重组牛碱性成纤维细胞生长因子治疗口腔溃疡42例

目的研究重组牛碱性成纤维细胞生长因子对口腔溃疡的治疗效果。方法把84例口腔溃疡患者随机分成两组,治疗组42例,用重组牛碱性成纤维细胞生长因子局部喷洒口腔溃疡创面;对照组42例,采用常规治疗方法。结果治疗组4d有效率为97.6%,对照组4d有效率为78.6%,有显著性差异(P<0.05)。结论重组牛碱性成纤维细胞生长因子对口腔溃疡的治疗具有显著疗效。     

重组碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂的制备

目的制备重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)凝胶剂。方法以卡波姆940、甘油、1,2丙二醇为基质,加入复方保护剂(肝素钠、人血白蛋白、甘露醇和HP-β-CD),制成bFGF凝胶剂,观察25和4℃保存的稳定性,并进行家兔局部刺激试验、急性毒性试验、促烧伤创面愈合试验。结果bFGF凝胶剂在25℃保存18个月、4℃保存24个月,效价维持在原效价的80%以上;局部用药未见皮肤刺激反应和急性毒性反应;促家兔烧伤创面愈合的效果明显优于水溶液剂。结论制备的bFGF凝胶剂安全有效,具有缓释作用,稳定性良好,具有广阔的临床应用前景。     

重组人碱性成纤维细胞生长因子工程菌高密度发酵及表达产物的纯化

目的 研究重组人碱性成纤维细胞生长因子工程菌高密度发酵和表达产物的纯化工艺。方法采用最适基质浓度、pH、溶氧量、培养温度等发酵表达条件及产物提纯方法。结果 菌体密度A6000达40.8,表达量达160mg/L。提纯的bFGF回收率为40％,生物学活性（ED50）为 0.21ng/mL,比活性达4.76×106U/mg,其纯度、分子量、残余DNA等各项检测结果均符合“重组 DNA制品质量控制要点”。结论 为hbFGF工业化生产和临床应用提供了依据。     

重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子在CHO-K1-SFS细胞中的表达

目的构建小鼠碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,b FGF,亦称FGF-2)的真核表达质粒,并于无血清悬浮培养的CHO-K1-SFS细胞中进行表达。方法以小鼠垂体组织总RNA为模板,PCR扩增b FGF基因,并克隆至真核表达载体p EGFP-C1,构建重组表达质粒p EGFP-C1-b FGF,经Lipofectamine 2000介导转染无血清悬浮培养的CHO-K1-SFS细胞,荧光显微镜观察CHO-K1-SFS细胞中EGFP的表达情况,普通光学显微镜观察CHO-K1-SFS细胞的生长状况和细胞形态,RT-PCR法检测CHO-K1-SFS细胞中b FGF基因的转录,Western blot法检测CHOK1-SFS细胞中b FGF蛋白的表达。结果重组表达质粒p EGFP-C1-b FGF经双酶切(BglⅡ/SalⅠ)鉴定证明构建正确;重组质粒p EGFP-C1-b FGF转染后24、48、72及96 h的CHO-K1-SFS细胞均可见特异性绿色荧光蛋白表达,重组质粒p EGFP-C1-b FGF转染对CHO-K1-SFS细胞形态和增殖速率不产生影响;p EGFP-C1-b FGF转染组CHO-K1-SFS细胞可扩增出510 bp的目的条带;p EGFP-C1-b FGF转染组可见相对分子质量约44 000的特异性条带,表达产物可与兔抗b FGF多克隆抗体发生特异性结合。结论构建的真核表达质粒p EGFP-C1-b FGF在无血清悬浮培养的CHO-K1-SFS细胞中成功的表达,为进一步实现小鼠b FGF在哺乳动物细胞中的分泌表达及药物开发奠定了基础。     

两种脂质体制备方法对碱性成纤维细胞生长因子活性的影响

目的考察两种脂质体制备方法对碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)活性的影响。方法采用薄膜分散法和冻干重建法制备bFGF脂质体,MTT法检测两种方法制备的脂质体中bFGF的活性。结果薄膜分散法和冻干重建法制备的bFGF脂质体活性分别为1·99×107和1·94×107IU/ml。与对照bFGF水溶液相比,两种脂质体制备方法均未降低bFGF活性,且包封率与粒径差异无显著意义。结论采用薄膜分散法和冻干重建法制备bFGF脂质体,对其活性均无影响。     

重组人酸性成纤维细胞生长因子滴眼液的制备及其稳定性

目的制备重组人酸性成纤维细胞生长因子(rhaFGF)滴眼液,并进行稳定性检测。方法在rhaFGF中添加复方保护剂,并以透明质酸钠作为保湿剂,制备rhaFGF滴眼液,对其进行鉴定和体外药效学检测,并进行稳定性试验。结果制备的3批滴眼液各项质量指标均合格,可促进碱烧伤家兔角膜细胞和鸡胚绒毛膜血管增殖。在4℃保存12个月,-20℃保存18个月,(25±2)℃保存6个月,滴眼液各项质量指标与0月基本一致。结论制备的rhaFGF滴眼液稳定性良好,可促进损伤角膜细胞修复。     

T-钙黏着蛋白与碱性成纤维细胞生长因子在人子宫肌瘤中的表达及其相关性

目的探讨T-钙黏着蛋白(T-cadherin)与碱性成纤维细胞生长因子(basic fibro blast growth factor,bFGF)在人子宫肌瘤中的表达及其相关性,以探讨二者在子宫肌瘤发生、发展过程中的作用。方法收集2011年9～12月间经重庆医科大学附属第一医院诊断为子宫肌瘤并行手术治疗,术后病理报告确诊为子宫肌瘤的患者50例,取其子宫肌瘤组织(A组)及同源正常子宫肌层组织(B组),同期收集经该院诊断为良性疾病并行手术治疗,术后病理报告确诊未患子宫肌瘤的10名患者正常子宫肌层组织作为对照组(C组)。50例子宫肌瘤患者根据术前彩色多普勒血流显像(Color Doppler Flow Imaging,CDFI)和激素水平进一步分组比较。采用SP免疫组化法检测子宫组织中T-cadherin和bFGF蛋白的定位,Western blot和RT-PCR法分别检测子宫组织中T-cadherin和bFGF蛋白的表达水平及基因mRNA转录水平,并分析二者与CDFI分级和激素分期的相关性。结果 A组T-cadherin主要定位于肌瘤细胞膜,bFGF主要定位于肌瘤细胞浆;A组子宫组织中T-cadherin和bFGF基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平均明显高于B组和C组(P<0.05),且二者明显呈正相关(P<0.01);T-cadherin和bFGF基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平均随CDFI等级的升高而增强(P<0.05或P<0.01)。结论 T-cadherin和bFGF在子宫肌瘤组织中高表达,提示二者在子宫肌瘤的发生、发展过程中起促进作用。     

人碱性成纤维细胞生长因子在植物毛状根和毕赤酵母中的表达

目的在植物毛状根和毕赤酵母中表达人碱性成纤维细胞生长因子(Human basic fibroblast growth factor,hbFGF),并对发酵条件进行优化。方法将hbFGF基因分别克隆至表达载体pCAMBIA1301和pPICZα上,构建重组表达质粒pCAMBIA1301-hbFGF和pPICZα-hbFGF。通过发根农杆菌介导,将pCAMBIA1301-hbFGF质粒转入大豆毛状根;采用电转化法将质粒pPICZα-hbFGF转入毕赤酵母X-33菌株,PCR法筛选阳性转化子,诱导表达。筛选高效稳定表达株,发酵培养并优化发酵条件,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物,并进行纯化。结果经酶切及测序证明两个重组表达质粒构建正确;经PCR鉴定证明hbFGF基因已整合入大豆毛状根及毕赤酵母基因组中;筛选出了在两种体系中发酵培养的最佳条件;hbFGF在大豆毛状根和毕赤酵母中的表达量分别占总蛋白的31%和42%,且均具有良好的反应原性;经纯化后,均可见相对分子质量约18000的单一条带。结论 hbFGF能够在大豆毛状根和毕赤酵母中高效表达,为其大规模工业化生产奠定了实验基础。     

碱性成纤维生长因子对皮肤损伤修复作用的研究进展

皮肤损伤是临床常见疾病之一,大多由撕裂、割伤或挫伤等急性创伤导致。在皮肤损伤修复过程中,多种细胞通过分泌细胞因子参与创面愈合,如碱性成纤维生长因子(fibroblast growth factor 2,FGF2或bFGF)、血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)和转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)等,其中FGF2可通过促进血管生成、肉芽形成,减少瘢痕形成,加速上皮化促进伤口愈合。FGF2半衰期短,在体内易受酶和皮肤微环境的影响,在伤口处保留时间短暂,降低了其促进伤口愈合的能力,因此,FGF2的稳定性对其临床用于皮肤损伤修复尤为重要。本文就FGF2的分子结构及功能、FGF2受体激活的信号转导途径、FGF2在伤口愈合方面的作用机制及其在整形方面的应用作一综述。     

重组人成纤维细胞生长因子-21的表达及纯化工艺的优化

目的优化重组人成纤维细胞生长因子-21(SUMO-rhFGF-21)融合表达工程菌的表达条件及目的蛋白纯化工艺。方法对工程菌的诱导温度、时间及诱导剂浓度进行优化,并进行罐发酵,对菌体裂解液进行离子交换层析、Ni离子亲和层析及分子筛层析等。纯化产物经SDS-PAGE和HPLC鉴定纯度。结果在诱导温度为37℃,诱导时间为4h,IPTG浓度为0.5mmol/L时,目的蛋白的表达量最高,达20.5%;罐发酵收菌量可达66g/L,目的蛋白的表达量达20.2%;纯化后的rhFGF-21纯度达96%以上。结论优化了rhFGF-21的表达条件及纯化工艺,为rhFGF-21用于新药开发奠定了基础。     

人重组酸性成纤维细胞生长因子在大肠杆菌中的表达及鉴定

利用逆转录-DNA聚合酶链式反应，从体外传代培养的人肺成纤维细胞中钓出人酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）全编码区的cDNA，将其克隆人pKK223-质粒，在大肠杆菌JM105中高效表达出人重组aFGF。此aFGF经Heparin－Sepharose纯化后，表现了很好的生物学活性。     

成纤维细胞生长因子及其受体抑制剂的研究进展

成纤维细胞生长因子受体（FGFRs）是受体酪氨酸激酶（RTKs）超家族的一员,它可以与成纤维细胞生长因子（FGFs）结合,引发靶细胞的多种反应,同时参与许多生物过程,如细胞增殖、抗凋亡及血管生成等,发挥其生理功能。FGFRs分别在癌细胞和内皮细胞中参与肿瘤的发生和血管的生成,因此,FGFRs-靶向药物会产生直接或间接的抗癌作用。简单介绍了FGFs及FGFRs,重点对FGFR抑制剂的研究进展进行了综述。     

重组人成纤维细胞生长因子21慢病毒质粒的构建及鉴定

目的构建人成纤维细胞生长因子21(human fibroblast growth factor 21,h FGF21)重组慢病毒质粒,并进行包装和鉴定。方法 PCR扩增人FGF21 ORF序列,经Eco RⅠ和Bam HⅠ双酶切后,连接至慢病毒载体PLV-EF1a-EGFP[2A]Puro,构建重组慢病毒质粒PLV-EF1a-EGFP[2A]Puro-h FGF21,经293T细胞包装为重组慢病毒颗粒,并感染KMB17靶细胞。荧光显微镜观察293T细胞中报告基因EGFP的绿色荧光,判断重组慢病毒的感染效率;RT-PCR法检测KMB17靶细胞中h FGF21基因m RNA的转录;免疫荧光和Western blot法检测KMB17靶细胞中h FGF21蛋白的表达。结果重组慢病毒质粒PLV-EF1a-EGFP[2A]Puro-h FGF21经双酶切及测序鉴定,证明构建正确,在包装细胞中获得较高的转染效率,重组慢病毒感染KMB17靶细胞72 h后,荧光显微镜下可见EGFP绿色荧光。感染组KMB17靶细胞中存在h FGF21基因m RNA的转录和蛋白的表达。结论成功构建了重组慢病毒质粒PLV-EF1aEGFP[2A]Puro-h FGF21,并于KMB17靶细胞中表达,为FGF21功能与特性的相关研究及基因工程药物的探索和研发奠定了基础。     

重组碱性成纤维细胞生长因子的生化分析

为验证长春长生基因药业生产的重组成纤维细胞生长因子(ｂＦＧＦ)生产的稳定性及分析产品的结构,采用ＳＤＳＰＡＧＥ法和ＣＮＢｒ裂解法,对3批ｂＦＧＦ进行了相对分子质量测定及肽图分析。结果表明(1)ｂＦＧＦ经ＳＤＳＰＡＧＥ分析出现两条带,以标准蛋白的Ｒｆ值为横坐标,以标准蛋白的相对分子质量的负对数为纵坐标,做标准曲线,得知样品的相对分子质量为17500和23000,23000的蛋白分子为主要成分,见图1;(2)ＣＮＢｒ裂解后的ｂＦＧＦ经ＳＤＳＡＰＧＥ分析出现两条带,与Ｐｒｏｍｅｇａ公司生产的ｂＦＧＦ出现的两条带的位置一致,见图2。(3)3批…     

密码子优化的人成纤维细胞生长因子-21在毕赤酵母中的表达

目的在毕赤酵母中表达密码子优化的人成纤维细胞生长因子-21(hFGF-21),为探讨hFGF-21在糖尿病治疗方面的作用奠定基础。方法经密码子优化合成hFGF-21基因,构建表达载体pPICZαA-hFGF-21,电转化毕赤酵母GS115,斑点免疫印迹法筛选工程菌株,甲醇诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物,并对诱导条件进行优化。结果重组表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定,证明构建正确。筛选出5株阳性菌株,诱导上清经SDS-PAGE分析,可见相对分子质量约为25000的目的蛋白条带,目的蛋白的表达量约为6μg/L。Westernblot显示该蛋白具有良好的反应原性。诱导96h和培养液pH值为4.0时,目的蛋白的表达量最高,甲醇浓度对表达量无影响。结论已成功构建了密码子优化的hFGF-21真核表达载体,并在毕赤酵母GS115中分泌表达了hFGF-21。     

肝癌细胞上清液对成纤维细胞表达α-平滑肌肌动蛋白、环氧合酶-2和肝细胞生长因子的影响

目的观察小鼠肝癌细胞上清液对成纤维细胞增殖及表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)的影响。方法制备小鼠成纤维细胞,并分别用普通培养液、小鼠肝癌细胞上清液的条件培养液及含转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的培养液培养成纤维细胞。采用MTT法检测3种培养液培养的成纤维细胞的增殖活力;RT-PCR和免疫组织化学法检测3种培养液培养的成纤维细胞中α-SMA、COX-2、HGF基因mRNA的转录水平及蛋白的表达情况。结果条件培养液及含TGF-β1的培养液对成纤维细胞的增殖均有促进作用,但条件培养液的促进作用更强。普通培养液培养的成纤维细胞在第5天时α-SMA基因mRNA的转录水平最高,含TGF-β1的培养液及条件培养液培养的成纤维细胞在第3天时α-SMA基因mRNA的转录水平最高,且明显高于普通培养液在第5天时的转录水平,第3天以后转录水平稳定;普通培养液培养的成纤维细胞中无COX-2和HGF转录;条件培养液及含TGF-β1的培养液培养的成纤维细胞在第5天时COX-2和HGF基因mRNA的转录水平最高,第5天后无明显下降。不同培养液培养的成纤维细胞中α-SMA蛋白在胞浆、胞膜均有不同程度的表达;普通培养液培养的成纤维细胞中COX-2和HGF蛋白不表达,而含TGF-β1的培养液及条件培养液培养的成纤维细胞中COX-2和HGF蛋白为阳性表达,表达部位均为胞浆。结论小鼠肝癌细胞上清液能有效、稳定地将成纤维细胞激活为稳定表达COX-2和HGF的肌成纤维细胞,其有望成为在细胞移植中促进移植细胞存活及血管重建的细胞。     

成纤维细胞生长因子受体基因野生型和E731K突变型真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor 2,FGFR2)基因野生型和E731K突变型的真核表达载体,并进行鉴定。方法利用基因定点突变试剂盒,定点突变FGFR2基因,获得其E731K突变的突变型基因,通过设计含有XbaⅠ、XhoⅠ限制性内切酶识别序列的引物分别扩增FGFR2基因野生型和E731K突变型的cDNA,克隆至质粒pcDNA3.1-EGFP上,构建重组表达质粒pcDNA3.1-FGFR2-EGFP和pcDNA3.1-FGFR2E731K-EGFP,利用X-tremeGENE HP DNA将质粒转染至HEK293细胞,采用实时荧光定量PCR法及Western blot法检测FGFR2表达水平。结果经定点突变已获得野生型的突变型FGFR2基因,碱基序列与设计序列完全一致,cDNA第2191位碱基G突变为A。重组表达质粒pcDNA3.1-FGFR2-EGFP和pcDNA3.1-FGFR2E731K-EGFP经双酶切及测序鉴定证明构建正确。质粒转染HEK293细胞后,荧光显微镜下均可见绿色荧光蛋白表达;质粒pcDNA3.1-FGFR2-EGFP和pcDNA3.1-FGFR2E731K-EGFP转染组中FGFR2 mNRA和蛋白表达水平均明显高于质粒pcDNA3.1-EGFP转染组和空白对照组(P0.05)。结论成功构建了FGFR2基因野生型和E731K突变型的真核表达质粒,并在HEK293细胞中成功表达,为进一步研究FGFR2基因奠定了基础。     

生物制品在眼用制剂中的作用机制及临床应用

生物制品是指应用生物技术,以细胞、微生物、动物或人的组织或体液为原料制成的用于预防、诊断、治疗的药品,其在市场上以及临床治疗上所占比例均在不断上升。本文对眼科疾病中常用生物制品在眼用制剂中的应用[如重组牛碱性成纤维细胞生长因子(recombinant bovine basic fibroblast growth factor,rbFGF)、小牛血去蛋白提取物等在角膜损伤或角膜炎中的作用],以及不同生物制品之间联合应用的相关性(如羟糖苷与生长因子类药物联用效果等)作一综述。通过现有药物应用的启发,为生物制品在该领域的发展提供新的方向。     

重组DT/bFGF融合蛋白基因表达载体的构建及表达产物的纯化

目的构建重组DT/bFGF融合蛋白表达载体,制备高纯度的DLF融合毒素。方法PCR扩增DT389和bFGF的编码DNA序列,经酶切和连接,克隆至表达载体pET-30a,转化E.coliBL21(DE3),鉴定阳性克隆菌落,经IPTG诱导表达融合蛋白DLF,镍离子螯合层析纯化,用Westernblot分析其抗原性。结果测序表明,插入片段可编码含545个氨基酸残基的融合蛋白DLF。SDS-PAGE分析表明,该融合蛋白可在大肠杆菌中表达,其表达量约占菌体总蛋白的20%,表达形式主要为包涵体。纯化后纯度达90%以上。Westernblot证实,该融合蛋白同时具有DT和bFGF两种抗原性。结论已成功构建DT/bF-GF表达载体,并获得较纯的DLF融合毒素。     

重组人酸性成纤维细胞生长因子温敏凝胶及Rg3水凝胶促进SD大鼠烫伤创面愈合的作用机制

目的探讨重组人酸性成纤维细胞生长因子(recombinant human acid fibroblast growth factor,rhaFGF)温敏凝胶及Rg3水凝胶对大鼠烫伤创面促愈合的作用机制。方法用SD大鼠建立烫伤模型,分别给予20μg/mL rhaFGF-泊洛沙姆温敏凝胶及235μg/cm² Rg3-卡波姆水凝胶治疗24 d,并以相应的凝胶基质为对照,分别于首次给药后1、7、19、24 d进行动物大体观察并计算创面愈合率;利用HE、Masson染色观察皮肤组织的重构;利用免疫组化(immunohistochemical,IHC)试验检测炎症相关因子IL-6、IL-10、IL-1β及细胞外基质蛋白CollagenⅢ和α-SMA的表达。结果在愈合面积及愈合率方面,rhaFGF及Rg3凝胶治疗组均优于对照组(P <0.05);在组织病理学上,两个治疗组在组织致密度及空化现象上优于对照组;在CollagenⅢ表达上,两个治疗组均高于对照组(P <0.01),但在α-SMA的表达上,rhaFGF凝胶治疗组高于对照组(P <0.05),而Rg3凝...