高效表达木糖醇脱氢酶基因酿酒酵母的构建及木酮糖发酵的初步研究

通过RT-PCR方法克隆得到Candida tropicalis木糖醇脱氢酶基因xyl2,将该基因连入酵母表达载体pYES2的诱导型启动子GAL1下,构建表达质粒pYES2-xyl2;同时用从Pichia pastoris中克隆获取的甘油醛磷酸脱氢酶基因GAP换下GAL1基因,构建含组成型启动子GAP基因的表达质粒pYES2-GAP-xyl2;通过电转化法将其依次转入酿酒酵母S.cerevisiae INVSc1,山梨醇培养基上筛选的转化子经木糖醇梯度驯化培养,筛选出1株耐木糖醇浓度为20%的酿酒酵母重组菌株ZCX4和1株在半乳糖诱导下耐木糖醇浓度为15%的重组菌株YDX2。酶活测定表明,重组菌株ZCX4比酶活0.621 U/mg(蛋白),是YDX2比酶活的2.29倍。摇瓶发酵结果显示,重组菌株ZCX4木糖醇消耗76.46 g/L,木糖醇消耗率为76.46%,是重组菌株YDX2木糖醇消耗率的1.63倍,说明木糖醇脱氢酶实现了高效表达。     

酿酒酵母乙醇脱氢酶Ⅱ基因反义干扰及对乙醇发酵的影响

通过构建酿酒酵母沉默表达载体PURH-ADH2,使ADH2基因在PGK强启动子、CYC1终止子在特定区域内进行干扰和表达。采用Bam HI和Xmal I限制性内切酶对SADH2基因和PURH质粒进行双酶切,构建反义重组表达质粒PURH-SADH2,通过高效酵母转化法和电转法将重组质粒组件转化至酿酒酵母SY01细胞中,获得阳性克隆菌株JY01。酿酒酵母JY01突变菌株与出发菌株SY01和Y01发酵试验结果相比,JY01甘油脱氢酶酶活比出发菌株Y01与SY01分别下降了16.31%和13.5%;当酿酒酵母Y01、SY01和JY01菌株发酵36~60 h时,JY01菌株甘油含量相比Y01分别下降了16.34%、14.25%、14.89%;当酿酒酵母突变菌株发酵48 h时,Y01、SY01和JY01的乙醇浓度分别为6.243 g/100 m L、7.145 g/100 m L和7.288 g/100 m L,酿酒酵母JY01发酵液乙醇量比比原始菌株Y01乙醇含量提高了14.33%。结果表明通过反义干扰ADH2基因5’UTR序列,能有效干扰酵母工程菌株ADH2转录与表达,削弱甘油积累途径,促进乙醇代谢途径。     

BAT基因改造对酿酒酵母高级醇生成量的影响

酿酒酵母BAT基因编码支链氨基酸转氨酶,其中BAT1和BAT2基因分别编码线粒体和细胞质氨基酸转氨酶,位于细胞不同的位置导致二者的生理功能有所差异,BAT1基因在线粒体中倾向催化α-酮酸合成氨基酸,细胞质中的BAT2基因将氨基酸转化为α-酮酸,通过敲除BAT2以减少α-酮酸合成,过表达BAT1以增加α-酮酸消耗达到降低酿酒酵母高级醇的合成的目的。本研究以酿酒酵母AY15单倍体α5为出发菌株,结合融合PCR技术构建重组质粒p UC-BABPB1K,获得BA-PGK-BAT1-BB重组盒,并利用醋酸锂转化法和同源重组技术筛选出缺失BAT2基因同时过表达BAT1基因的突变株B-8,将其和亲本菌株α5、BAT2基因缺失菌株α5ΔBAT2进行酒精发酵实验,发酵结束后进行发酵性能和高级醇的测定。实验结果表明,与亲本菌株相比,异丁醇降低了25%,异戊醇降低了15%,活性戊醇降低了30%;与α5ΔBAT2菌株相比,异丁醇提高了0.5倍,异戊醇增加了0.1倍,活性戊醇增加了0.3倍。     

甜蛋白monellin基因在酿酒酵母中的分泌表达

人工合成的单链甜蛋白monellin基因与经改造后的基因分别克隆到带有酵母半乳糖可诱导启动子GAL1的穿梭表达质粒pYES2.0中,得到表达载体pYESM及pYESMT。在表达载体pYESMT中,monellin基因的上游连接酿酒酵母的α-信号肽序列,得到分泌表达载体pYESMTA。分别将3个重组质粒转化酿酒酵母菌株INVsc1中进行表达。具有突变monellin基因的菌株INVMT/pYESMT的monellin蛋白表达量明显高于含monellin基因的菌株。而含有pYESMTA的菌株可将monellin基因分泌到胞外,表明α-信号肽序列能很好地将酿酒酵母中的重组monellin蛋白引导到胞外,完成分泌表达,且表达产物具有生物活性。     

高产β-葡萄糖苷酶工程菌株的构建及其在2,6-二甲氧基对苯醌发酵制备中的应用

构建高产β-葡萄糖苷酶的工程菌株并将其应用到2,6-二甲氧基对苯醌的发酵制备中。通过聚合酶链式反应从酿酒酵母CS1401的总DNA中扩增得到β-葡萄糖苷酶基因,并与载体p PICZαA连接后导入毕赤酵母X33中进行甲醇诱导表达;对表达成功的重组菌株进行β-葡萄糖苷酶活力测定;同时将酿酒酵母CS1401和重组菌株接种到小麦胚芽培养基中进行发酵并测定2,6-二甲氧基对苯醌的发酵产量。结果表明,酿酒酵母CS1401的β-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母X33工程菌株中得到高效表达,酶活力达到4.5 U/m L,为酿酒酵母CS1401的5倍;2,6-二甲氧基对苯醌的摇瓶发酵产量达到935.7 μg/g,比酿酒酵母CS1401提高了0.4倍。因此,高产β-葡萄糖苷酶的重组工程菌株在2,6-二甲氧基对苯醌的发酵制备中具有一定的应用前景。     

一种新型产乙酸乙酯酿酒酵母菌株的构建

为了使酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在发酵过程中保持出酒率的同时高产乙酸乙酯,强化白酒的风味特征,利用胞内同源重组原理,通过醋酸锂化学转化法分别在亲本菌株AY12-α中过表达来自猕猴桃和草莓的醇酰基转移酶基因AeAT9、VAAT,并对成功构建的重组酿酒酵母α-AeAT9和α-VAAT进行模拟白酒液态发酵,研究其与亲本菌株发酵性能的差异。结果表明,与亲本菌株相比,重组酿酒酵母α-AeAT9和α-VAAT的生长性能及CO2总质量损失、还原糖含量、酒精度等基本发酵性能无显著差异（P＞0.05）,而乙酸产量显著降低（P＜0.05）;乙酸乙酯产量分别达（792.26±10.04） mg/L、（204.19±5.83） mg/L,分别为亲本菌株的55.40倍、14.28倍;主要高级醇总含量分别为（152.77±2.14） mg/L、（190.04±2.63） mg/L,较亲本菌株分别降低37.10%和21.75%。     

树干毕赤酵母木糖醇脱氢酶基因表达载体构建及在酿酒酵母中的过表达

针对树干毕赤酵母xyl2基因设计相应引物。以p-AKRX为骨架载体,通过酶切连接的方式构建1个酿酒酵母工业菌株的表达载体p-AKRX2-2。将该表达载体线性转化酿酒酵母后,测定转化子SUN-Ⅰ木糖醇脱氢酶(XDH)及其表达情况。与原始菌株相比,重组酿酒酵母中的XDH活力是原始菌株的3.65倍。该重组质粒载体的构建可有效弥补酿酒酵母缺少代谢木糖关键基因的缺陷,为利用木糖高产乙醇酿酒酵母基因工程菌株的构建奠定基础。     

稳定高效表达木糖还原酶基因工业酿酒酵母的构建及木糖醇发酵的初步研究

将树干毕赤氏酵母(Pichia stipitis)木糖还原酶基因XYL1连接到适用于酿酒酵母工业菌株的多拷贝整合载体pYMIKP中,构建得到表达质粒pYMIKP-XYL1,转化酿酒酵母工业菌株Saccharomyces cerevisiae6508。在G418平板上筛选转化子,得到含高拷贝木糖还原酶基因的酿酒酵母重组菌株XGH2,,该菌株的木糖还原酶比活力为0.8 U/mg(蛋白),比出发菌株提高了80倍以上,表明外源基因在工业菌株中实现了高效表达。摇瓶发酵结果显示,重组菌株XGH2木糖消耗为27.9 g/L,木糖消耗率为51%;木糖醇产量为30.2 g/L,木糖醇的转化率大于1.0 g/g木糖。     

过表达EHT1基因对酿酒酵母己酸乙酯生产能力的影响

为了提高酿酒酵母己酸乙酯的产量,缩短浓香型白酒的发酵周期,降低生产粮耗。对酿酒酵母醇己酰基转移酶(ethanol hexanoyl transferase I)基因EHT1进行了过表达,研究其对酿酒酵母己酸乙酯生产性能的影响。以大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒YEp352为载体,磷酸甘油酸激酶基因PGK1启动子为上游调控元件,KanMX抗性基因为筛选标记构建了酵母菌表达质粒Yep-PEK,经醋酸锂转化和G418抗性筛选鉴定获得过表达EHT1基因的突变株AY-PEK。经玉米原料液态白酒发酵后,实验结果显示突变株的生长速度、发酵速度、酒精度等基本发酵性能没有明显变化,但己酸乙酯的产量提高为原菌种的2.21倍,辛酸乙酯和癸酸乙酯也分别提高了31.4%和49.1%。当加入等量的己酸模仿实际发酵过程中己酸菌提供己酸时,己酸乙酯的量提高为原菌种的近3倍,总酯也相应的提高了32.2%。EHT1基因的过表达对提高酿酒酵母产酯性能,特别是产己酸乙酯有显著作用。     

酿酒酵母苏氨酸合成酶缺失对高级醇生成量的影响

通过构建酿酒酵母苏氨酸合成酶基因(THR4)缺失的工程菌株,研究该基因对酿酒酵母高级醇生成量的影响。以质粒pUC-19为载体,KanMX抗性基因为筛选标记,构建了重组质粒pUC-TABK,经PCR扩增得到YAKanMX-YB重组盒,并以酿酒酵母AY15单倍体α5为出发菌株,通过醋酸锂转化和G418抗性筛选,获得THR4基因缺失的突变株α5-T7。将转化子和亲本菌株分别进行模拟酒精发酵及酒精浓醪发酵,发酵结束后进行发酵性能和高级醇生成量的测定。结果显示,与亲本菌株相比,突变株正丙醇生成量分别提高了1.61倍和2.6倍,异戊醇生成量分别提高了0.27倍和0.24倍,而异丁醇生成量没有明显差异,表明THR4基因缺失会使酿酒酵母高级醇特别是正丙醇生成量提高。     

克雷伯氏菌乙醛脱氢酶基因过表达及产乙醇发酵工艺优化

为获得高效产乙醇的基因重组菌,该研究从克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）WL1316中克隆乙醛脱氢酶aldh基因,进行同源过表达,考察其利用木质纤维素水解液中葡萄糖和木糖的能力,并以乙醇含量为响应值,通过单因素试验及响应面试验对其发酵稻草水解液产乙醇的工艺条件进行优化。结果表明,成功构建了同源过表达aldh基因的重组菌株aldh-pET-28a-Klebsiella sp. WL1316,其保持了野生菌株Klebsiella sp. WL1316利用木质纤维素水解液中葡萄糖和木糖的特性,且发酵稻草水解液产乙醇的最优发酵工艺为发酵时间60 h,异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导浓度1.5 mmol/L,发酵培养基初始pH值7.3,初始还原糖含量59 g/L。在此最优工艺条件下,重组菌株的乙醇含量为（5.39±0.51）g/L,是野生菌株[（3.67±0.32）g/L]的1.47倍,表明aldh基因的过表达促进了乙醇产量的提高。     

乙酰辅酶A含量对酿酒酵母乙酸乙酯合成的影响

通过缺失乙酰辅酶A水解酶（ACH）基因和过表达乙酰辅酶A合成酶（ACS）基因技术提高酿酒酵母合成乙酰辅酶A（acetyl- CoA）能力的同时,过表达醇酰基转移酶（ATF）基因,提高乙酸乙酯合成能力,并考察acetyl-CoA含量对酿酒酵母合成乙酸乙酯能力的影响。结果表明,敲除ACH1基因、且在敲除ACH1基因基础上过表达ACS1、ACS2基因均能提高酿酒酵母Acetyl-CoA含量,进而提高乙酸乙酯含量。较亲本菌株α5,缺失突变株α5ΔACH1、重组菌株α5-A1、α5-A2的Acetyl-CoA的含量均分别提高了52.5%、80.33%、52.79%,乙酸乙酯含量分别提高10.59%、26.12%、23.70%。在敲除ACH1基因、过表达ACS1和ACS2基因的基础上同时过表达ATF1基因,得到工程菌株A1-ATF1和A2-ATF1,较亲本菌株α5,乙酸乙酯含量分别提高226.09%、530.43%、289.57%,工程菌株A1-ATF1乙酸乙酯产量最高,为72.52 mg/L。研究表明,提高乙酰辅酶A含量能够促进乙酸乙酯的合成,为提高乙酸乙酯生成量提供了新思路。     

转木糖还原酶基因XYL1酿酒酵母的构建及产木糖醇能力研究

将人工合成的树干毕赤酵母（Pichia stipitis）的木糖还原酶基因XYL1插入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）表达载体pYES2中,然后将重组质粒pYES2-XYL1导入酿酒酵母INVSc1中,构建转木糖还原酶基因XYL1酿酒酵母菌株INVSc1/pYES2-XYL1,最后采用营养缺陷培养基筛选转木糖还原酶基因酿酒酵母并对其产木糖醇的能力进行检测。结果表明,成功获得2株转木糖还原酶基因XYL1酿酒酵母菌株INVSc1/pYES2-XYL1-01、INVSc1/pYES2-XYL1-02,当两菌株以50 g/L木糖及10 g/L半乳糖为碳源发酵5 d后,木糖醇产量分别高达（13.68±2.37）g/L、（12.09±1.45）g/L,显著高于非转基因酿酒酵母INVSc1的木糖醇产量（1.08±0.37）g/L（P＜0.05）,说明XYL1基因的导入显著提高了酿酒酵母INVSc1生产木糖醇的能力（P＜0.05）。为采用基因工程酿酒酵母制备食用木糖醇提供了理论及技术基础。     

过量表达NADH氧化酶降低酿酒酵母乙醇合成的研究

目的:为了降低在葡萄酒酿造过程中酿酒酵母的乙醇产量。方法:将编码NADH氧化酶的Spnox基因过量表达于酿酒酵母T73中,构建胞内异源NADH氧化途径。结果:与出发菌株酿酒酵母T73/p Y26相比较,重组菌株酿酒酵母T73/p Y26-Spnox胞内总NADH氧化酶活性提高49%,胞内NADH/NAD+比率降低了9%;酿酒酵母T73/p Y26-Spnox发酵模拟葡萄汁所获得的乙醇产量及醇类物质总量分别降低了7%和13%,挥发酸增加了4.5%,挥发性物质种类和含量略有增加。结论:过量表达NADH氧化酶可使葡萄酒在发酵条件下,酿酒酵母合成乙醇或其它醇类物质的能力降低,为进一步优化葡萄酒发酵条件生产降醇葡萄酒打下基础。     

枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因在酿酒酵母中的表达和应用

将优化后的枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(serine alkaline protease,SAP)基因克隆到酿酒酵母表达载体pYES2上,在酿酒酵母Whu2d中进行表达。发酵酿酒酵母工程菌,对重组碱性蛋白酶酶学性质和降解豆粕中蛋白类抗营养因子效果进行研究。结果显示:工程菌发酵液中碱性蛋白酶酶活比出发菌株高55.2%。其最适反应温度和pH分别为45℃和8.0,在pH值为7.0~10.5时具有较好的稳定性,相对酶活可以保持在80%以上。与出发菌株相比,工程菌发酵后豆粕培养基中酸溶蛋白含量提高42.1%,粗蛋白和β-伴大豆球蛋白含量无显著差异,大豆球蛋白和胰蛋白酶抑制因子的含量分别降低41.9%和57.4%。以上结果表明:该碱性蛋白酶酿酒酵母工程菌可以用于饲料、食品等富含蛋白原料的加工。     

白藜芦醇在酿酒酵母中的组合表达

将克隆自拟南芥的4cl基因和巨峰葡萄的rs基因,利用降落重叠延伸PCR的方法,成功构建了含有G418抗性筛选标记的酵母表达载体pRS42K-4CL以及含有潮霉素抗性筛选标记的酵母表达载体pRS42H-RS。采用LiAc/SS carrier DNA/PEG法将含有目的基因的2个载体共同转化至酿酒酵母工业菌株EC1118中,通过PCR及酶切鉴定等方法验证重组工程菌。以对香豆酸为底物,将获得的酿酒酵母工程菌于YPD液体培养基中发酵(25℃,150 r/min,96 h),发酵液用乙酸乙酯抽提后采用高效液相色谱(HPLC)法进行检测,其结果显示发酵产物中白藜芦醇的含量为0.78 mg/L。这表明,拟南芥的4cl基因与巨峰葡萄的rs基因在酿酒酵母工程菌中成功得到了表达,并且表达产物利用对香豆酸为前体物质合成了目标产物白藜芦醇。该研究为进一步实现白藜芦醇在酵母中的工业化生产奠定了基础。     

基于Egfp启动子高通量筛选方法的研究

本研究以载体pUC-19为基础质粒,引入编码增强型绿色荧光蛋白的Egfp为报告基因,选用PGK为启动子,构建重组质粒pUC-PEBBK。通过PCR扩增出重组盒BATs-PGKp-Egfp-PGKt-Kan MX-BATx,将其与酿酒酵母AY15单倍体α5同源重组,获得重组菌株α5-PEBBK。使用荧光显微镜和酶标仪检测EGFP在酿酒酵母中的表达,检测到重组菌荧光强度(RFU)为523,亲本菌株为53,是原菌的10倍,证明Egfp在PGK启动子调控下在酿酒酵母α5中能够正确表达。通过培养基优化,排除了培养基成分酵母浸粉和蛋白胨对绿色荧光蛋白检测的干扰,确定了利于Egfp表达和快速检测的筛选培养基BSM1。考察了接种量和培养时间对Egfp荧光表达和菌体生长的影响,确定了最佳48孔板培养条件为接种量40μL,培养时间为36 h。高效、灵敏的高通量筛选方法的建立为后续系列表达强度启动子的筛选奠定了良好的基础。     

FAS2基因过表达对酿酒酵母风味酯生成能力的影响

研究了共表达脂肪酸合成酶复合体中α亚基的编码基因FAS2和β亚基的编码基因FAS1对酿酒酵母产风味酯的影响。前期实验室构建的过表达FAS1基因的菌株α5F-FAS1和α5O-FAS1可以提高酿酒酵母产中链脂肪酸乙酯的含量,本研究以这两株菌为出发菌株过表达FAS2基因,相比较α5F-FAS1菌株,己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯分别提升了154.31%,65.22%和23.53%;相比较α5O-FAS1菌株,己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、十二酸乙酯分别提升了17.34%,30.71%,27.12%和28.13%。结果显示共表达FAS1和FAS2基因可以更进一步的提升酿酒酵母中链脂肪酸乙酯的产量。同时,本研究还发现,过表达FAS1可以提高乙酸乙酯的生成量。为了探究本现象产生的初步机理,通过RT-PCR测定了合成与利用乙酰辅酶A相关基因的表达量,实验结果表明,过表达FAS1导致的乙酸乙酯生成量上升的现象主要是由于过表达FAS1使得ATF1的表达量上升造成的。     

糖诱导型启动子调控ALD6基因表达降低黄酒中的高级醇生成量

高级醇是影响中国黄酒风味和饮用品质的重要因素之一,适量高级醇可赋予黄酒醇柔、协调的口感,但高级醇过高会导致酒体产生杂醇味,且有强烈的致醉性。在酿酒酵母中,过表达ALD6基因可以显著降低高级醇的生成量,但是过多乙酸的生成会抑制细胞的生长和代谢。由于黄酒发酵是双边发酵,可以通过筛选合适的糖诱导型启动子调控ALD6的表达,在降低高级醇生成量的同时减弱其对细胞生长的抑制作用。该研究选取了6个HXT系列的糖诱导型启动子P_hxt1、P_hxt2、P_hxt3、P_hxt4、P_hxt5和P_hxt7调控乙醛脱氢酶基因ALD6的表达,黄酒发酵结果显示,相较于出发菌株a17,各诱导型重组菌株总高级醇生成量分别下降22.29%、19.26%、42.56%、37.84%、16.72%和30.74%。对比组成型重组菌株a-P_pgk1-A和诱导型重组菌株a-P_hxt3-A发现,二者相较于出发菌株a17均可显著降低总高级醇的生成,但与a-P     

α-PGM过表达对灵芝多糖发酵的影响

为了探究灵芝多糖合成途径中磷酸葡萄糖变位酶(α-PGM)的过表达对灵芝多糖发酵产生的影响,利用农杆菌介导法将同源性基因pgm转化灵芝原生质体,筛选灵芝转化子,测定灵芝胞外多糖产量及胞内多糖含量,并研究多糖合成过程中相关酶基因转录水平的相对表达量和酶的活性。结果发现在PGM过表达的重组型灵芝菌株中胞内多糖含量和胞外多糖量最高分别为21.02 mg/100 mg菌体和0.71 g/L,分别比野生型菌株高9.1%和39.2%;灵芝多糖生物合成途径中pgm、pgi基因转录水平表达量较野生型灵芝菌株处于上调状态,且多糖合成代谢中相关酶活性有显著提高。