基层检测。本文就环介导等温扩增的基本原理、特点及在病原微生物检测中的应用对近些年的研究进展进行综述, 并对环介导等温扩增未来发展方向进行展望, 为环介导等温扩增技术的进一步发展提供参考。     

小麦成分环介导等温扩增现场快速检测方法的建立和应用

目的建立环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法现场快速检测小麦过敏原成分的分析方法,有助于食品安全突发事件现场和食品企业生产过程中的样品检测小麦成分。方法运用LAMP建立食品过敏原小麦成分LAMP现场快速检测方法,采用实时浊度仪和显色法进行结果判断,并进行反应条件优化。结果本方法特异性强,对35个对照样品无交叉反应;方法的灵敏度高,检测限可达到0.01%小麦;方法稳定性好,对0.1%和0.01%小麦样品重复检测结果稳定。通过对市场采集70份样品检测结果显示,该方法与食品标签标示的过敏原成分结果一致。结论本方法操作简单,检测时限短,结果判断准确,可用于过敏原小麦成分的快速检测。     

水产品和水体中创伤弧菌现场可视化环介导恒温扩增快检方法的建立及应用

目的 基于环介导恒温扩增(LAMP)技术建立水产品和养殖水域中创伤弧菌现场可视化快速、简便的检测方法。方法 以创伤弧菌作为研究对象,分别采用煮沸法和离心柱法提取基因组DNA,优化简便、快速的弧菌DNA提取方法;以创伤弧菌gyrB基因作为靶基因,设计筛选最佳的适于LAMP的引物序列,分别通过LAMP荧光扩增曲线(加SYTO-9 荧光染料),以及LAMP可视化观察扩增产物的颜色变化(加钙黄绿素),开展特异性、灵敏度和重复性试验分析。结果 确定煮沸法为适合于弧菌基因组DNA提取的快捷方法;优化筛选的引物可以特异地检测创伤弧菌,检测核酸浓度的灵敏度可以达到10 fg/μL,并且结果稳定、可靠。采用该方法进行实际样品的检测应用,在558份水体样品和655份水产品样品中,创伤弧菌阳性检出率分别为9.01%和8.60%,阳性检出率高于传统的分离培养鉴定结果。结论 低技术要求、低设备成本以及检测时间短使得可视化LAMP快检方法成为现场可使用的一个理想选择,对于水产养殖业来说也更方便。     

环介导等温扩增技术检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的研究

采用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)快速检测小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)。以小肠结肠炎耶尔森氏菌(AY004311.1)Ail基因序列作为靶序列,设计内、外引物,通过肉眼观察沉淀判断检测结果。结果表明:LAMP检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的灵敏度为6.3cfu/mL,人工污染鸡肉的检出限为340cfu/g。PCR检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的灵敏度为630cfu/mL,人工污染鸡肉的检出限为3.4×104cfu/g。采用试剂盒法提取DNA,从样品处理到报告结果,LAMP方法耗时2h,PCR方法耗时3h。因此,LAMP检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的灵敏度高,耗时短,特异性好,操作简便,无需特殊的仪器设备,适合在我国广大基层实验室开展应用,为快速检测食源性致病菌构建了一个新的技术平台。