烟草NtLS基因RNA干扰表达载体的构建及遗传转化

腋芽的形成涉及多个调控基因,其中关键基因编码的蛋白属于植物特有的GRAS蛋白家族,它的突变或功能缺失将影响腋生分生组织的形成。笔者利用RACE技术克隆了烟草NtLS基因(GenBank登录号EU935581),NtLS与调控植物腋生分生组织形成的基因LS/LAS/MOC1序列高度相似。本研究从该基因上选取干扰片段,构建了含有反向重复序列的RNAi干扰表达载体,并通过农杆菌侵染的方法转染烟草W38,以期为NtLS基因的功能研究奠定基础。     

烟草侧芽生长相关基因克隆及RNAi载体的构建转化

为了培育打顶后不长侧芽的烟草植株,通过同源克隆,在烟草(品种K326)中得到了与侧芽生长相关基因的1个片断,将该片段序列通过BLAST检索Genbank同源比对,发现该基因同番茄的LS基因有非常高的同源序列,另外与水稻的MOC基因、拟南芥的LAS基因也有一定的同源性,命名为TLR基因.将TLR基因阅读框内640 bp的正向和反向片断构建到RNAi载体pHANNIBAL内含子两侧,再经NotI酶切回收约4300 bp目的片段,并插入到双元载体质粒pART27中,成功构建了含TLR基因片段正反向重复序列的植物表达载体pHANNIB AL-TLR-P ART27.将pHANNIB AL-TLR-P ART27质粒导入根癌农杆菌LBA4404中并转化烟草叶片细胞,没有得到转基因再生植株,推测这与TLR基因表达被抑制有关.     

马铃薯块茎启动子驱动的淀粉合成酶基因RNAi载体构建及遗传转化

以马铃薯gbss、ssⅢ与ssⅡ基因的部分c DNA片段拼接成的融合基因gbs_3s_2为靶标,构建以马铃薯块茎组织特异性启动子GBSS驱动的RNAi表达载体p ART-GF。采用农杆菌介导法对NHD3、NF和NC三个马铃薯品种进行了遗传转化,用PCR技术检测转基因植株,采用双波长法测定其微型薯中直链淀粉与支链淀粉的比值。经抗性筛选及PCR检测初步获得10株阳性植株,其中NC、NF和NHD3分别为2株、3株和5株,其微型薯中直链淀粉/支链淀粉比值明显下降。作者成功构建了马铃薯块茎启动子GBSS驱动的淀粉合成酶基因RNAi三价表达载体,初步获得了转基因马铃薯育种材料。     

烟草抗病毒相关R基因RNAi 表达载体的构建

RNA 干扰介导的基因沉默是植物抗病育种和大规模分析功能基因快速而有效的方法。构建烟草抗病毒病相关 R 基因的RNAi表达载体并导入烟草可获得抗病毒病烟草材料,并为大规模分析鉴定烟草功能基因提供新方法。本研究利用绒毛状烟草基因组测序获得的 R 基因序列设计引物,通过 PCR 技术扩增出带有特异性结合位点 attB 的 R 基因部分序列。采用GATEWAY 方法将目的基因的干扰片段插入到表达载体 pH 7 GWIWG2(I),成功构建了烟草抗病毒病相关 R 基因的 RNAi表达载体。     

烟草CN基因的RNA沉默载体构建与功能分析

黄花烟HZNH是我国特有的地方种质资源,接种烟草花叶病毒(TMV)后表现出超敏反应和系统获得性抗性。目前,已从HZNH中克隆到1个同TMV抗病基因N基因同源的基因,命名为CN基因。为方便利用RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术研究烟草CN基因的功能,构建了用于RNAi的植物转化载体pPZYICN。通过农杆菌介导的叶盘法转化含N基因的烟草Xanthi-nc,获得了32株转基因植株,TMV接种后,转基因Xanthi-nc没有丧失对TMV的抗性,说明CN基因的RNA干扰载体不能沉默N基因的表达,故CN基因可能是HZNH中特有的抗性基因,从而为获得新的烟草抗病基因及抗病品种奠定基础。     

扩张蛋白swollenin基因香菇表达载体构建及其初步转化

构建含有Swollenin基因(swo基因)的香菇表达载体,并通过PEG(polyethylene glyeol)介导的原生质体转化法实现对香菇的遗传转化,转化效率约为1个转化子/μg质粒DNA。PCR和杂交检测结果表明,swo基因已经整合到香菇的基因组中;栽培实验结果表明,两个转化子都能正常出菇,而且转化子Ⅱ表现出优良的生物学性状,将swo基因转化到香菇中对香菇新品种的培育进行探索。     

烟草查尔酮异构酶基因2(NtCHI2)功能分析

烟草查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)是黄酮类代谢的一个关键酶,烟草中有两个基因拷贝(NtCHI1、NtCHI2),相关研究多集中在NtCHI1基因,对NtCHI2的研究较少。为研究烟草NtCHI2的功能,主要以NtCHI2的过表达和干扰植株叶片为材料,进行了实时定量PCR和CHI活性分析以及芸香苷含量检测,同时进行了NtCHI2体外表达蛋白的酶活分析。结果表明:NtCHI2体外表达蛋白具有查尔酮异构酶活性;过表达株系中NtCHI2的表达量升高5～75倍,但CHI酶活性和芸香苷含量基本没有变化;干扰株系中NtCHI2的表达量降至70%,CHI酶活性和芸香苷含量分别降低50%和90%。烟草NtCHI2参与芸香苷的合成代谢调控,在一定程度上NtCHI2基因的表达量和芸香苷的含量正相关。     

茶叶CHS基因表达特性及其与儿茶素积累的关系

本研究用高效液相色谱法(HPLC)测定两种茶叶的儿茶素含量,通过RT-PCR克隆英红9号(YH)和南昆山毛叶茶(MY)的CHS基因进行比对分析,借助烟草瞬时表达技术对基因表达蛋白进行亚细胞定位;结合生物信息学分析选取特定肽段经人工合成后作为抗原制备CHS基因特异抗体;用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术和Western blot技术测定比较两种茶叶CHS基因在转录、翻译水平的差异,并对比分析了两种茶叶间儿茶素含量差异与相应CHS基因表达的关系。结果表明:YH和MY中的儿茶素含量分别为181.51 mg/g和106.02 mg/g,前者显著高于后者并达到1.71倍;两种茶叶中所克隆的CHS基因具有单核苷酸差异但编码相同的氨基酸序列,其表达蛋白亚细胞定位于细胞质、细胞膜和细胞核;制备的CHS蛋白兔源抗体效价为1:80000;CHS基因在YH中的表达无论在转录水平还是在翻译水平均显著高于MY,前者分别是后者的3.9倍和1.7倍,两种茶叶中CHS合成酶基因在转录、翻译水平的表达均与其对应的儿茶素积累水平一致。实验研究证明,茶叶儿茶素积累水平与其合成通路关键酶基因CHS的表达呈正相关。     

转几丁质酶基因烟草遗传稳定性研究

从转几丁质酶基因烟草株系(NPTII基因是选择标记基因)对卡那霉素的抗性,及外源几丁质酶基因表达蛋白的活性(Western Blot检测)两个方面对转基因株系的遗传稳定性进行了分析研究。在卡那霉素抗性检测试验中,检测了13个T₂转基因株系,其中9个株系被检测种子100%对卡那霉素(100 mg/L)具有抗性;T₃和T₄转基因株系各检测了10个,100%被检测种子在含卡那霉素100 mg/L的MS培养基上长成了烟苗。Western Blot检测了11个T₂株系,检测结果表明,6个株系被检测植株100%含有外源几丁质酶蛋白,2个株系被检测植株80%含有外源几丁质酶蛋白,2个株系被检测植株50%含有外源几丁质酶蛋白,1个株系被检测植株19.05%含有外源几丁质酶蛋白。在温室内将转基因烟草与未转基因烟草密植在一起,种植2代,烟株开花期模仿自然风力对烟株吹风,进行了转基因烟草是否可以通过花粉进行基因漂移的研究。研究结果表明,在自然风媒条件下未发现转基因烟草可进行基因漂移。      

青霉遗传转化系统的研究进展

青霉在自然界中是普遍存在的,在工业、农业和医药领域有着重要的应用和研究价值,有关青霉的遗传转化体系已经建立。就青霉的转化方法、转化载体启动子的选择、选择性标记及其在青霉研究中的应用进行了综述。     

平菇疏水蛋白Po.hyd基因RNAi载体构建及转化

为研究平菇疏水蛋白基因Po.hyd的功能,首次构建了Po.hyd的RNAi载体,并通过根癌农杆菌介导获得了平菇转化子。通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增Po.hyd序列,利用Golden Gate克隆法构建了干扰载体p1302-GG-ihyd,将其导入根癌农杆菌GV3101中,并在乙酰丁香酮的诱导下完成根癌农杆菌对平菇幼嫩菌丝的介导转化。转化子经PCR检测、荧光显微镜观察、实时定量荧光PCR技术（real-time PCR）以及Southern杂交等技术进行验证。结果显示,本研究最终获得1 株可稳定遗传的平菇转化子,该转化子具有潮霉素抗性,且在荧光显微镜下可检测到绿色荧光信号,Po.hyd基因的表达量为野生型的43%,干扰载体T-DNA片段以单拷贝的形式整合在转化子基因组内。     

非病毒基因载体在肺癌基因治疗中的应用

对近年采用非病毒载体(裸DNA、阳离子聚合物、阳离子脂质体)治疗肺癌的基本原理和研究进展作一综述。此法有望成为治疗肺癌的新方案。     

Cams1基因在烟草上的同源克隆及生物信息学分析

为拓宽烟草不育基因的来源,依据辣椒雄性不育基因Cams1序列,在烟草品种K326中同源克隆获得基因Ntms1,采用生物信息学方法对辣椒Cams1基因和烟草Ntms1基因的核苷酸序列、蛋白质结构、亲疏水性及结构域等进行分析,并利用CRISPR/Cas9技术对Ntms1基因功能进行了验证。结果表明,Cams1基因和Ntms1基因的蛋白质序列相似度为85.25%,基因编码产物具有相同的PHD功能结构域,都具有磷酸化识别位点,有相似的二级和三级蛋白质结构,且两个基因都没有信号肽和跨膜区的结构,推测烟草Ntms1基因与辣椒不育基因Cams1具有相似的控制育性功能。遗传转化结果表明,突变株的Ntms1基因表达量和有活力花粉量极显著低于野生型植株,证明了烟草Ntms1基因具有控制烟草花粉育性功能。     

烟草突变体库及其在功能基因组研究中的应用

烟草突变体是烟草功能基因组学研究的重要材料。本文综述了烟草突变体在功能基因研究中的作用,构建烟草突变体库的必要性以及烟草突变体库的构建方法,并展望了烟草突变体库在烟草功能基因组学中的应用。     

烤烟CMV抗性基因QTL定位

利用SSR 技术,在抗CMV 烟草中发掘与抗病基因紧密连锁的分子标记,目的是为抗病基因的定位克隆以及培育抗病新品种奠定基础。本研究以抗CMV 的烤烟品种台烟8 号、感病品种NC82 为亲本,构建BC₁ 代分离群体,对其进行抗性遗传分析。对分布于烟草24 条连锁群上的2317 个SSR 位点进行了多态性筛选,获得了62 个稳定多态性标记,利用这些标记对288 株BC₁群体分型数据,用WinQTLCart2.5 进行分析,找到一个与抗性相关的QTL,LOD 值为2.6。研究结论表明,台烟8 号对CMV 的抗性由多基因控制,标记53735 与抗性QTL 紧密连锁,遗传距离为0.1 cM,该QTL 位于10 号连锁群,贡献率为13%。     

fps转基因烤烟类胡萝卜素及其降解产物的研究

为探索法呢基焦磷酸合酶(fps)对烤烟中类胡萝卜素及其降解产物的影响,利用常规和GS/MS方法,对转fps基因烟草株系(K-4、K-6、K-17、K-35)烤后烟叶中类胡萝卜素含量及萜烯类香气物质含量进行了分析,结果发现,烤后烟叶类胡萝卜素含量有较大差异,与未转基因对照相比普遍有所提高,其中K-35含量最高;8种类胡萝卜素降解产物及茄酮、新植二烯含量有不同程度的提高,其中K-35香气降解产物含量整体较高,表明外源fps基因在烟草中的表达对类胡萝卜素合成具有促进作用,从而有利于烟叶品质的提高。     

烟草N基因及其介导的抗TMV信号转导分子机制

烟草N基因来源于粘烟草（Nicotiana glutinosa）,通过特异识别烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）的解旋酶结构引发植物的过敏性坏死反应,介导植物对该病毒的抗性。N-TMV互作是研究最早且最深入的植物-病原菌互作的模型之一。从N基因的分离、转录表达、编码产物结构及其抗TMV信号转导分子机制等方面进行了综述。