Efficient removal of sulfide following integration of multiple copies of the sulfide-quinone oxidoreductase gene (sqr) into the Escherichia coli chromosome

For the oxidation and removal of hydrogen sulfide, which causes an offensive odor from the contents of animal intestines, recombinant strains of Escherichia coli were constructed. The sulfide-quinone oxidoreductase gene (sqr) from Rhodobacter capsulatus was integrated in low copy numbers into the chromosome of Escherichia coli W3110. Multiple copies of sqr on plasmids were also delivered into the cytoplasm of the same strain. The sqr genes were homologously transducted onto the chromosomal lacZ region and their existence there was verified by Southern blot analysis. Sulfide oxidation in a chemical medium effectively increased for the recombinant strains which carried 2 approximately 3 copies of sqr under the control of the lac or tac promoter in the chromosome, and also for strains which carried 10 copies of sqr under the control of the lac or tac promoter on plasmids. In both types of recombinant, the tac promoter was more effective for SQR expression than the lac promoter. Construction of a recombinant with 3 copies of sqr under the control of the tac promoter in the chromosome was unsuccessful. In recombinants with SQR activity lower than 700 nmol/mg cell protein/min, oxygen consumption increased proportionally to SQR activity. An elevation in SQR activity in this range resulted in an increase in oxygen consumption and a decrease in sulfide concentration. When the recombinant cells were cultured until the 160th generation, WL2, WL3 and WT2, which carried 2, 3 and 2 copies of sqr in the chromosome, respectively, retained SQR activity similar to that of the first generation. For WL300 and WT20 which carried multi-copies of sqr in plasmids SQR activity was undetectable. The recombinant with 2 copies of sqr in the chromosome regulated by the tac promoter was most suitable for sulfide oxidation and growth of the cells.     

大肠杆菌链长控制基因ddsA原位替换及多基因共表达对辅酶Q_（10）合成能力的影响

目的强化大肠杆菌合成辅酶Q10（CoQ10）的能力。方法利用途径工程的基本原理,对大肠杆菌辅酶Q生物合成途径中链长控制基因ispB进行遗传操作,并强化表达该途径中多个功能基因。结果首次成功用来自Gluconobacter suboxydans的十聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因ddsA原位替换大肠杆菌染色体上ispB基因,构建得到原位替换株JKL;同时强化表达CoQ生物合成途径的相关基因,发现在ubiCA和ddsA协同表达的重组菌pDCA/JKL中CoQ的合成能力比JKL提高了2.3倍,CoQ10合成量提高了2.5倍。检测该重组菌中ubiA的转录水平,发现其mRNA相对拷贝数是对照JKL的125倍。结论成功获得的重组大肠杆菌在降低内源性CoQ8合成能力的同时具备合成较长侧链CoQ10的能力,且通过强化表达相关基因使合成CoQ10的能力得到了提高。     

脱氮硫杆菌ATCC25259 SQR蛋白及突变体的结构分析与活性研究

本文研究了通过Discovery Studio 3.5利用同源建模法构建了脱氮硫杆菌ATCC25259的硫化物:醌氧化还原酶(Sulfide:quinone oxidoreductase,SQR)野生型蛋白及突变体蛋白模型,通过GROMACS 5.1.2对所有模型进行分子力学及分子动力学的优化,使蛋白模型处于能量较低且结构稳定的状态。使用PROCHECK,Verify 3D和Pro SA三种模型评价方法对模型进行评价,表明蛋白模型具有较高的合理性。使用该蛋白模型计算蛋白相互作用、SAS及能量值。将构建好的SQR及突变体的表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达分子量约65 ku的蛋白。使用镍柱亲和层析纯化经大量表达含有6×His标签的野生型与突变体蛋白,采用已经建立的SQR活性测定方法,进行酶活性测定实验,结果表明突变体酶活性较低。从模拟计算与实验验证两方面说明SQR C端α螺旋结构对蛋白的结构稳定性具有重要影响,蛋白结构稳定性降低,从而酶活性降低。     

敲除ptsG基因及共表达透明颤菌血红蛋白提高大肠杆菌SHMT产量

利用Red同源重组技术敲除大肠杆菌BL21(DE3)的ptsG基因,得到ptsG基因缺失菌株BL21(DE3)ΔptsG。构建重组质粒,得到表达大肠杆菌丝氨酸羟甲基转移酶(serine hydroxymethyltransferase,SHMT)工程菌株BL21(DE3)/pET-glyA、BL21(DE3)ΔptsG/pET-glyA,及共表达SHMT和透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin,VHb)工程菌株BL21(DE3)ΔptsG/pET-SV。在LB培养基中,BL21(DE3)ΔptsG/pET-glyA菌株与BL21(DE3)/pET-glyA菌株生长情况没有明显差异,BL21(DE3)ΔptsG/pET-SV菌株稳定期的OD 600 nm值比BL21(DE3)ΔptsG/pET-glyA菌株提高了21.3%,在LBG培养基中,稳定期BL21(DE3)ΔptsG/pET-glyA菌株OD600 nm值比BL21(DE3)/pET-glyA菌株提高了19.4%,BL21(DE3)ΔptsG/pET-SV菌株OD600 nm值比BL21(DE3)ΔptsG/pET-glyA菌株提高了21.5%。在LBG培养基中,经过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导,与对照菌株BL21(DE3)/pET-28a相比较,两种单表达工程菌株产SHMT活力分别是其6.4倍和7.7倍,共表达工程菌株产SHMT活力是其9.6倍。实验结果表明,敲除ptsG基因能够增加大肠杆菌在含葡萄糖培养基中的生长量及SHMT表达量,共表达VHb能进一步提高菌株生长量和SHMT产量。     

大肠杆菌链长控制基因ddsA原位替换及多基因共表达对辅酶Q_(10)合成能力的影响

目的强化大肠杆菌合成辅酶Q10(CoQ10)的能力。方法利用途径工程的基本原理,对大肠杆菌辅酶Q生物合成途径中链长控制基因ispB进行遗传操作,并强化表达该途径中多个功能基因。结果首次成功用来自Gluconobacter suboxydans的十聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因ddsA原位替换大肠杆菌染色体上ispB基因,构建得到原位替换株JKL;同时强化表达CoQ生物合成途径的相关基因,发现在ubiCA和ddsA协同表达的重组菌pDCA/JKL中CoQ的合成能力比JKL提高了2.3倍,CoQ10合成量提高了2.5倍。检测该重组菌中ubiA的转录水平,发现其mRNA相对拷贝数是对照JKL的125倍。结论成功获得的重组大肠杆菌在降低内源性CoQ8合成能力的同时具备合成较长侧链CoQ10的能力,且通过强化表达相关基因使合成CoQ10的能力得到了提高。     

重组大肠杆菌合成光学纯L-苯基乳酸

以巨大芽孢杆菌Z2013513基因组DNA为模板,分别PCR扩增得到L-乳酸脱氢酶基因(ldh L)和葡萄糖脱氢酶基因(gdh),将gdh与ldh L分别连接至表达载体p ETDuet,获得共表达质粒p ETDuet-ldh L-gdh。经转化和验证获得重组菌大肠杆菌BL21(DE3)/p ETDuet-ldh L-gdh。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和比酶活力分析表明重组蛋白L-乳酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶均成功表达且具有酶活力。在37℃、200 r/min条件下,经60 min反应,催化底物苯丙酮酸合成24.26 mmol/L L-苯基乳酸。产物L-苯基乳酸光学纯度(99%),底物摩尔转化率(59.55%),结果表明此重组体系可用于高效合成高光学纯L-苯基乳酸。     

植物甜蛋白Mabinlin Ⅱ在大肠杆菌中的表达

本研究从马槟榔种子中扩增得到天然植物甜蛋白MabinlinⅡ的全长cDNA序列(M1),并通过特异引物PCR去除部分5'端序列得到修饰型的基因序列(M2).将M1与M2分别克隆至表达载体pET43.1a(+),并分别转化表达宿主菌Escherichia coli BL21(DE3)和Rosetta(DE3),成功构建出...     

重组大肠杆菌全细胞催化D,L-扁桃酸对映选择性制备L-苯甘氨酸

借助pACYCDuet-1和pET28a双质粒共表达系统,构建携带Agrobacterium radiobacter来源扁桃酸消旋酶（Ar mandelate racemase,ArMR）、Lactobacillus harbinensi来源D-扁桃酸脱氢酶（Lh D-mandelate dehydrogenase,LhDMDH）和Exiguobacterium sibiricum DSM 17290来源L-亮氨酸脱氢酶（Es L-leucine dehydrogenase,EsLeuDH）编码基因的重组大肠杆菌,将其命名为E. coli BL21（DE3）/pACYCDuet-1-EsLeuDH-LhDMDH:pET28a-ArMR。在低温、低浓度诱导剂的诱导下,该重组菌成功表达了具有各自催化活性的3 种重组酶,其发酵液中LhDMDH、EsLeuDH和ArMR的活性分别为195.8、56.2 U/mL和174.5 U/mL。以诱导后的全细胞为催化剂、D,L-扁桃酸为底物,在D,L-扁桃酸初始浓度50 mmol/L、pH 9.5的500 mmol/L NH4Cl-NH3·H2O缓冲液体系下,180 r/min、30 ℃反应48 h后,L-苯甘氨酸得率可达77.48%,其对映体过量值大于99%。本研究具有较大的产业化潜力,为实现L-苯甘氨酸规模化的生物合成奠定了坚实的基础。     

重组极耐热内切葡聚糖酶Cel12B的诱导条件及酶的纯化

构建重组菌(JM109/pET-20b-Cel12B)生产极耐热内切葡聚糖酶,研究了不同表达宿主、IPTG诱导时间、IPTG浓度、重组菌生长不同阶段添加IPTG对重组菌生产极耐热内切葡聚糖酶的影响。结果表明:最佳诱导时间是OD值为1.0,IPTG浓度从0.5到3.0对酶活表达影响不大,诱导8h后极耐热内切葡聚糖酶表达量基本不变,优化后重组菌(E.coliBL21-CodonPlus(DE3)-RIL/pET-20b-Cel12B)表达酶活比原来菌株(E.coliJM109(DE3)/pET-20b-Cel12B)提高了53.9%,经过热处理和亲和层析得到电泳纯的蛋白条带。     

带有突变穿膜肽重组凋亡素可溶性表达的研究

目的构建apoptin（凋亡素）-HBDCK-pET28a突变体重组表达载体,在大肠杆菌BL21（DE3）中实现高效可溶性表达,并观察突变后穿膜肽（CPP）在HeLa细胞中的转导活性。方法采用PCR介导突变方法将重组蛋白apoptin-HBD及EGFP-HBD的HBD结构域中的Cys（C）突变为Lys（K）。突变的重组质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,Ni2＋-NTA亲和层析纯化目的蛋白,进一步观察HeLa细胞突变后HBD的转导活性。结果经双酶切鉴定和序列分析,突变后的重组质粒apoptin-HBDCK-pET28a及EGFP-HBDCK-pET28a构建正确。转化E.coli BL21（DE3）后,融合蛋白均获得可溶性表达。EGFP-HBDCK作用于HeLa细胞13 h后,可观察到细胞内强绿色荧光。结论 HBD结构域中C突变为K,可达到融合蛋白可溶性表达的目的,且仍能保持很强的转导活性,可携带EGFP蛋白进入HeLa细胞。     

构建高效糖配体再生重组菌生物催化合成莱鲍迪苷D

利用拟南芥（Arabidopsis thaliana）蔗糖合酶AtSUS3构建活化糖配体尿苷二磷酸葡萄糖（uridine diphosphate glucose,UDPG）再生体系,与高效催化莱鲍迪苷D（rebaudioside D,RD）合成的糖基转移酶协同偶联完成RD的高效生物催化。从拟南芥cDNA克隆获得AtSUS3基因,将其装配至pET28a获得表达质粒pLW105,随后pLW105与携带糖基转移酶EUGT11基因的质粒共转化大肠杆菌BL21（DE3）构建双酶共表达工程菌。在不添加UDPG或者尿核苷二磷酸（uridine diphosphate,UDP）的条件下,以上述双酶共表达工程菌全细胞催化莱鲍迪苷A（RA）获得的底物摩尔转化率大于80%,RD产量达到930?mg/L。随后构建双酶基因串连质粒pLW108及双酶共表达大肠杆菌BL21（DE3）工程菌。用串连质粒构建的工程菌催化效果与双质粒共转化相同。采用共表达双酶工程菌的发酵破碎粗酶进行催化,结果显示以粗酶催化可简化催化体系,并可将细胞催化体系所需高质量浓度蔗糖用量降至质量浓度5 g/100 mL,同时在不添加外源UDPG的条件下实现RD的高效生物催化,RA底物摩尔转化率达到93%,RD产量约为1?051?mg/L。     

乳糖诱导重组大肠杆菌表达胆固醇氧化酶的研究

采用乳糖诱导胆固醇氧化酶(COD)基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,研究了培养基成分、乳糖浓度、诱导时间和诱导温度对胆固醇氧化酶表达的影响。结果显示,在对诱导条件进行优化控制的前提下,胆固醇氧化酶酶活达到15.2 U/mL。研究结果为乳糖作为诱导剂最终应用于重组基因工程药物的工业化生产提供了有益的参考和借鉴。     

Double knockout of β-lactamase and cephalosporin acetyl esterase genes from Escherichia coli reduces cephalosporin C decomposition

The phenomenon of CPC decomposition occurs in Escherichia coli JM105/pMKC-sCPCacy during the one-step enzymatic conversion of cephalosporin C (CPC) into 7-aminocephalosporanic acid (7-ACA) by CPC acylase (sCPCAcy) for synthesis of cephalosporin antibiotics. E. coli JM105/pMKC-sCPCacy can constitutively produce sCPCacy as a fusion protein with maltose binding protein (MBP). Control experiments verified that the cell lysis solution from the host E. coli JM105 resulted in CPC decomposition by approximately 15%. Two miscellaneous enzymes, β-lactamase (AmpC) and cephalosporin acetyl esterase (Aes), are believed to play a major role in the degradation of CPC. Using the Red recombination system, the genes ampC, aes or both ampC and aes were knocked out from the chromosome of E. coli JM105 to generate the engineers: E. coli JM105(ΔampC), E. coli JM105(Δaes) and E. coli JM105(ΔampC, Δaes). The CPC decomposition was reduced to 12.2% in E. coli JM105(Δaes), 1.3% in E. coli JM105(ΔampC), and even undetectable in ampC-aes double knockout cells of E. coli JM105(ΔampC, Δaes). When catalyzed by crude MBP-sCPCAcy isolated from E. coli JM105(ΔampC, Δaes)/pMKC-sCPCacy (3377U·l(-1)), the CPC utilization efficiency increased to 98.4% from the original 88.7%. Similar results were obtained for the ampC-aes double knockout host derived from E. coli JM109(DE3) and the CPC utilization efficiency enhanced to 99.3% in the catalysis of crude sCPCAcy harvested from E. coli JM109(DE3, ΔampC, Δaes)/pET28-sCPCacy.     

变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸差向异构酶基因的原核表达

采用降落聚合酶链式反应（touchdown polymerase chain reaction,TD-PCR）技术,从2-酮基葡萄糖酸工业生产菌株变形假单胞菌JUIM01中克隆了编码2-酮基葡萄糖酸差向异构酶的基因kguE。将目的基因与质粒pET-28a（＋）重组后转入宿主表达菌中,获得了重组菌株大肠杆菌BL21（DE3）/pET-28a（＋）-kguE。在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的诱导下,该重组菌株表达了一个分子质量约为30.5?ku的融合蛋白,且该蛋白的Western-blot鉴定结果显示为阳性。生物信息学分析结果表明,该蛋白是一种由256?个氨基酸残基组成的分子质量为28.5?ku的亲水性蛋白,与恶臭假单胞菌的2-酮基葡萄糖酸差向异构酶在氨基酸序列上的一致性达78%,定位于细胞质中,其二级结构中α-螺旋、延伸链和无规则卷曲所占的比例分别为40.62%、17.19%和42.19%。本研究结果为变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸差向异构酶的功能研究提供了一定理论支持。     

第一类整合酶表达载体的构建及鉴定

Inti1基因是编码整合酶的基因,采用PCR方法对Inti1基因片断进行扩增,扩增子采用Ned1和BamH1双酶切,并克隆到pET19b载体上.把构建好的载体转化至E.coli BL21(DE3)中,在IPTG下进行诱导表达.经SDS-PAGE电泳鉴定以及使用特异性抗His-整合酶单克隆抗体的Western-Bloting证明该重组E.coli BL21(DE3)-Inti1在IPTG诱导下可表达整合酶,此为整合酶表达调控研究奠定了基础.     

碳源对manA基因突变大肠杆菌代谢的影响

ManA基因编码的甘露糖-6-磷酸异构酶在大肠杆菌中催化D-甘露糖和D-果糖的异构化,促进大肠杆菌对碳源的代谢吸收。本文通过研究manA基因突变大肠杆菌对碳源的利用和编码糖代谢基因情况,探讨甘露糖-6-磷酸异构酶对大肠杆菌糖代谢的影响。采用Ⅱ型内含子逆转录突变方法构建manA基因突变大肠杆菌,分析manA基因突变大肠杆菌对不同碳源的利用情况和manA基因突变对大肠杆菌糖代谢相关基因表达的影响,结果显示,大肠杆菌BL21(DE3)ΔmanA以甘露糖、果糖为碳源时,菌株生长受到显著抑制;以淀粉为碳源时,BL21(DE3)ΔmanA菌株的生长显著优于野生型大肠杆菌;以葡萄糖为碳源时,manA基因突变对大肠杆菌的生长无显著影响。通过基因表达分析,发现大肠杆菌BL21(DE3)ΔmanA中甘露糖代谢相关基因的表达显著性降低;果糖代谢途径中6-磷酸果糖激酶Ⅰ亚基的编码基因(pfkA)显著下调表达;水解淀粉的α-淀粉酶编码基因(malS)显著性上调表达。ManA基因突变影响大肠杆菌甘露糖、果糖和淀粉代谢途径中相关基因的表达,从而影响大肠杆菌对碳源的利用。     

以纤维二糖为底物利用重组大肠杆菌合成海藻糖

探讨以纤维二糖为底物合成海藻糖的可行性。首先克隆来自施氏假单胞菌A1501的otsA/otsB基因,外源导入Escherichia coli BL21（DE3）构建以葡萄糖为底物合成海藻糖的OtsAB途径。继而通过过表达E. coli本身的galU基因增加海藻糖合成前体物质尿苷二磷酸（uridine diphosphate,UDP）-葡萄糖的含量,使海藻糖产量提高了3 倍。通过添加井冈霉素抑制海藻糖的降解,进一步提高海藻糖的产量。在此基础上,过表达来自天然纤维素分解细菌Saccharophagus degradans的纤维二糖磷酸化酶基因cepA,使重组大肠杆菌具有利用纤维二糖产海藻糖的能力。利用该重组大肠杆菌全细胞催化生产海藻糖,底物为20 g/L纤维二糖,并添加0.05 mmol/L的井冈霉素抑制海藻糖降解时,48 h后可生成1.3 g/L的海藻糖。本研究利用重组大肠杆菌以纤维二糖为底物合成海藻糖,证实了以纤维二糖为底物合成海藻糖的可行性,为纤维二糖来源精细化学品的生产提供了新的思路。     

酿酒酵母GSH Ⅰ基因的克隆、表达与结构分析

γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（GSHI）是合成谷胱甘肽的关键酶。通过构建GSHI活性较高的重组菌来提高合成GSH的能力。利用PCR技术扩增获得了酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）2-10515的gshI基因,构建原核表达载体pET-28a-gshI,转化到Escherichia coli BL21（DE3）中,重组菌经诱导表达后,测得GSHI的酶活力为46.09U/mg湿菌,活性较高。进一步利用生物信息学方法分析和预测GSHI基因的序列和蛋白结构,为在基因水平上提高该酶的表达量和活性提供了理论依据。      

极端耐热木聚糖酶基因在大肠杆菌中的高效表达

海栖热袍菌Thermotogamaritima为嗜极端高温的厌氧细菌 ,其产生的极耐热性木聚糖酶B具有非常可观的工业应用前景。但编码该酶的基因xynB在大肠杆菌中的表达较困难。文中利用PCR技术将xynB克隆至原核表达载体pET 2 0b ,并与组氨酸标签进行融合构建成重组质粒 pET 2 0 xynB。研究发现 ,pET 2 0 xynB在稀有密码子AGA ,AGG和AUA得到加强的大肠杆菌宿主菌株BL2 1 CodonPlus(DE3 ) RIL中 ,木聚糖酶基因的表达水平远远高于在其他菌株中的表达。结合对重组菌的诱导条件的优化 ,使得重组蛋白表达量达到11 5 % ,比酶活达到 2 5 69U/mg ,比常规基因工程菌株提高 12 5倍。     

响应面法优化重组大肠杆菌全细胞合成D-苯基乳酸

研究利用重组大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）/pET-28a-ldhD全细胞生物转化苯丙酮酸（phenylpyruvic acid,PPA）合成D-苯基乳酸（D-phenyllactic acid,D-PLA）的条件。通过Plackett-Burman试验设计,从影响细胞转化的6 种因素中筛选得出转化温度、底物浓度和磷酸钠缓冲液pH值对底物PPA摩尔转化率有显著影响;采用Box-Behnken试验设计和响应面优化,对该重组菌全细胞转化合成D-PLA的条件进行了优化。最佳分批转化条件：转化温度为38 ℃、底物浓度为42 mmol/L、磷酸钠缓冲液pH 7.0、菌体质量浓度20 g/L、葡萄糖质量浓度20 g/L。在该条件下反应0.5 h,底物摩尔转化率为65.32%。根据此最佳转化条件,经4 h的间歇补加底物转化获得D-PLA最终浓度为119 mmol/L（19.75 g/L）,生产率为4.94 g/（L·h）。