表面活性剂辅助溶菌酶复性:表面活性剂-蛋白质复合物结构分析

研究了十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）辅助天然溶菌酶的复性过程及其影响因素.发现向复性液中单独添加低浓度CTAB即可导致溶菌酶复性,且当变性溶菌酶浓度在0.2 mg•ml^-1以上、CTAB与溶菌酶的摩尔比为10时复性效果最佳.采用表面张力、离子交换色谱、非还原性SDS-PAGE及荧光发射光谱法对复性体系进行物性和结构分析,显示CTAB可与变性溶菌酶形成不同结构的表面活性剂-蛋白质复合物,且复合物的组成和结构可随时间发生变化.最后,对于表面活性剂-蛋白质复合物形成过程机理进行了探讨.     

CTAB辅助溶菌酶复性过程动力学

研究了溶菌酶在十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）溶液中的复性过程,通过测定溶液表面张力与酶活力的变化证实变性溶菌酶首先与CTAB形成复合物,进而在氧化-还原剂作用下开始复性并与CTAB发生解离.非还原型SDS-PAGE分析结果表明,复性反应的主要产物有三类：具有天然结构的溶菌酶单体、溶菌酶多聚体及溶菌酶单体与CTAB形成的无活性复合物.不同产物的含量取决于溶液中CTAB与溶菌酶的摩尔比.当变性溶菌酶浓度为0.1～0.4mg•ml^-1,CTAB与溶菌酶摩尔比为5～20时,采用“变性-复性”二态复性模型分析了CTAB辅助溶菌酶复性过程的宏观动力学.结果表明,随CTAB与溶菌酶摩尔比的增大,变性反应的速率常数显著增大,而折叠反应的速率常数先增大后减小,CTAB与溶菌酶的摩尔比为10时,复性率最高.而蛋白质浓度提高则导致折叠反应速率常数减小,变性反应速率常数增大,复性率缓慢下降.     

疏水层析法复性重组人γ-干扰素

重组人γ-干扰素（rhIFN-γ）在大肠杆菌中高效表达,并形成包涵体.利用疏水作用层析（HIC）法对rhIFN-γ 进行复性.采用了等尿素梯度和线性尿素梯度两种复性方法,考察了线性尿素梯度下尿素梯度长度、尿素终浓度、流速和上样量对rhIFN-γ复性的影响.在优化的线性尿素梯度复性条件下,尿素浓度在10个柱体积内从6 mol•L^-1下降到2 mol•L^-1,流速为1 ml•min^-1、上样量为0.568 mg时,rhIFN-γ的活性收率比稀释复性法提高6.5倍,蛋白质量收率为36%,比活达1.9×10⁸ IU•mg^-1.     

重组人干扰素-γ的复性方法在不同规模中的应用

目的 观察重组人干扰素－γ复性方法在不同规模中应用效果。方法 用高压匀浆法破碎工程菌, 提取包涵体,经变性剂溶解后快速稀释进行复性。结果 在实验研究、中试、扩大试制、试生产和大规模生产中,生 物活性恢复良好,纯度也有提高。结论 此种复性方法简单、快速,活性提高３．０５～５．６５倍。     

重组人γ-干扰素包涵体稀释复性

采用稀释法研究了重组人γ-干扰素包涵体复性条件,如温度、pH值、蛋白浓度、复性液中脲浓度,同时对加样操作方式进行了考察,得到了较为适宜的复性条件.结果表明,脲能有效地抑制复性过程中蛋白质的聚集,合适的脲浓度随复性蛋白浓度的增加而有所增大,在4℃、pH值8.0、脲浓度1.0mol•L^-1、蛋白浓度0.1mg•ml^-1及脉冲加样操作方式等条件下,复性后重组人γ-干扰素的活性为2.39×10⁵ IU•ml^-1,比活达2.21×10⁷ IU•mg^-1.     

重组人成骨蛋白-1复性条件的优化

目的优化重组人成骨蛋白-1(rhOP-1)包涵体蛋白的复性条件。方法将表达rhOP-1的大肠杆菌菌体在冰浴下超声裂解,分离提取包涵体,用8mol/L尿素溶解,纯化后进行梯度透析复性。利用TotalLab软件分析目的蛋白二聚体的含量,用体内法和体外法测定其生物学活性。结果经纯化后,目的蛋白纯度达97%以上。最佳复性条件为4℃,pH9.0,蛋白浓度为0.4～0.8mg/ml,尿素浓度为2mol/L,L-Arg浓度为0.4mol/L;目的蛋白复性率达75%以上,复性后蛋白具有较高的生物学活性。结论已确定了rhOP-1包涵体梯度透析复性的最佳条件。     

L-精氨酸助溶菌酶复性过程动力学研究

通过测定复性后酶活性和计算蛋白复性收率,研究了L-精氨酸助溶菌酶的最佳复性条件,利用蛋白质的复性和聚集反应竞争三态动力学模型描述了L-精氨酸助溶菌酶复性动力学,在溶菌酶浓度为100~500μg.mL-1、L-精氨酸浓度为0~1.0 mol.L-1的条件下,分析了溶菌酶浓度及L-精氨酸浓度对复性动力学常数的影响。结果表明,L-精氨酸助溶菌酶复性符合三级聚集反应动力学,L-精氨酸的主要作用是抑制蛋白聚集体的生成速率,从而达到抑制蛋白沉淀、提高复性收率的效果。     

胆固醇配基色谱在蛋白质复性中的应用

以三聚氯氰为连接臂,采用两步法将疏水配基胆固醇修饰到交联琼脂糖（Sepharose）介质上,构建了胆固醇配基色谱。以溶菌酶（Lys）为模型蛋白,考察了胆固醇配基色谱的复性效果,并研究了流速、上样质量浓度和上样量对色谱复性效果的影响,确定了溶菌酶复性的最佳方法。研究结果表明,当溶菌酶上样量为1.00 mL,介质含0.25 mg溶菌酶时,在0.02 mL/min操作流速下进行吸附-洗脱复性,其最终蛋白收率和活性收率分别为96.3%和91.4%,有效促进了溶菌酶的复性。     

蛋白质在层析过程中的失活与复性

在层析分离过程中,层析的固相介质和溶液环境会引起蛋白质的结构变化：天然的蛋白质可能会降低活性甚至完全失去活性,而结构变化了的蛋白质也可能重新折叠恢复活性.此类现象已经引起研究者特别是生化工程学家的关注,层析介质的种类和操作手段是影响此两个过程的关键因素.利用不同的层析方法,对不同的蛋白质采取相应的措施有利于提高活性蛋白质的回收率,具有重要的理论和应用价值.     

重组蛋白的体外复性技术研究进展

概要介绍了重组蛋白体外复性的意义,该技术的难点及现有复性方法的局限性.并重点阐述了色谱复性和分子伴侣体外复性技术的原理、特点及在基因工程药物生产过程中的应用,结果表明新型重组蛋白复性技术可将复性收率提高至80%-100%,有望解决基因工程产业化的关键技术.     

表面活性剂辅助蛋白质体外折叠：分子模拟

采用分子模拟方法考察表面活性剂与蛋白质分子之间的相互作用及其对蛋白质折叠过程热力学特性的影响，蛋白质分子构建采用HP模型并引入了方阱类势函数.模拟结果显示：模型蛋白分子的某些折叠中间态会陷入局部能量最低状态而无法完成折叠;弱疏水性表面活性剂对模型蛋白的稳定性影响小，但可有效地帮助处于局部能量最低状态的蛋白折叠中间态通过能量壁垒而实现折叠;强疏水性表面活性剂则可与蛋白质形成高稳定性的复合物而阻止折叠的进行，需将其脱除才能使折叠过程重新开始.模拟结果还显示：表面活性剂的加入会使蛋白质折叠中间态更加丰富，从而能够光滑折叠过程中的能量阱;表面活性剂与变性环境对于蛋白质的折叠具有协同效应.模拟结果与文献报道的实验结果具有一致性，显示分子模拟的方法在揭示蛋白质折叠过程的微观机理以及表面活性剂类折叠助剂的分子设计方面有很好的应用前景.     

海藻糖对变性溶菌酶的促进复性作用及动力学

研究了海藻糖促进变性还原溶菌酶的复性作用,考察了不同盐酸胍浓度下海藻糖浓度对复性收率的影响,并利用表观竞争反应动力学模型分析了海藻糖辅助溶菌酶的复性动力学特性.结果表明,在海藻糖存在下,聚集体生成速率常数k_A明显减小,但复性速率常数k_N变化不大;随海藻糖浓度的增大,k_A先降低后升高,在合适浓度时k_A出现最小值,由于此时k_N/k_A出现最大值,因此复性收率最大.说明海藻糖的主要作用是有效抑制蛋白质分子间聚集,因此在一定范围内提高其浓度可促进蛋白质复性,从而提高复性收率.     

酰胺类物质辅助变性碳酸脱水酶复性及动力学

研究了酰胺类物质对促进变性牛碳酸脱水酶（CAB）的复性作用,考察了在较低盐酸胍浓度下添加剂浓度对复性收率的影响,并利用三级反应动力学方程对酰胺类化合物辅助CAB复性的动力学过程进行了深入分析.结果表明,含有酰胺基团的多种添加剂均能有效促进CAB复性;酰胺化合物与盐酸胍的作用相似,即复性速率常数k_N值均大于无添加剂时的自发复性,且随添加剂浓度增加而降低;但聚集体生成速率常数k_A值则在最佳添加剂浓度下出现最小值,从而使k_N/k_A值最大,复性收率最大.     

Development of an optimized refolding process for recombinant Ala-Glu-IGF-1

Denatured and reduced N-terminal extended insulin-like growthfactor-1 (AE-IGF-1) was purified from Escherichia coli extractsand subjected to in vitro folding. The renaturation processwas shown to be a function of the redox potential of the solution.Folding by different methods had no significant effect on therenaturation. A maximal yield of 60% (w/w)was obtained. Thefolded AE-IGF-1 was enzymatically converted to IGF-1. The majorby-product (20% w/w) was identified as scrambled IGF-1. Enzymaticdigestion at alkaline and acidic pH suggested two possible disulphidebond arrangements: (i) Cys⁶–Cys⁴⁷, Cys¹⁸–Cys⁶¹,Cys⁴⁸–Cys⁵²; or (if) Cys⁶–Cys⁵², Cys^l8–Cys⁶¹,Cys⁴⁷ and Cys⁴⁸ being in their reduced forms. Energy minimizationand molecular modelling suggested that the scrambled IGF-1,having reduced cysteines at positions 47 and 48, was the energeticallymost stable conformation of the two.     

表面活性剂参与的四苯硼钠与芳卤Suzuki偶联反应

通过加入倦化剂量的表面活性剂,在氯化钯催化的水介质中实现了3,5-二氯苯甲酸、2-溴-4-甲基吡啶与四苯硼钠的Suzuki偶联反应,并且探讨了表面活性剂的用量、反麻温度等条件的影响.在有机溶剂-水介质中,二溴芳烃、三溴芳烃与四苯硼钠反应时,0.05 mmol的苄基三乙基氯化铵的加入可以使相同产物产率下的氯化钯用量由3%...     

Construction of a diabody (small recombinant bispecific antibody) using a refolding system

Diabodies are the recombinant bispecific antibodies (BsAbs),constructed from heterogeneous single-chain antibodies. Usually,diabodies have been prepared from bacterial periplasmic fractionusing a co-expression vector (i.e. genes encoding two chainswere tandemly located under the same promoter). Some diabodies,however, cannot be expressed as a soluble material owing toinclusion body formation, which limits the utilization of diabodiesin various fields. Here we report an improved method for theconstruction of diabodies using a refolding system. As a model,a bispecific diabody binding to adenocarcinoma-associated antigenMUC1 and to CD3 on T cells was studied. One chain consistedof a VH specific for MUC1 linked to a VL specific for CD3 witha short polypeptide linker (GGGGS). The second was composedof a VL specific for MUC1 linked to a VH specific for CD3. Thetwo hetero scFvs were independently obtained from intracellularinsoluble fractions of Escherichia coli, purified, mixed stoichiometrically(at an equivalent molar ratio of 1:1) and refolded. The refoldedtwo hetero scFv has a hetero-dimeric structure, with completespecificity for both target cells [i.e. MUC1 positive cellsand CD3 positive lymphokine-activated killer cells with a Tcell phenotype (T-LAK)]. Evaluation of the in vitro efficacyof T-LAK with the diabody by growth inhibition assay of cancercells demonstrated maximum growth inhibition of cancer cellsto reach ~98% at an effector:target ratio (E:T ratio) of 10,almost identical with that with anti-MUC1xanti-CD3 chemicallysynthesized BsAbs (c-BsAbs). This is the first report of theconstruction of a diabody using a refolding system.     

重组瑞替普酶包涵体制备及其体外复性

将携带重组瑞替普酶(reteplase, rt-PA)的质粒成功转化到大肠杆菌BL21(DE3)后,诱导表达获得包涵体,考察了诱导剂浓度、培养温度和培养时间等条件对目标蛋白表达量的影响。在此基础上,对高效表达的rt-PA包涵体体外复性过程进行了详细研究。首先利用单因素实验考察了复性液pH、GSH浓度、GSH/GSSG比例、蛋白浓度等各种复性条件对复性效果的影响;并结合正交实验设计,进一步研究了高蛋白浓度下复性后rt-PA酶活变化情况。以0.2 mmol·L^-1 IPTG诱导,在33℃下培养6 h,每升发酵液约可获得1.7 g粗制包涵体。适宜的复性条件为蛋白浓度50 mg·ml^-1,pH 10.0,GSH浓度1 mmol·L^-1,GSH/GSSG比例8,复性收率为87.2%。影响高蛋白浓度下rt-PA复性的关键因素为复性液初始pH及GSH浓度,在800 mg·ml^-1蛋白浓度下复性后rt-PA比活可达7.54×10⁴ IU·mg^-1,荧光光谱分析结果表明复性后rt-PA恢复了其天然态结构。     

Surfactant assisted synthesis of nanostructured Mn-doped CuO: An efficient photocatalyst for environmental remediation

The nanostructured Mn-doped CuO material was hydrothermally synthesized using urea as a surfactant to control the shape and size of the material particles. Advanced physiochemical methods were used to look at the microstructure, texture, morphology, and chemistry of the Mn-doped and pristine CuO materials. I–V and UV/visible experiments were performed on doped and un-doped materials to investigate the effect of Mn-doping on electrical conductivity and bandgap. The antibacterial and photocatalytic characteristics of the hydrothermally prepared materials were evaluated and compared through the destruction of Escherichia coli (E.coli) and the photocatalytic mineralization of Rh–B dye. The Mn-doped CuO material has much better photocatalytic activity for the mineralization of Rh–B dye than pristine CuO, with 93.8% dye mineralization after 90 min of visible light illumination compared to 56.52% for pristine CuO. The Mn-doped CuO material mineralized the Rh–B dye at a rate constant (k) of 0.02152 min^?1, about three times faster than virgin CuO (k = 0.00802 min^?1). The Mn-doped CuO material has negligible electron-hole recombination aptitude but quicker charge transport characteristics than the un-doped comparable based on transient photocurrent and impedance testing. The current work shows how to make a doped semiconductive material that can be used to clean up the environment and is versatile, cheap, and very effective.     

重组白喉毒素无毒突变体CRM_(197)柱复性及纯化工艺的优化

目的优化重组白喉毒素无毒突变体CRM197(recombinant cross reacting material 197,rCRM197)柱复性及纯化工艺。方法将Sephacryl S-200凝胶柱复性和Q Sepharose FF强阴离子交换层析结合,复性和纯化rCRM197;通过正交试验L9(34)考察凝胶层析复性时流速、离子交换层析纯化的pH值、淋洗液中NaCl浓度和洗脱液中NaCl浓度4种因素对rCRM197纯度及回收率的影响,筛选rCRM197复性及纯化的最佳工艺。结果包涵体经Sephacryl S-200凝胶柱复性后,相对分子质量小于36 000的杂质已被去除;经Q Sepharose FF离子交换层析后,rCRM197纯度达95%以上;在复性时流速为10 ml/min、离子交换层析纯化的pH值为7.5、淋洗液为50 mmol/L Tris-Cl+30 mmol/L NaCl、洗脱液为50 mmol/L Tris-Cl+50 mmol/L NaCl的条件下,rCRM197能达到纯度和回收率的共平衡。结论已筛选出rCRM197复性及纯化的最佳工艺,该工艺操作简便,制备的rCRM197纯度高,适用于rCRM197的产业化。