碱性磷酸酶检测方法研究进展

碱性磷酸酶（ALP）广泛的存在于人体内,它可以控制多种生物体内的生物过程,目前已经广泛地被的应用于临床、生物、医学等各个领域。作为一个与多种疾病有关的生物标志物和研究实验的主要工具酶,对ALP进行分析的经典方法已经不能满足新类型样品对灵敏度、精度、抗干扰性和广泛针对性的需求。因此,为了更好的研究检测ALP的方法,我们阐述了国内外最新的ALP提取方法和检测技术,同时将这些研究的主要优缺点进行了总结和比较。最后,我们对ALP检测技术的发展前景和研究趋势进行了探讨,希望为今后的工作提供一些启示。     

大肠杆菌碱性磷酸酶制备及动力学性质的研究

以大肠杆菌为菌种液体培养制备碱性磷酸酶,研究确定产酶的最佳工艺条件,并对碱性磷酸酶的酶促反应动力学性质进行初步探讨.结果表明,大肠杆菌碱性磷酸酶制备的最佳工艺条件为:装液量180mL/500mL三角瓶,接种量5%,初始pH值为7.8,35℃振荡培养20 h,酶活最高.对碱性磷酸酶的动力学性质研究表明,该酶催化底物磷酸苯二钠水解反应的最适温度为76℃,最适pH值为10,在最适条件下测得动力学参数Km值为0.68 mmol/L.     

海参肠碱性磷酸酶的提取及粗酶的特性研究

碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)是最重要的磷酸酶之一,在生物体内直接参与磷酸基团的转移和代谢过程。本文研究了海参肠碱性磷酸酶粗酶的提取,并分析了其酶学特性。经含有0.2%Triton X-100的Tris-HCl缓冲液(pH 8.9)浸提、正丁醇处理、70%硫酸铵沉淀和超滤等步骤获得海参肠ALP粗酶,纯化倍数达到2.74倍,得率为63.32%。ALP粗酶的最适反应pH为11.0,在pH 10.0～12.0稳定性较好;最适反应温度为45℃,在20～45℃具有很高的稳定性。金属离子Mg2+(1～30mmol/L)、Zn2+(<10mmol/L)对海参肠ALP粗酶具有显著的激活作用;Fe3+、Fe2+、Cu2+和Mn2+(10mmol/L)可明显抑制该酶活力。EDTA-Na2、DTT、Na2WO4及Na2HPO4对海参肠ALP粗酶有明显的抑制作用,抑制程度依次为:EDTA-Na2>DTT>Na2WO4>Na2HPO4。     

骨形态发生蛋白-7在E.coli中的可溶性表达

骨形态发生蛋白-7(BMP-7)属于转化生长因子(TGF-β)家族中的成员,有很强的骨诱导作用.为了获得可溶性的rhBMP-7,利用SOE-PCR法获得链球菌G蛋白B1域(GB1)目的基因,构建GB1、连接肽、6His-tag、EKsite (Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)和BMP-7融合表达型载体,转化E.coliBL21 (DE3).工程菌在28℃下经0.1 mmol/LIPTG诱导后,可获得表观分子量约为28 kD的以可溶形式表达的GB1-BMP-7融合蛋白.     

P17菌株产生磷酸酶的影响因素及其定域研究

巨大芽孢杆菌P17菌株能够有效地改善植物对土壤中磷素营养的吸收状况,磷酸酶在该过程中发挥着重要作用,本文旨在研究该菌株在溶磷过程中磷酸酶的定域及其活性影响因素,以深入探讨该菌株的作用机制.该研究在摇瓶条件下分别比较了P17菌株的生物量及其产生磷酸酶的活性;进而根据磷酸酶的诱导特性研究了不同发酵条件对该菌株产生磷酸酶活性的影响,确定了磷酸酶在巨大芽孢杆菌P17菌株细胞内的定域情况.结果表明P17菌株在以葡萄糖为碳源、以黄豆粉、胰蛋白胨等复合氮源为氮源时磷酸酶活性最高;其定域试验证实酸性磷酸酶和碱性磷酸酶均属于胞外酶,阐明了该菌株促进植物磷素营养吸收的作用机制.     

氯原酸对成骨细胞增殖及碱性磷酸酶活性影响

研究氯原酸(Chlorogenic acid,简称CHA)对体外培养成骨细胞增殖及碱性磷酸酶活性的影响。采用MTT法检测CHA对成骨细胞增殖的影响,碱性磷酸酶(ALP)试剂盒比色法检测CHA对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响。不同浓度的CHA对成骨细胞增殖具有不同程度的促进作用,10μmol/L,100μmol/L CHA的促进作用较为明显;培养第3d,10μmol/L CHA对成骨细胞碱性磷酸酶活性的表达呈现上调作用。CHA具有一定的成骨活性。     

纤维素酶E_5基因在E.coli中的克隆与表达

将含纤维素酶 E5基因的质粒 p D5 4 1用 Nco I和 Eco R I双酶切后 ,经电泳分离获取含 E5基因的小片段 ,将该片段定向插入表达质粒 p SE4 2 0的多克隆位点上 ,进一步将重组 DNA转入大肠杆菌宿主 .采用刚果红染色法检测出选择性平板上的转化子具有羧甲基纤维素酶 (CMCase)活性 .摇瓶产酶试验进一步表明 ,基因重组后的大肠杆菌能高效表达 E5基因并将产物分泌出胞外 ,培养液中可检测到的CMCase活力达 31.6 U/ m L .该研究结果为进一步构建高效纤维素分解菌株打下了良好的基础 ,具有重要的学术意义和实际应用价值 .     

碱性激发钢渣水化活性的研究

介绍了采用各种碱性激发剂对转炉钢渣水化活性激发情况,用90%钢渣、5%碱性激发剂、5%无水石膏混合配制钢渣水泥时发现:采用含Na2SiO3的固体复合激发剂可以获得和水玻璃相近的激发效果,其中28 d的抗折强度为3.7 MPa,抗压强度为17MPa,采用固体碱性激发剂激发10%熟料、40%高炉矿渣和40%钢矿渣水泥样品的抗折强度和抗压强度可以达到5.2,24 MPa.     

人防御素HNP-1在大肠杆菌中的融合表达及可溶性研究

根据大肠杆菌密码子偏爱性用PCR方法分别获得人防御素HNP-1基因序列,利用SOE技术和不含信号肽的DsbA基因片段拼接后将产物克隆到质粒pET-11b中构建人防御素HNP-1与分子伴侣DsbA的融合表达载体,转化E.coliJM109,提取阳性克隆进行测序后抽取质粒转化表达宿主E.coliBL21（DE3）.工程菌经IPTG诱导后可在胞内以可溶形式大量表达DsbA-HNP-1蛋白.重组蛋白经亲和层析法纯化后达到电泳纯,经体外复性,在抗菌试验中表现出对短小杆菌的抗菌活性.     

响应面设计法优化GST发酵培养基

利用响应面方法对重组谷胱甘肽硫转移酶表达菌株E coliBL21(DE3)PGEX发酵生产谷胱甘肽硫转移酶(GST)的培养基进行了优化。用Plackett-Burman实验方法研究葡萄糖、酵母膏和MgSO4等20个营养因子对产GST活力的影响,结果表明主要影响因子为葡萄糖、酵母膏和MgSO4。根据实验结果对主要影响因子的浓度范围进行估计,然后用Box-Behnken设计及响应面分析确定主要影响因子的最佳浓度。结果表明当葡萄糖浓度为42.06 g/L,蛋白胨浓度为10g/L,酵母膏浓度为8.47 g/L,NaCl浓度为1 g/L,MgSO4浓度为1.62 g/L时,E coliBL21(DE3)PGEX产GST活力达到633.9 mmol/(L.h),较原始培养基的活力提高了63.75%。     

重组降血压肽基因工程菌破碎方法研究

对重组降血压肽基因工程菌细胞采用反复冻融法和超声波破碎法分别进行了破碎研究,并通过结晶紫染色镜检和亲和柱层析2种方法对所得细胞破碎效率进行了比较.结果表明,重组降血压肽基因工程菌最佳破碎方法为反复冻融7次,在此条件下,GST(谷胱甘肽转移酶)融合蛋白通过亲和层析柱后的吸附率可达80%以上.     

透明颤菌vgb基因整合型大肠杆菌的培养特性

透明颤菌血红蛋白(VHb)是一种氧调节、氧结合蛋白，其基因vgb的表达在转录水平上受氧调控。大肠杆菌E.coli BV是采用基因同源重组方法将vgb基因整合到基因工程常用宿主菌E.coli BL21中构建得到的。研究了不同价态的铁离子对同源重组菌的生长特性及VHb合成的影响，研究表明，0．2mmol/L的二价铁离子具有促进VHb表达从而刺激菌体细胞生长的作用。在0．1L／h低通气量条件下，E．coli BV分别进行间歇培养和流加培养，低溶氧刺激VHb在短时间内迅速大量合成，改善了细胞内氧的传递性能，使生长期分别延长到25h和45h，生物量(DCW)分别达到9．6g/L和26g/L。     

甘氨酸氮源对大肠杆菌代谢的影响

在全合成培养基中,以甘氨酸为限制氮源,利用GC-MS分析方法对E.coli的野生型菌株Y1.1566及其琥珀酸脱氢酶基因缺失突变株ΔsdhAB (S)两株菌进行胞内代谢产物分析,通过应用多变量统计分析发现在两株菌代谢产物中至少8种化合物发生显著变化,其中以D-葡萄糖苷变化最为显著.对检测到的细胞内主要氨基酸进行相关分析...     

人参皂苷葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及包涵体的变复性

将人参皂苷葡萄糖苷酶的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET32a(+)中,构建重组质粒,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。对该基因进行诱导表达,并对包涵体进行变性和复性。结果显示,经终浓度为0.5mmol/L IPTG在30℃下诱导表达4h,进行SDS-PAGE分析,目的蛋白主要以包涵体形式存在并确定其分子质量约为75ku,与理论值基本相符,表明该基因得到了表达。包涵体经过变性和稀释复性后,经TLC活性检测,能够水解底物Rb1,表明具有人参皂苷葡萄糖苷酶的活性。     

大肠杆菌ATCase抗反馈抑制突变体的构建及其对胞苷积累的影响

为解决胞苷生物合成途径中天冬氨酸氨甲酰转移酶受胞苷三磷酸反馈抑制调节的问题,通过对其碱基序列和蛋白质结构分析,利用基因定点突变的方法构建了大肠杆菌的ATCase突变酶,得到三个突变体：M1（H20L）、M2（K60E）、M3（K94E）,并在E.coli DH5α中对融合蛋白进行了表达．酶活测定表明,M1、M2、M3的ATCase酶相对活性都比野生型M0的高,分别为野生型M0的1．10、1．22和1．37倍,且比活力都有不同程度提高．与含野生型pyrBl基因的M0相比,含突变型基因的M1、M2和M3均对15mmol／L的CTP具有强的抗反馈抑制作用,且M1、M2和M3的抗CTP反馈抑制作用分别是M0的5．4、6．0和8．5倍．最后将各突变质粒转入到E．coli Cytl0（Acdd）中进行发酵培养,结果表明,与未含突变基因菌株相比,各含突变基因菌株的胞苷积累量均有不同程度的提高,说明ATCase定点突变使胞苷的合成积累途径得到了不同程度的强化．     

抗大肠杆菌荧光抗体的制备及其特性

活体大肠杆菌与弗氏不完全佐剂乳化后注射到新西兰大白兔体内15d后,利用两步沉淀法提取并纯化得到大肠杆菌表面蛋白抗体IgG,与FITC的交联率F/P达到2.7,未发现FITC对大肠杆菌表面蛋白抗体的特异性有显著的影响。将抗大肠杆菌荧光抗体注入小白鼠体内后,除肠道内有荧光显示外,肝脏、心脏、肾脏中未发现荧光显示,表明大肠杆菌只在小白鼠大肠存在,根据观测到的荧光强度可定性和定量地判断大肠中的大肠杆菌。     

PSTI1可提高大肠杆菌应答胁迫能力

指出含典型34肽重复序列结构域(tetratricopeptide repeat,TPR)的胁迫诱导蛋白(stress-in-ducible protein-1,STI1)是真核生物特有的一类与胁迫应答有关的分子伴侣蛋白.作者从多头绒泡菌分离出一个STI1类似蛋白cDNA,因其编码蛋白含有两个非典型的TPR结构域,命名为PSTI1.为了解PSTI1对原核生物胁迫应答功能的影响,观察表达PSTI1的大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)与原菌株的增殖差异,发现PSTI1表达菌耐受盐、渗透压、重金属离子、氧化、缺氧和酸碱变化胁迫的能力均增强,但对高温敏感.PSTI1保守结构域TPR1能提高E.coli耐受渗透压胁迫的能力,但TPR2会使E.coli对盐和渗透压胁迫敏感,说明TPR1和TPR2在PSTI1调控胁迫应答中可能扮演不同角色.通过pull-down和质谱分析技术检测了与PSTI1作用的E.coli蛋白,发现PSTI1能与E.coli的HtpG(Hsp90)、La蛋白酶和过氧化氢酶HpII等作用,说明PSTI1具有原核生物非典型TPR结构域蛋白的类似功能,是类似STI1的胁迫应答蛋白.     

念珠藻Fe-SOD基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

根据低等物种Fe-SOD核酸序列设计简并引物，以念珠藻基因组为模板，扩增获得了念珠藻Fe-SOD基因.将此基因重组至原核表达载体pET22b（＋），构建成工程菌pET-SOD，并转化至大肠杆菌宿主.异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达获得Fe-SOD蛋白分子量约为28 kD，占全菌蛋白的78％，并以包涵体形式表达.经Ni2＋亲和层析柱纯化后，目的蛋白的SOD比活力达1 100 U/mg，在紫外可见光谱中表现出金属Fe的特征峰.肿瘤细胞共培养试验表明，此Fe-SOD具有一定的抗SPC-A-1肺腺癌细胞增殖的能力.     

体育课教学模式改革与体育教师地位的思考

就体育课新的教学模式与体育教师位置的变革问题进行探讨,提出:体育课教学应由旧的、封闭单调的模式向新的、开放灵活的模式转变,体育教师是引导学生自主学习的中枢;体育课教学要求教师完成自身位置的变革,注重学生的能力培养;体育教师要努力做到因材施教,教学模式要由整齐划一转向个性化教学。