辛德毕斯病毒囊膜蛋白的免疫标记

辛德毕斯病毒(Sindbis Virus,简称SbV)是最小的有囊膜的RNA病毒之一(图1),其囊幕含有二种病毒特异的囊膜蛋白(图1箭头)。病毒囊膜蛋白是在宿主细胞粗面内质网上合成的,经高尔基体加工后转运到细胞质膜上。研究SbV囊膜蛋白在细胞膜上的分布有助于进一步了解病毒的成熟与释放过程及其机制。我们曾参照P.Pinto da Silva的方法用抗病毒囊膜蛋白的抗体对SbV感染的细胞进行胶体金免疫标记,然后制备冰冻断裂复型样品,获得了宿主细胞质膜EF面复型与ES面的标记金颗粒的叠加图象(图2),进而我们探索了标记一复型技术和获得PF面复型与PS面标记金颗粒的叠加图象的方法,前者更有效地显示SbV囊膜蛋白在细胞质膜上的分布(图3),后者则可以把细胞内的免疫标记与冰冻蚀刻技术相结合,以对膜内微粒中的SbV囊膜蛋白进行定性定位的研究(图4),从而在一定程度上弥补了P.Pintoda Silva方法的不足。     

辛德毕斯病毒（Sindbis Virus）成熟过程的电镜研究

辛德毕斯病毒(Sindbis Virus,以下简称 SbV)属于披盖病毒科,是最小结构最简单的有囊膜的病毒之一,其结构蛋白仅有三种即衣壳蛋白、囊膜蛋白E_1和E_2。病毒的核衣壳在宿主细胞的细胞质中装配,然后转移到细胞质膜下,以出芽的方式披上一层囊膜,发育成为成熟的病毒粒子,出芽成熟过程的动力来自于核衣壳上的衣壳蛋白与细胞质膜上的病毒囊膜蛋白的相互作用。SbV的这种成熟模式十几年前就已提出并得到后来的一些电镜观察结果的支持。近几年来分子生物学的研究结果进一步表明:病毒成熟过程是囊膜蛋白E_2(一种跨膜蛋白)在细胞质中的部分(C末端)与衣壳蛋白相互作用的结果。     

冰冻蚀刻胶体金标记技术

冰冻蚀刻技术主要的优越性之一是可以显示出镶嵌在细胞膜内的蛋白质颗粒,而对这些种类,数量繁多的膜内微粒的定性与定量研究,则是近几年刚刚建立的一个重要的电镜新技术。本实验用直径5nm的胶体金一羊抗兔抗体和直径20nm的胶体金一蛋白A的复合物,以及抗辛德毕斯病毒(sbv)表面糖蛋白E和抗sbv的抗体及抗水泡性口炎病毒(vsv),表面糖蛋白的抗体,分别标记了sbv或vsv感染的BHK—21单层细胞,经固定和甘油处理后,再把长有细胞单层的盖玻片小心裁成大小1～2mm的小块,在Balzars冰冻蚀刻仪中断裂、喷镀复型膜。仅用蒸馏水将复型膜连同细胞碎片漂起,即可捞在400目的载网上。     

扫描电镜显示细胞表面的分子标记

为了研究细胞表面特异蛋白质的分布,铁蛋白、乳胶颗粒、胶体金甚至病毒颗粒一度都曾作为扫描样品的标记物。但目前最有潜力并表现出巨大优越性的无疑是新近发展起来的胶体金标记技术。我们用直径20nm的蛋白A—胶体金和抗水泡性口炎病毒(vsv)表面膜蛋白(G蛋白)的抗体及抗辛德毕斯病毒(sbv)表面膜蛋白(E_1和E_2蛋白)的抗体,按常规免疫标记并经过我们实验室改进的方法,分别标记了VSV和sbv感染的BHK-21细胞或鸡胚成纤维细胞,经固定和临界点干燥后,镀以厚度约为50A的1金膜,在Hitachi S-570扫描电镜下观察。     

应用电镜技术对牛流行热病毒形态学的研究

牛流行热病毒(BEFV)属于单股负链病毒目(Mononegavirales)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、狂犬病病毒属(Lyssavirus)成员。该病毒能引起牛流行热(又称牛暂时热或三日热),对养牛业造成很大的经济损失。本研究使用的材料是培养在BHK_(-21)细胞上的牛流行热病毒。应用负染色、超薄切片等方法制备样品,JEM-1200EX型电镜观察。通过电镜观察和研究,得出以下结果:1.病毒的基本形态,呈锥形(图1,2)、弹形(图3,4,5)、窝窝头形(图5)。大小为180X85nm。典型结构,外有囊膜,该囊膜是由纤突和病毒膜构成,内有螺旋对称的核衣壳(图4,5)。     

水生动物病毒的电镜和荧光显微镜观察

应用透射电镜和荧光显微镜对三种水生动物病毒粒子形态、病毒感染细胞的超微结构变化及亚细胞定位进行比较和研究。负染电镜观察显示:鳜鱼弹状病毒(SCRV)粒子呈典型的子弹状形态,长约76～118 nm,直径约29～52 nm;鲈鱼呼肠孤病毒(LJRV)粒子呈正二十面体结构,具有双层衣壳,直径约70～80 nm;蛙虹彩病毒(RGV)粒子呈正二十面体结构,具有囊膜,直径大小约150 nm。超薄切片观察表明,宿主细胞的基本结构遭到不同程度的破坏,成熟病毒粒子分布在胞质中或以出芽的方式释放到胞外,且RGV增殖后在胞质中聚集形成晶格状结构。免疫荧光观察进一步显示,RGV感染细胞后能产生多个直径大小不一的包涵体。本研究结果有助于了解和认识水生动物病毒的超微形态特征、复制过程及致病机理。     

应用冷冻蚀刻技术研究几种病毒的超微结构

采用冷冻蚀刻技术研究了GPV、IBRV和NDV等几种病毒的超微结构,初步取得如下结果: 一、在冷冻蚀刻样品中,GPV呈球形(在细胞质内)或近似球形(释放到细胞外),直径约300nm,这与在超薄切片或负染色样品中所见的病毒形态和大小有很大的不同。二、IBRV囊膜的PF和EF面上,均可见到直径5—9nm的膜内微粒。GPV囊膜膜内微粒的数量及其在PF面和EF面上的分布与IBRV不同。细胞质内与细胞外成熟的GPV囊膜的膜内微粒也有明显的差异。三、在GPV毒浆基质中,可观察到由直径5—10nm颗粒的聚集或规则排列形成的弓形、环形、及直径150—400nm大小不等的球形结构。实验结果显示了冷冻蚀刻技术在病毒形态结构和形态发生,尤其在病毒囊膜结构研究中的优越性。对这一技术在病毒学中的应用进行了讨论。     

苜蓿夜蛾核型多角体病毒超微结构的电镜观察

昆虫核型多角体病毒形态发生的研究,国内外均有许多报导,但关于苜蓿夜蛾核型多角体病毒(简称HdNPV)形态发生的研究还未见报导。本文主要介绍了应用电镜超微技术研究苜蓿夜蛾核型多角体病毒在感染脂肪体细胞中的形态发生及装配过程。图A.示HdNPV多角体外形。图B.经碱解后多角体内的病毒粒子。图C.细胞核内的病毒发生基质     

猪瘟病毒的形态结构及侵染机理的研究

猪瘟病毒 (ｃｌａｓｓｉｃａｌｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓ ,ＣＳＦＶ) ,属黄病毒科 ,瘟病毒属成员 ,是严重危害养猪生产的主要病原体之一。ＣＳＦＶ是具有囊膜的正链ＲＮＡ病毒。除基因组ＲＮＡ外 ,还有衣壳蛋白Ｃ和三种囊膜蛋白Ｅ0 ,Ｅ1和Ｅ2组成。一般认为病毒侵染细胞是通过囊膜蛋白与细胞表面受体相互作用形成Ｉｎｆｅｃｏｓｏｍｅ后进入宿主细胞。然而对ＣＳＦＶ感染细胞的细节当不甚明了。本项研究在观察ＣＳＦＶ形态结构与发生过程的基础上对其侵染细胞的机理进行了初步研究。材料与方法本实验所用的ＣＳＦＶ Ｔ株 ,石门株 (Ｆ1…     

山羊痘病毒囊膜的超微结构与形态发生

痘病毒可以作为研究生物膜形态发生的很好材料。我们应用冷冻蚀刻技术并附以超薄切片、负染色,细胞表面复型和扫描电镜等技术,对一种复制周期很长的痘病毒——山羊痘病毒囊膜的精细结构和发生过程进行了比较研究。病毒发育早期,毒浆周围出现的弧形膜样结构在冷冻蚀刻样品中呈现出间距为15—20nm均匀排列的二层颗粒;未成熟病毒囊膜为圆形,直径约400nm,因其常常从病毒中部断裂,因而可清楚地显示出病毒周缘仍由二层颗粒围绕;细胞质内成熟病毒囊膜为直径320—340nm的规则球体,其的PF面和EF面上均可见到大量直径为7—10nm的膜内微粒。释放到细胞外的成熟病毒囊膜的PF或EF面仅有少量的膜内微粒,囊膜形态呈不规则的球体     

GPV和IBRV的超微结构与形态发生的冰冻蚀刻研究

用冰冻断裂技术并结合其它电镜技术,研究了GPV和IBRV囊膜和核壳体的形态和发生。GPV发育早期,病毒从中部断裂,围绕病毒的膜样结构是均匀排列的两层颗粒,而成熟病毒在囊膜中间断裂,说明发育早期的囊膜脂质很少,主要成分是蛋白质颗粒,随后脂质才进入囊膜。而细胞质内成熟GPV囊膜的PF和EF都仍有大量膜内蛋白颗粒,GPV释放到细胞外后囊膜膜内蛋白颗粒大为减少。成熟的IBRV囊膜PF上膜内蛋白比EF上多。在囊膜周缘有时可见剌突样结构。在与疾毒接触的细胞质膜的区域有规则排列的颗粒,似与病毒释放有关。在感染细胞核内同时装配着IBRV的核心、空衣壳和核壳体。细胞核内核壳体固断裂部位不同可分为5种类型,深度蚀刻后对其形态进行了观察。文中还对不同方法制备的样品的形态进行了比较。     

应用电镜放射自显影技术研究病毒DNA的复制及宿主细胞内RNA的转录

应用电镜放射自显影技术研究了鸭瘟病毒(DPV)DNA复制及宿主细胞内RNA的转录功能,并扼要报导了我们的主要实验结果: 1.DPV的DNA合成是在核内电子密度较低的均匀基质中进行的,随后,转移到电子致密的毒浆结构中装配病毒核壳体。从病毒DNA复制到发育成熟的病毒仅需3小时。 2.DPV的DNA复制的持续时间较长。病毒DNA的复制与核壳体的装配及病毒的成熟与释放可同时进行。 3.DPV在细胞核内装配,也可在细胞质内装配。 4.宿主细胞的核仁依然存在,并保持其转录RNA的功能。     

猪瘟病毒与辛德毕斯病毒成熟和释放特征的比较研究

电镜下观察了二种有囊膜的正链ＲＮＡ病毒－－猪瘟病毒（ＣＳＦＶ）与辛德毕斯病毒（ＳｂＶ）感染的宿主细胞。在ＳｂＶ ６Ｋ蛋白突变株感染的ＢＨＫ２１细胞中,可清楚地显示病毒从细胞质膜出芽与释放的过程,并在细胞擀中积累了大量的核衣壳。在ＣＳＦＶ感染的ＭＰＫ细胞中首次观察到较多的病毒核衣壳与成熟的病毒粒子,因而有可能对其成熟与释放方式的不同进行比较研究。此外,对病毒诱导的细胞超微病变特征进行了报道     

三种动物慢病毒形态及形态发生的比较研究

用电镜检查确定了不同感染时间的马传染性贫血病毒 (EIAV)、维斯纳 梅迪病毒 (MVV)和山羊关节炎脑炎病毒 (CAEV)的形态和形态发生。成熟的病毒粒子为电子致密的球形 ,有囊膜 ,直径约 10 0nm ,含有 1个 (有时有 2个或 2个以上 )的核芯。维斯纳 梅迪病毒和山羊关节炎脑炎病毒的核芯为球形 ,马传染性贫血病毒为杆形或锥形。在大部分病毒里能清晰地看到核芯壳 ,成熟的病毒从感染细胞的胞浆膜上出芽 ,在胞浆中还见到了花环状粒子和多板层结构     

二型单纯疱疹病毒感染细胞的扫描及透射电镜对比观察

本实验以感染复数大约为3的HSV—3(333株)感染兔婴肾细胞,以不同的时间间隔将细胞固定制作标本供扫描(SEM)及透射电镜(TEM)检查。感染后1小时,SEM显示在整个细胞的表面或细胞的部分表面有大量的病毒颗粒吸附,多数为大的,其直径约为200nm(有囊膜)的病毒,少数为小的,其直径为100nm(无囊膜)的病毒。颗粒均匀分布或积集成簇。这种分布状态在感染后2小时及4小时的标本上均可见到。但是在感染4小时已经变圆的细胞的核上区仅有少量散在的颗粒,而在其核周区则见大量颗粒。在感染16小时的细胞表面膜出现大小及形状均不规则的孔洞,说明细胞遭到破坏,许多细胞及其胞核甚至解体成为碎片。有少量的病毒颗粒出现在孔洞的边缘或碎片之间或附着在破碎的细胞膜上。TEM亦见到两种病毒颗粒,有膜的(多数)及无膜的(少     

杆状病毒重组病毒对IPLB SF21—AE细胞株之细胞病毒研究

利用含有B型肝炎表面抗原S段基因之重组病毒感染IPLBSF 21—AE细胞株研究其细胞病变并与野生型病毒ACNPV(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)之细胞病变作为比较。重组病毒对细胞较具毒性,于感染细胞中,野生型与重组病毒所产生之子病毒大小与纤维状物质并无差异。但于重组病毒感染的细胞中较易观察到具有二至三倍长的核蛋白质鞘。不同病毒感染的细胞以感染后期之差异较大。野生型病毒感染的细胞核内可见许多含有包埋体病毒的多角体(polyhedra),病毒形成团(virogenic stroma),以及累积之多角体被膜(图1)相反地,重组病毒感染的细胞内并无多角体,但核内可见核蛋白质鞘及已披上被膜之核蛋白质鞘团,并可见明显的膜状构造包围核四周(图2),以及嵌于膜上直径约22nm的电子致密颗粒(图3),此结果证明了重组病毒合成之S蛋白并非以游离方式存在,而是嵌在膜构造内。     

牛膀胱上皮细胞形态结构及AUM蛋白的定位

本文以牛膀胱变移上皮为材料,利用石蜡切片、免疫荧光及多种电镜技术,对其形态结构进行了较为系统的研究,并对上皮细胞膜蛋白 Uroplakin I 的定位做了初步的探讨。在显微与亚显微水平上,牛膀胱变移上皮细胞大致可分为三类,即富含膜泡的表层细胞,富含线粒体的中间层细胞和其下的基底层细胞。在超薄切片样品中其腔面细胞质膜由扇形凹陷区与冠状突起区相间排列而成,细胞质膜的暗一亮一暗单位膜结构可以清晰地分辨出来,靠腔面厚约80A,靠细胞质面厚约40A,表现出明显的不对称性(图1),因而称之为不对称单位膜。冰冻断裂复型样品中在细胞质膜纵断面上,表层细胞腔面膜的形状与超薄切片中类似,亦由扇形凹陷区与冠状突起区相间排列而成。扇形凹陷区即为斑区,分布着许多的颗粒状结构,颗粒大小约11—13nm(图1左     

茶尺蠖核多角体病毒的精细结构与发生

茶尺蠖(Ectropis obligua hypulina)又称拱拱虫、吊丝虫等,属鳞翅目尺蛾科,是茶树的主要害虫之一,在我国浙江,安徽,江苏等省危害较大,特别使春秋茶叶生产受到极大损失。茶尺蠖核多角体病毒为我国首次发现(赵烨烽等人,1977年),而国外尚未见报导。同期并确认该杆状病毒可使茶尺蠖幼虫发病致死,1981年朱国凯,候建文等人对茶尺蠖核多角体病毒的宿主细胞病理等作了初步研究。近几年来,我们在开展利用该病毒对其害虫防治工作的基础上,同时又对该病毒的特性作了研究。本文应用电镜技术,报告茶尺蠖核多角体病毒的形态和精细结构,及其在宿主细胞内的形态发生。     

从庚型肝炎病人肝穿组织中发现具有布尼安病毒科（Bunyaviridae）病毒形态特征的病毒颗粒

应用常规超薄切片技术,对单纯HGV感染患者的肝穿组织进行电镜观察。发现肝细胞胞浆内高尔基囊泡增生、扩张,在扩张的囊泡中见到呈芽生性生长和成熟的病毒颗粒。成熟病毒具有双层脂质包膜及表面穗状微突,核心为微细点丝状,直径约70－120nm,根据其形态学及形态发生特征,可以主伙HGV有可能属布尼安病毒科（Bunyaviridae)成员。     

病毒感染单层细胞的免疫标记与断裂技术

用抗Sindbis病毒(SbV)囊膜蛋白E_1和E_2的抗体及抗Vesicular Stomatitis病毒(VSV)囊膜蛋白(G蛋白)的抗体分别对病毒感染的BHK-21细胞进行胶体金免疫标记,然后按冰冻蚀刻的制样程序制备铂-碳复型膜以研究病毒囊膜蛋白在细胞质膜上的定位与分布。本文扼要地介绍了这一技术的操作过程,同时,结合我们自己的工作对该技术的要点及其应用进行了讨论。