Elektrophoretische Differenzierung hitzedenaturierter und eisgelagerter Fischproteine

Zusammenfassung Eine Natrium-dodecylsulfat(SDS)-Lösung mit Mercapto-ethanol in Tris-Borat-Puffer pH 8.9 löst bei Raumtemperatur alle Fischproteine, auch die von gekochten Proben. Die Trennung durch Polyacrylamidgel(PAG)-Elektrophorese in Gegenwart von SDS ergibt trotz verschiedener Vorbehandlung artencharakteristische Pherogramme, vor allem im Bereich der sarkoplasmatischen Proteine. Die PAG-Focussierung der SDS-extrahierten Proteine gelingt nach Fällung von überschüssigem SDS und Trennung in PAG unter Zugabe von Harnstoff und Tetramethylharnstoff im pH-Bereich von 2–11. Dabei wird das artenspezifische Muster überlagert von einer Veränderung, die z. T. die fortschreitende Autolyse etc. während der Lagerung widerspiegelt.

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Evaluation of fish proteins by electrophoretic methods after boiling and after storage on ice

Summary All proteins from fish including boiled samples can be dissolved at room temperature in Tris-borate-buffer pH 8.9 containing 2% Sodiumdodecylsulfate (SDS) and 1% mercapto-ethanol. The separation is carried out in polyacrylamidegels (PAG) by SDS-electrophoresis, showing a species-specific pattern even for the heated samples. Focussing in PAG after removing SDS by precipitation and separation in the presence of urea and tetramethyl-urea between pH 2 and 11 showed species-specificity and a shift of protein bands which partially mirrored the increasing autolysis and degradation of the samples during storage.

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Verwendete Abkürzungen PAA Polyacrylamid - PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese - PAGIF Polyacrylamidgelisoelektrische Focussierung - SDS Natrium(Sodium)-dodecylsulfat - ME 2-Mercapto-ethanol - Tris Tris-(hydroxymethyl)aminomethan - kD Kilo-Dalton (Einheit für scheinbares Molekular-Gewicht)     

Electrophoretic techniques for species identification of fishery products

Summary At the present time species identification of fishery products is mainly performed by electrophoresis; in most cases isoelectric focusing (IEF) is given preference over other electrophoretic techniques. In this review the possibilities of application of IEF and other electrophoretic methods for analysis of raw, dried, salted, smoked, ripened, cooked or canned fish are discussed. It is shown that the protein patterns may be influenced by the type of muscle (light or dark), the freshness of fish or fillet, and by the conditions of frozen storage. Reference samples must often be used to obtain unequivocal results. A protein dry powder is introduced, which has been prepared from the sarcoplasmic fraction of many fish species yielding species-specific protein patterns. The powder is stable at room temperature and can be shipped without cooling.

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Elektrophoretische Methoden zur Bestimmung der Tierart in Fischereiprodukten

Zusammenfassung Zur Zeit erfolgt die Bestimmung der Tierart in Fischereiprodukten nahezu ausschließlich mit elektrophoretischen Methoden, vorzugsweise durch die isoelektrische Focussierung (IEF). In der vorliegenden Übersichtsarbeit werden die Anwendungsmöglichkeiten der IEF und anderer Elektrophoreseverfahren zur Analyse roher, getrockneter, gesalzener, geräucherter, gereifter, gegarter oder sterilisierter Fischereiprodukte diskutiert. Es wird aufgezeigt, in welchem Ausmaß die Proteinmuster durch die Art der Muskulatur (hell oder dunkel), den Frischegrad der Fische bzw. Filets und durch die Gefrierlagerbedingungen der Produkte beeinflußt werden. In vielen Fällen kann auf Referenzproben nicht verzichtet werden; es wird ein Proteinpräparat vorgestellt, das aus der sarkoplasmatischen Fraktion zahlreicher Fischarten isoliert wurde und Spezies-spezifische Proteinmuster lieferte. Das Präparat ist bei Raumtemperatur stabil und kann daher ohne Aufwand verschickt werden.

     

Einflu? des Erhitzens auf L?slichkeit und Elektrophoreseverhalten der Sarkoplasmaproteine von Rind- und Schweinefleisch

Zusammenfassung Die Hitzestabilität der Sarkoplasmaproteine bei Rind- und Schweinefleisch wurde anhand der Löslichkeit und der Proteinmuster nach elektrophoretischer Auftrennung untersucht. Als Untersuchungsmethoden kamen die Proteinbestimmung nach Bradford und die isoelektrische Focussierung in rehydratierbaren Polyacrylamidgelen zur Anwendung. Die focussierten Proteine wurden mit Hilfe der Silberfärbung sichtbar gemacht. Die Gesamtproteinkonzentrationen der Extrakte verringerten sich bis zu einer Temperatur von 80°C mit zunehmender Höhe und Dauer der Hitzebelastung. Bei den auf 100°C erhitzten Proben nahmen die Proteinkonzentrationen wieder geringfügig zu. Die Intensität der Proteinbanden nahm allgemein mit steigender Temperatur und Erhitzungszeit ab. Die deutlichsten Änderungen der Bandenmuster zeigten sich im untersuchten Temperaturbereich bei dem auf 100°C erhitzten Fleisch. Durch eine Nacherhitzung der Fleischproben konnten erhitzungsbedingte Unterschiede in den Bandenmuster ausgeglichen werden. Auf diese Weise ist eine elektrophoretische Tierartenidentifizierung bei erhitztem Fleisch unabhängig von der Kenntnis der Erhitzungsbedingungen möglich.

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Influence of heat on solubility and electrophoretic behaviour of sarcoplasmic proteins of beef and pork

Summary The heat stability of sarcoplasmic proteins of beef and pork was investigated by means of their solubility and their protein patterns after electrophoretic separation. The method of determination of proteins described by Bradford and isoelectric focusing in rehydratable polyacrylamide gels were used for these investigations. The electrofocused proteins were visualized by silver staining. The concentration of total protein of the extracts decreased with increase in temperature and heating time (up to a temperature of 80° C). However the protein concentration increased in samples heated to 100° C. The intensity of the protein bands decreased with increasing temperature and heating time. In the investigated range of temperature, variations in protein patterns were most significant in meat heated to 100° C. Differences of protein pattern caused by different heating conditions could be equalized by a second heating of the samples. In this way it is possible to identify meat species without knowing the heating conditions.

     

Proteine des Bienenhonigs VI. Isoelektrische Focussierung der Amylase verschiedener Honigsorten

Zusammenfassung Von Begleitenzymen getrennte Amylase aus dem Proteinkonzentrat von Raps-, Tannen-und Zuckerfütterunghonig wurde mittels präparativer und analytischer isoelektrischer Focussierung (IeF) näher charakterisiert. Bei der präparativen IeF mußte festgestellt werden, daß die zum Aufbau des pH-Gradienten benutzten Ampholine (LKB) Jod verbrauchen und somit bei der üblichen Jod/Stärke-Reaktion Amylaseaktivität vortäuschen und daß Dextrangele als Träger aufgrund ihrer Wechselwirkungen mit dem Enzym die Focussierung erlagern.Hingegen führte die auf ultradünnen Polyacrylamidgelen vorgenommene analytische IeF mit den aus Proteinkonzentrat von Raps, Tannen- und Zuckerfütterungshonig isolierten Amylasen zu 10 jeweils übereinstimmenden Proteinbanden. Mit einer neu entwickelten Zymogrammtechnik konnte bei allen Banden Amylaseaktivität festgestellt werden, inaktive Banden lagen nicht vor. Der Glykoproteinnachweis war bei allen 10 Banden positiv.

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The proteins of honey VI. Isoelectric focusing of different honey amylases

Summary The isolated honey amylase was characterized by preparative and analytical isoelectric focusing. An interesting aspect of the preparative isoelectric focusing was the reduction of iodine by Ampholines which were used for building up a pH-gradient, giving a false increase in apparent amylase activity as determined by the iodine/starch reaction. Dextran gels were not suited for the matrix, because interactions with the enzyme disturb the focusing. From the analytical isoelectric focusing of isolated honey amylase in ultrathin layer Polyacrylamide gels 10 protein bands resulted. A newly developed zymogram technique was positive for amylase activity in all 10 protein bands.

     

SDS electrophoresis of legume seed proteins in horizontal ultrathin-layer pore gradient gels

Summary Horizontal SDS electrophoresis of 18 legume seed protein extracts was performed in ultrathin-layer polyacrylamide gels on foil supports. Separation results of the SD S pore gradient electrophoresis (T=4–22.5%) are compared to those of SDS electrophoresis in a constant pore size gel (T=10%). Resolution as well as the sensitivity (0.1 g protein per band) of the ultrathin-layer SDS pore-gradient electrophoresis were extremely high. Because of the very low gel thickness, separation, staining and drying were completed in substantially shorter times than achieved with conventional thick gels. An easy technique for casting ultrathin-layer (360 gm) concave gradient gels for 10 cm separation distance and a width of 25 cm is described. The even distribution of the concave exponential pore-gradient over the whole gel width is demonstrated. Molecular weights of the legume proteins are detected from 5,000 to 110,000 daltons. The protein patterns are genus- and species-specific.

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Horizontale Ultradünnschicht SDS-Gradientengel-Elektrophorese von Leguminosensamenproteinen

Zusammenfassung Die ausgezeichnete Trennschärfe der horizontalen Ultradünnschicht-SDS-Gradienten-gel Elektrophorese wird am Beispiel von Samenproteinen 18 verschiedener Leguminosengattungen, -arten und -sorten gezeigt. Es werden die Trennergebnisse der SDS-Elektrophorese mit Gelgradienten (T=4-22,5%) bzw. mit Gelen konstanter Porengröße (T=10%) verglichen. Das höchste Auslösungsvermögen und die beste Trennschärfe zeigen ultradünne Gradientengele. Die Nachweisempfindlichkeit ist bei allen Ultradünn-schicht-SDS-Elektrophoresen sehr hoch (0,1 g Protein/Bande). Da die auf Folie polymerisierten Gele sehr dünn sind (360 m) kann mit wesentlich verkürzten Trenn-, Färbe-, Entfärbe- und Trocknungszeiten gear-beitet werden. Es wird eine einfache Herstellung ultradünner Polyacrylamidgele mit exponentiellen konkaven Gradienten für die Trenndistanz von 10 cm mit einer Breite von 25 cm beschrieben. Die gerade und gleichmäßige Verteilung des Gradienten über die gesamte Gelbreite wird gezeigt. Mit der beschriebenen Methode werden bei den untersuchten Leguminosen-proteinen Molekulargewichte von 5 000 his 110 000 Dalton gefunden. Die Proteinmuster erweisen sich als gattungs- und artspezifisch.

     

Ionen-chromatographische Analyse von Kationen und Anionen in Mineralw?ssern

Zusammenfassung Zur simultanen Analyse der Kationen Li, Na, K, Ca und Mg sowie Mn und der Anionen Hydrogencarbonat, Chlorid, Sulfat und Nitrat wurden Austauscher auf Kieselgel- und Polymerbasis mit Leitfähigkeits- und photometrischer Detektion in Kombination mit der Nachsäulenderivatisierung (System PAR-Zn-EDTA für Ca, Mg, Mn) sowie ein Ionenpaar-System mit RP-18-Phase eingesetzt und für die Anwendung auf Mineralwasserproben verglichen. Li-, Na- und K-Bestimmungen lassen sich in Mineralwässern sowohl mit als auch ohne Suppressortechnik an Polymersäulen durchführen. An einem Polybutadienmaleinsäure-Kieselgel-Kationanaustauscher ist eine simultane Alkali- und Erdalkali-Analyse möglich. An einem Kieselgel-Anionenaustauscher lassen sich mit EDTA als Elutionsmittel Ca, Mg sowie Hydrogencarbonat, Chlorid, Sulfat und Nitrat (ab 2 mg/L) in weniger als 16 min analysieren. Wegen der unterschiedlichen Konzentrationsverhältnisse sind meist zwei Einspritzungen verschiedener Verdünnungen (zwischen 14 und 1125) erforderlich, um im linearen Bereich der Kalibrierfunktion zu bleiben. Für Mangan-Analysen ab 100 g/L eignet sich ein System aus dem Kationenaustauscher Partisil SCX und dem Eluenten Ethylendiamin/Oxalat mit Nachsäulenderivatisierung. Die Probenvorbereitung besteht in einer Reduktion mit Thiosulfat. Anhand 15 verschiedener Mineralwässer wurden mit allen Systemen Analysen durchgeführt und die Ergebnisse mit denen von Referenzmethoden (AAS, Potentiometrie) verglichen, wobei eine gute Übereinstimmung festgestellt werden konnte.

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Ion chromatography of cations and anions in mineral waters

Summary For the simultaneous analysis of the cations Li, Na, K, Ca, and Mg as well as Mn and the anions hydrogen carbonate, chloride, sulfate and nitrate, silica geland polymer-based ion exchange materials with conductivity and spectrophotometric detection combined with a post-column derivatization system (PAR-Zn-EDTA for Ca, Mg, Mn) and also an ion-pair system with RP-18 phase were compared with a view to their application to mineral water samples. It is possible to determine Li, Na, and K in such samples with or without the suppressor technique using polymer columns. A polybutadiene maleic acid silica gel cation exchanger material makes feasible simultaneous analysis of alkaline and earth alkaline metals. Ca, Mg, and hydrogen carbonate, chloride, sulfate and nitrate are analyzed in less than 16 min using a silica gel anion exchanger with EDTA as the eluent. To stay within the linear range of the calibration function it is necessary to perform two injections in different dilutions (between 14 and 1500) due to the different concentration ratios. For the analysis of manganese above 100 g/L a system with the cation exchanger Partisil SCX and the eluent ethylendiamine/oxalate with post-column derivatization is used. The sample pretreatment is done by reduction with thiosulfate. A total of 15 different mineral waters were analyzed with all the systems and the results were compared with those of reference methods (AAS, potentiometry), showing good conformity.

     

Die Mikroflora des Sauerteiges XX. Mitteilung: Der Einflu? der Hefe auf die proteolytischen Vorg?nge im Verlaufe der Sauerteigg?rung

Zusammenfassung Von den Milchsäurebakterien des Sauerteiges geht eine Proteolyse aus. Diese führt im Verlaufe der Sauerteiggärung zu einem Anstieg des Gehaltes des Sauerteiges an Aminosäuren. Sind an der Sauerteiggärung Hefen beteiligt, dann ist der Anstieg des Aminosäuregehaltes geringer. Dies tritt in Gegenwart vonSaccharomyces cerevisiae in stärkerem Maße hervor als vonCandida krusei. Der geringere Aminosäuregehalt hefehaltiger Sauerteige war insbesondere auf einen Verbrauch an Asparagin, Alanin, Glycin und Serin zurückzuführen.

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The Microflora of Sourdough XX. Communication: The Influence of Yeast on the Proteolysis during Sourdough Fermentation

Summary Lactic acid bacteria of sour dough hydrolyse proteins. During the fermentation step the amino acid content of the sourdough increases. When yeasts participate in the fermentation the increase on the amount of amino acids is smaller.Saccharomyces cerevisiae reduces the proteolytic activity more thanCandida krusei. The lower amino acid content of sour-doughs which contain yeasts is caused by the consumption of asparagine, alanine, glycine and serine.

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Nr. 5188 der Veröffentlichungen der Bundesforschungsanstalt für Getreide- und Kartoffelverarbeitung än Detmold

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Diese Untersuchungen wurden durch eine finanzielle Förderung seitens der Arbeitsgemeinschaft Industrieller Forschungsvereinigungen e. V. ermöglicht     

Determination of the heating temperature of fishery products

Summary The German Fish Directive prescribes that products must be heated to the core temperature of +70° C to kill existing larvae of nematodes. For subsequent determination of the heating temperature samples were extracted with water. The extracts were analysed for protein content, for protein patterns obtained by isoelectric focusing and by using the coagulation test. The suitability of these methods was investigated with heated extracts, heated minced fish flesh, and smoked herring and mackerel. Smoking was performed in the kiln of the institute at controlled temperatures. Analysis of commercial samples showed that the core temperature during smoking of herring and mackerel must have been clearly below 70° C in several cases.

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Bestimmung der Erhitzungstemperatur von Fischereiprodukten

Zusammenfassung Die deutsche Fischverordnung schreibt vor, daß zum Abtöten eventuell vorhandener Nematodenlarven eine Kerntemperatur des Produktes von mindestens +70 °C erreicht werden muß. Zur nachträglichen Bestimmung der Erhitzungstemperatur wurden wäßrige Extrakte erhitzter Proben folgenden Analysen unterzogen: 1. Bestimmung des Proteingehaltes; 2. Flockungstest; 3. Isoelektrische Focussierung. Die Eignung dieser Methoden wurde mit erhitzten Extrakten und Proben aus zerkleinertem Fischfleisch sowie mit Heringen und Makrelen, die bei definierten Temperaturen geräuchert wurden, geprüft. Die nachfolgende Analyse von Handelsware ergab, daß bei mehreren Proben die Kerntemperatur bei der Räucherung deutlich unterhalb von 70 °C gelegen haben mußte.

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Part of this work was presented at the 21^st Annual Meeting of the Western European Fish Technologists Association (WEFTA) in Copenhagen on 25 August 1991     

Schnelle und hochaufl?sende Visualisierung von Enzymen in Polyacrylamidgelen

Zusammenfassung Eine einfache Methode zur Visualisierung enzymatisch aktiver Komponenten wird am Beispiel pectinolytisch, amylolytisch und proteolytisch wirksamer Enzyme beschrieben. Die Enzyme werden durch ultradünnschicht-isoelektrische Focussierung bzw. ultradünnschicht Gradientengelelektrophorese getrennt. Auf das Trenngel wird ein 120 m oder 240 m dickes, auf Folie polymerisiertes Acrylamidgel aufgerollt, welches ein für das jeweilige Enzym spezifisches und auf optimalen pH-Wert gepuffertes Substrat enthält. Nach einer definierten Reaktionszeit wird es vom Trenngel abgenommen, kurz in Wasser gewaschen, angefärbt und entfärbt. Die Trennschärfe der Focussierung oder Elektrophorese ist in den Abklatschgelen exakt reproduziert und die Nachweisempfindlichkeit gegenüber bisherigen Enzymvisualisierungen deutlich erhöht. Das Trenngel kann ohne wesentliche Bandenverluste zur Proteinanfärbung weiter behandelt werden.

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A rapid and sensitive method for visualization of enzymes in polyacrylamide gels

A simple method for activity staining of pectinolytic, amylolytic and proteolytic enzymes is described. The enzymes are separated by ultrathinlayer isoelectric focusing or ultrathinlayer gradient gel electrophoresis. After successful separation an ultrathin acrylamide gel on foil support containing a specific substrate buffered to optimal pH for the enzyme to be visualized, is pressed onto the surface of the separating gel. After the reaction time the print gel is removed, washed with water, stained and destained. The resolution of the ultrathinlayer isoelectric focusing or ultrathinlayer gradient gel electrophoresis is exactly reproduced in the print gel, the sensitivity in comparison to conventional activity staining methods is improved. The separating gel can be further employed for protein staining without loss of activity.

     

Comparative study of different methods for evaluating proteolysis in blue cheese

Summary Methods of evaluating proteolysis using different precipitants and nitrogen evaluation methods were assessed. The coefficient of determination (R ²) values relating the various methods and the ripening period were positive and greater than 0.87. Amino acid nitrogen in the fraction soluble in 12% trichloroacetic acid had the highest coefficient value (R ²=0.95). Of all the methods for evaluating nitrogen, dialysis had the highest value ofR ² with respect to water-soluble nitrogen determined using the Kjedahl method. However, dialysis is not applicable to blue cheeses with high mould contents. Cluster analysis was applied to the ripening index values and yielded groupings according to the method of nitrogen evaluation.

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Vergleichende Studie über verschiedene Methoden der Bewertung der Proteolyse im Blauschimmelkäse

Zusammenfassung Die Methoden zur Bewertung der Proteolyse verwenden verschiedene Methoden an Fällungsmitteln und der Stickstoffauswertung. Die Koeffizienten der Bestimmungswerte (R ²) bei verschiedenen Methoden und der Reifungsperiode waren positiv und größer als 0,87. Der Aminosäuren-Stickstoff in der löslichen Fraktion in der 12%igen Trichloressigsäure hatte den höchsten Wert (R ²=0,95). Von allen Methoden der Stickstoff-Bewertung hatte die Dialyse den höchstenR ²-Wert bezogen auf den mit der Kjeldahl-Methode erzielten wasserlöslichen Stickstoff; jedoch die Dialyse ist bei Blauschimmelkäse mit hohem Pilzgehalt nicht brauchbar. Die Cluster-Analyse war für den Reife-Index und die Gruppenausbeute für die Methoden der Stickstoff-Auswertung anwendbar.

     

Die Mikroflora des Sauerteiges

Zusammenfassung Es wurden Ermittlungen über das Aminosäurebedürfnis der an der Sauerteiggärung beteiligten Milchsäurebakterien der UntergattungStreptobacterium undBetabacterium angestellt. Von der überprüften Sauerteigbakterien waren 51 Stämme aus sog. Reinzuchtsauern und 24 Stämme aus Sauerteigen isoliert worden. Die Sauerteigbakterien zeigten keinen Bedarf an Hydroxyprolin, Norleucin und Norvalin. Soweit es die homofermentativen Milchsäurebakterien des Sauerteiges betrifft, besteht darüber hinaus kein Bedarf an Alanin und Serin. Keiner der überprüften Stämme war in der Lage, sich in Abwesenheit von Glutaminsäure und Valin zu entwickeln. Außerdem sind für die Mehrzahl der Sauerteigbakterien Arginin, Cystein, Leucin, Methionin, Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin essentiell. Die Versorgung mit Glycin, Isoleucin, Lysin, Prolin und Serin ist nur für einen Teil der Sauerteigbakterien erforderlich. Es fällt auf, daß in Reinzuchtsauern und Sauerteigen Milchsäurebakterien vorherrschen, die einen hohen Bedarf an Aminosäuren haben, wieLactobacillus brevis var. lindneri, L. fructivorans undL. farciminis.

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The Microflora of SourdoughVI. Communication: The Amino Acid Requirement of Lactic Acid Bacteria (Genus Lactobacillus Beijerinck) in Reinzuchtsauer and in Sourdough

Summary Research was done regarding the amino acid requirement of lactic acid bacteria, subgenusStreptobacterium andBetabacterium during the sourdough fermentation. 51 strains of the investigated sourdough bacteria were isolated from the so called Reinzuchtsauer (a starter culture) and 24 strains from sourdough. None of the sourdough bacteria showed any requirement of hydroxyproline, norleucine, and norvaline. The homofermentative lactic acid bacteria have no requirement for alanine and serine. No tested strains were able to grow in the absence of glutamic acid and valine. Most of the sourdough bacteria have a requirement for arginine, cystein, leucin, methionine, phenylalanine, tryptophane, and tyrosine. Glycine, isoleucin, lysine, proline and serine are only necessary for some of the sourdough bacteria. It is significant that lactic acid bacteria with a very high requirement of amino acid (particularlyLactobacillus brevis var. lindneri, L. fructivorans and L. farciminis) predominate in Reinzuchtsauer and sourdoughs.

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Diese Untersuchungen wurden ermöglicht durch eine finanzielle Förderung seitens des Bundesministeriums für Forschung und Technologie im Rahmen des Programmes Biologie und Technik