创伤弧菌的优化培养及快速检测

研究了创伤弧菌优化培养的方案,用以提高该菌的检出率。利用Design-Expert软件中的Box-Behnken中心组合实验原理,设计一组3因素3水平实验,通过响应曲面分析,得到优化培养参数为:含盐量3.65%,pH6.75,培养温度37.00℃,在该条件下培养液的OD595nm为0.520。利用创伤弧菌优化培养条件对市售海产样品进行了培养,并通过聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）对样品进行快速检测,且该菌的检出率高达23.3%。结果表明:应用本实验的优化培养方案、PCR法能快速有效检测水产品中存在的创伤弧菌。      

水产品中创伤弧菌的快速检测与分离

目的:对水产品中创伤弧菌的快速检测与分离技术进行研究。方法:蛤蜊肉经高速匀浆处理后,在含有多粘菌数B的碱性蛋白胨水中增菌培养(35～37℃,12～16h),然后用PCR技术检测样品。PCR检测的目的基因是创伤弧菌的溶细胞毒素(hemolysin/cytolysin)基因,扩增产物为222bp。对PCR结果呈阳性的样品做原位杂交实验,用碱磷酶标记的寡核苷酸探针VVAP来分离创伤弧菌。通过对购买于青岛丹东路小市场的蛤蜊进行检验,分离出了2株创伤弧菌。结果表明:应用PCR、原位杂交技术能快速检测和分离水产品中存在的创伤弧菌。     

响应面法优化溶藻弧菌的培养条件

通过单因素实验确定pH、温度、盐度三个因素下溶藻弧菌的最优培养条件。根据Box-Behnken中心组合实验原理进行响应面分析,以菌液的OD600为响应值,确定影响溶藻弧菌培养的各因素水平。结果表明,最优培养条件为pH7.62、温度34.55℃、盐度3.22%;菌体生长过程中pH和温度、温度和盐度对V.a ATCC17749生长的交互作用显著。     

褶牡蛎体内菌落结构分析及创伤弧菌的定量检测

食用被致病菌污染的牡蛎常引起食品安全问题。采用16S rDNA克隆文库法研究褶牡蛎体内的菌落结构,用荧光定量PCR技术对样品体内的副溶血弧菌、沙门氏菌、创伤弧菌和钩端螺旋体进行定性、定量检测。研究结果表明:褶牡蛎体内的优势菌属为螺旋体属和类杆菌属,分别占总菌数的39.21%和23.53%;样品中含有创伤弧菌,含量为(8.48±0.48)×103cfu/g,而副溶血弧菌、沙门氏菌和钩端螺旋体未检测到。     

基于vvhA基因检测创伤弧菌实时荧光PCR方法的建立

为建立创伤弧菌(VV)的快速检测方法,根据vvhA基因序列设计合成引物和探针,建立实时荧光PCR方法。结果显示:所建立的方法能特异扩增出VV标准阳性菌株,而对其它14种菌株没有扩增;该方法的灵敏度为15CFU/mL;稳定性和重复性试验结果表明,同一样品重复检测4次Ct值(循环阈值)的变异系数均小于2%;利用该检测方法对采集的156份样品进行检测,共计检出2份VV阳性样品,与行标法(SN/T 1870—2007)检测结果一致。该检测方法灵敏度高、特异性强,具有良好的实用性。     

基于智舌的水产品中创伤弧菌快速检测体系的构建

以创伤弧菌为研究对象,探讨智舌在致病性弧菌快速检测中的可行性。首先用基于脉冲伏安法的智舌监测创伤弧菌的生长趋势,并以常规的浊度法验证其可行性;再用智舌鉴别11种致病性弧菌的液体培养物,以确定智舌结合主成分分析法能否将致病性弧菌区分开及其所需的最短时间;最后用智舌结合SIMCA法构建创伤弧菌的模式识别单元。结果显示,可用智舌监测液体培养基中创伤弧菌的生长情况;当在特异性培养基中培养弧菌8h后,智舌能很好地区分11种致病性弧菌;7种电极与其频率段组合下的PCA模型,对所有样本的判别准确率达到100%,说明所建模型可用于创伤弧菌的快速筛检。智舌快速检测创伤弧菌的方法切实可行。     

创伤弧菌致病性及其毒力因子研究进展

研究26株创伤弧菌（Vibrio vulnificus,Vv）产生物被膜情况及影响生物被膜形成的因素,为有效控制创伤弧菌形成生物被膜提供理论依据。本研究采用刚果红平板法、改良试管法及改良微孔板法分析25株创伤弧菌分离株及1株标准菌株形成生物被膜的能力,从中选出一株产膜能力最强的菌株,并研究不同初始菌浓度、温度及时间、pH、NaCl浓度、金属阳离子以及接触材料对其生物被膜形成的影响。结果显示,所选菌株中具有生物被膜形成能力的有25株（96.15%）。其中菌株VvK产膜能力最强,在25 ℃条件下,初始菌浓度为10⁸ CFU/mL,含3% NaCl、pH8~9培养24 h时,生物被膜形成量最大。而添加一定浓度的金属阳离子（Cu²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺）后,生物被膜的形成受到不同程度的抑制,其抑制能力依次降低。菌株VvK在接触亲水性表面（不锈钢和玻璃）时生物被膜形成量显著高于疏水性表面（聚苯乙烯）,且在不锈钢表面形成量最大。不同创伤弧菌生物被膜形成能力具有较大的差异,且在不同培养条件下具有特定的规律,需引起重点关注。     

创伤弧菌产铁载体菌株的筛选及其诱导条件的响应面优化

创伤弧菌是一种重要的人鱼共患致病菌,根据目前已报道的致病因子,产铁载体是其主要的致病因子之一。以海水中筛选分离出的创伤弧菌为实验菌株,通过改良金氏培养基(Modified King B,MKB)筛选产铁载体菌株,通过平板覆盖法筛选高产铁载体菌株及紫外可见分光光度计法测定铁载体活性单位(siderphore units,SU)。基于MKB培养基,选取产铁载体能力最高的V.vulnificus Y8菌株,利用响应面法对其铁载体活性单位的显著影响因素包括初始p H、装液量及碳氮比(C/N)进行优化。响应面优化结果表明:在初始p H7.84、装液量81.53 m L及碳氮比(C/N)3.06的条件下,铁载体活性单位预测值为90.7404%,并通过三次平行验证实验证明,实际平均SU值和预测SU值接近,较优化前提高了23.73%。响应面优化了MKB诱导产铁载体条件,实现铁载体的高效诱导,为日后的进一步研究奠定基础。      

2018年广州市水产品中创伤弧菌和河弧菌检测分析

目的 了解为期一年的监测中广州市水产品创伤弧菌和河弧菌污染水平、菌株携带毒力基因和分子分型情况。方法 对广州市水产品中创伤弧菌和河弧菌进行分离鉴定,毒力基因鉴定和肠道细菌基因间重复序列聚合酶链式反应(Eric-PCR)。结果 创伤弧菌阳性率为10.4%(31/298),河弧菌为5.0%(15/298);用PCR法检测创伤弧菌毒力溶血素基因vvhA全部阳性,vcgC/E和16S rRNA A/B分型结果显示,共有CB型、EA型和CA型3种基因型别。河弧菌毒力相关基因vfh、toxR全部阳性,hupO携带率为60.0%(9/15)、vfp携带率为80.0%(12/15);Eric-PCR扩增出8～14条100～2 000 bp之间的条带,将15株河弧菌在相似系数为0.8处分为5个群11个类型。结论 广州市水产品中创伤弧菌和河弧菌污染情况较严重,大部分菌株携带毒力基因,Eric-PCR结果显示15株河弧菌在亲缘关系上具有相关性,应加强防控。     

创伤弧菌控制措施与风险评估的研究进展

创伤弧菌为革兰氏阴性嗜盐菌,天然存在于世界各地温暖的河口与海洋环境中,是一种重要的食源性致病菌,人类感染往往与食用受污染的海产品有关。食源性创伤弧菌感染最常见的临床症状是原发性败血症,病死率超过50%。文中介绍了创伤弧菌生物学特性、控制措施及风险评估的研究进展。     

抗菌肽对创伤弧菌细胞膜破坏的抑制作用

目的 对抗菌肽(I1WL5W)对弧菌细胞膜的抑制作用进行研究。方法 通过最低抑菌浓度(MIC)测定、圆二光谱(CD)试验、细胞膜去极化试验、SYTOX绿色摄取试验、细菌膜破裂的流式细胞术试验,检测抗菌肽对创伤弧菌的抗菌活性、对细胞膜的破坏能力及作用机制。结果 抗菌肽对创伤有广谱的抗菌活性,对弧菌细胞膜有较强的铍坏能力。结论 抗菌肽影响通过破坏创伤弧菌膜完整性的方式,诱导细菌细胞死亡。     

传统培养法与荧光PCR法检测弧菌的方法评价

目的 比较标准检测方法与杜邦BAX System Q7快速检测方法检测副溶血性弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌.方法 采用GB 4789.7—2013《食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》、SN/T 1022—2010《进出口食品中弧菌霍乱弧菌检验方法》、DBS 13/004—2016《食品安全地方标准创伤弧菌检验》标准和杜邦B...     

响应曲面法优化猕猴桃酒酵母培养条件

利用JMP和Box-Behnken响应曲面设计（RSM）,研究了培养条件对猕猴桃酒酵母WF25增殖作用的影响。研究结果表明:温度、装液量、转速、初始pH和培养时间对猕猴桃酒酵母WF25细胞的增殖均有极显著的影响。当培养条件为温度28.5℃、初始pH4.5、转速175r/min、装液量65mL和时间30h时,生物量的预测值可达3.06352×108个/mL。      

东南沿海地区零售海产品中创伤弧菌的监测

目的了解我国东南沿海地区零售海产品中创伤弧菌的污染状况。方法采用3%氯化钠碱性蛋白胨水增菌,改良纤维二糖-多粘菌素B-多粘菌素E(mCPC)琼脂和纤维二糖-多粘菌素E(CC)琼脂分离海产品试样中的创伤弧菌,可疑菌落的鉴定采用生化试验或PCR法。采用最可能数(MPN)法和PCR法检测牡蛎试样的创伤弧菌污染水平。结果天然污染海产品试样创伤弧菌的检出率为19.8%(20/101)。牡蛎试样中45%(55/122)创伤弧菌密度低于3MPN/g的最低检出限。牡蛎中创伤弧菌的污染水平存在季节性差异。结论未来应加强对我国海产品中创伤弧菌污染状况的监测,尤其是在温暖的季节。     

溶藻弧菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

为建立溶藻弧菌（VA）的快速检测方法,本研究以VA Collagenase基因为靶基因设计合成引物及Taq Man探针,建立了实时荧光定量PCR快速检测VA的方法。结果显示,对15株实验菌株进行荧光定量PCR检测,只有VA菌株检测为阳性,表明该检测方法特异性强;该方法的灵敏度为18 cfu/m L;稳定性和重复性实验结果表明,同一样品重复检测4次Ct值的变异系数均小于2%;利用该检测方法对采集的165份样品进行检测,共计检出2份VA阳性样品,与SN/T2564-2010行标法检测结果一致,显示了良好的实用性。该检测方法灵敏度高、特异性强,具有良好的实用性。      

创伤弧菌外膜蛋白VuuA的表达纯化及复性

对创伤弧菌重组外膜蛋白VuuA进行表达纯化及复性,以获得可溶性VuuA蛋白。构建重组工程菌Escherichia coli BL21(DE3)-pET-28a-vuuA,利用IPTG诱导表达重组蛋白VuuA,利用亲和层析分离纯化蛋白并对包涵体进行复性。VuuA蛋白主要以包涵体形式存在于重组工程菌细胞内,经复性后和亲和层析纯化后,蛋白浓度达到28.2mg/L发酵液,有效提高可溶性蛋白的浓度。VuuA蛋白的纯化及复性为创伤弧菌新型疫苗的制备奠定了基础。     

响应曲面法优化猕猴桃酒酵母培养条件

利用JMP和Box-Behnken响应曲面设计(RSM),研究了培养条件对猕猴桃酒酵母WF25增殖作用的影响。研究结果表明:温度、装液量、转速、初始pH和培养时间对猕猴桃酒酵母WF25细胞的增殖均有极显著的影响。当培养条件为温度28.5℃、初始pH4.5、转速175r/min、装液量65mL和时间30h时,生物量的预测值可达3.06352×108个/mL。     

水产品中创伤弧菌检测方法建立与应用

目的建立一种水产品中创伤弧菌检测方法 ,并对北京市市售水产品中创伤弧菌污染情况进行监测。方法分别使用18株创伤弧菌菌株和水产品中常污染的背景杂菌,定量接种于检测创伤弧菌的选择性增菌液和4种选择性平板,优化出适合创伤弧菌检测的选择性培养基。采用聚合酶链式反应(PCR)法和增菌培养法分别检测样品中的创伤弧菌后进行方法对比,建立PCR和增菌培养法相结合的检测方法 ,并应用此方法研究北京市市售水产品中创伤弧菌污染状况。结果改良后的选择性增菌液适用于创伤弧菌的检测。北京市市售水产品中创伤弧菌检出率为15.7%(18/115),其中贝类、蟹类、鱼类和虾类样品的检出率分别为23.4%(15/64)、8.3%(1/12)、5.3%(1/19)和5.0%(1/20)。结论 PCR法与传统增菌培养法相结合,可有效提高创伤弧菌检测效率。北京市市售贝类等水产品中创伤弧菌污染率较高,需引起食品安全风险监测重点关注。     

环介导等温扩增技术检测创伤弧菌方法的建立与应用

根据创伤弧菌vvhA基因设计4条特异性引物,采用环介导等温扩增方法(LAMP)建立创伤弧菌快速检测方法。结果表明,建立的LAMP方法具有高度特异性,经对13株细菌进行扩增,创伤弧菌为LAMP阳性,其他菌株均为LAMP阴性。该方法对培养的创伤弧菌的检测下限为51CFU/mL,可在60min内完成扩增反应。用建立的LAMP方法对120份海产品进行检测,共检出37份LAMP阳性样本,与传统培养方法结果一致。该方法与传统方法相比,可节省大量时间,且对实验仪器和操作人员的要求低,具有良好的实用性。     

创伤弧菌致病性及致病机制研究进展

创伤弧菌广泛存在于海水和牡蛎等海产品中,具有很强的细胞毒性和溶血性,被美国疾病预防控制中心(CDC)列为三大致病性弧菌之一。本文就创伤弧菌在食品中的污染状况,人类感染途径及临床表现,致病性、致病机制和检测方法等进行综述,以期为该菌感染的预防和治疗提供理论依据。