不同灭活方法在原生质体融合选育米曲霉菌株中应用的研究

实验选取生长速度快的米曲霉菌株AS3.951和产酶活力高的米曲霉菌株CICC2339为对象菌,通过探讨紫外、微波、超声波-热三种不同的物理灭活方法进行米曲霉的原生质体融合,并比较不同方法灭活后进行原生质体融合所得米曲霉融合菌株的性状。结果表明,AS3.951采用紫外灭活、CICC2339采用超声波-热灭活时其融合率最高为6.69%,以此方式筛选得到的融合菌株AC126、AC171产酶能力均高于产酶活力高的亲本菌株CICC2339,且遗传稳定。     

微波-紫外灭活原生质体融合选育米曲霉菌株的研究

实验对生长速度较快但产酶能力较低的米曲霉CICC2339的原生质体采用700W微波灭活12s,对产酶能力较高但生长速度较慢的米曲霉AS3.951的原生质体采用15W紫外灭活5min,然后对灭活双亲用PEG作融合剂进行原生质体融合,融合率达到了7.6%。通过测定Hc值以及蛋白酶活力大小,最终筛选出编号为CAW202、CAW205和CAW210的三株融合株,其生长速度快且蛋白酶活力还高于产酶能力较高的亲本菌株CICC2339;三株融合株的蛋白酶活力分别为10450U/g、9730U/g、10780U/g,其中融合株CAW202和CAW210的蛋白酶活力比亲本菌株CICC2339有了显著的增加,分别提高了7.8%和11.25%。     

紫外灭活原生质体融合选育米曲霉新菌株的研究

对米曲霉AS3.951和CICC2339的原生质体进行紫外灭活,然后对灭活双亲用PEG作融合剂进行原生质体融合。从融合子中选出10株生长速度快、菌落直径大的融合株,接种到酪素平板上测其Hc值,并与亲本菌株进行比较。结果发现,10株融合株的Hc值均比生长速度快而产酶量低的亲本菌株AS3.951大,菌株AC211、AC214、AC215、AC217、AC219的Hc值还超过了产酶量高的亲本菌株CICC2339。     

原生质体电融合选育米曲霉新菌株的研究

本实验对米曲霉AS3．951和CICC2339的原生质体进行紫外灭活,然后对灭活双亲用CRY-3型细胞电融合仪进行原生质体电融合。通过筛选得到EF113和EF222两株融合株,其酶活力分别达到了7680U/g和7200U/g,远高于酶活低的亲本菌株AS3．951。     

米曲霉原生质体融合条件的优化研究

选取米曲霉A和米曲霉B作为原始亲本菌株,选用纤维素酶、蜗牛酶混合酶解制备原生质体,采用紫外灭活法对原生质体灭活;对原生质体融合率影响较大的PEG浓度、pH值、融合时间三个因素进行正交试验,结果表明:在PEG浓度为35%,pH值为7.5,融合时间为15 min的条件下,原生质体融合率最高,达到7.06%.     

土曲霉与红曲霉双灭活原生质体融合选育洛伐他汀高产菌株

研究原生质体融合技术选育洛伐他汀高产菌株的方法。土曲霉(Aspergillus terreus)和红曲霉(Monascus anka)用混合酶液(体积分数0.5%溶菌酶,0.3%纤维素酶,0.3%蜗牛酶)分别酶解5.0h和3.5h制备原生质体,土曲霉原生质体和红曲霉原生质体在紫外线(20 W,30cm)下分别照射5min和4min灭活,灭活后混合并用PEG(体积分数30%PEG,0.05mol/LCaCl2,0.05mol/L甘氨酸)介导融合。在187株融合子中筛选得到27株洛伐他汀产量高于红曲霉出发菌株的融合子,其中有7株的洛伐他汀产量是出发菌的2倍以上。双灭活原生质体融合方法成功选育出红曲霉洛伐他汀高产菌株。     

热-紫外灭活双亲原生质体融合选育米曲霉新菌株的研究

对米曲霉（AS3．951）GIM3．13和CICC2339的原生质体分别进行热灭活及紫外灭活,然后对灭活双亲用PEG（6000）作融合剂进行原生质体融合。融合实验最佳PEG（6000）浓度为35％,溶液pH值为7．5,融合率为4．24％。从融合子中选出17株生长速度快、菌落直径大的融合株,接种到酪素平板上测其Hc值,并与亲本菌株进行比较。结果发现,其中8株融合株的Hc值明显比生长速度快而产酶量低的亲本菌株GIM3．13大,菌株16号的Hc值还超过了产酶量高的亲本菌株CICC2339。     

基于基因组改组的米曲霉沪酿3.042多亲株PEG介导融合育种

利用经过分生孢子的原生质体紫外线-氯化锂、NTG复合诱变得到的米曲霉沪酿3.042的8株突变株作为候选株文库,采用基因组改组(genome shuffling),利用原生质体,进行多亲株双灭活PEG介导融合,优化融合条件。以酪蛋白平板初筛,以及固体发酵测定中性蛋白酶酶活复筛,通过2轮融合操作,筛选出6株高产中性蛋白酶的融合株。其中融合菌株FII-41酶活达到7412U/g(干基),比原始出发菌株4212U/g(干基)提高1.76倍,且遗传稳定。     

基于基因组改组的米曲霉沪酿3．042多亲株PEG介导融合育种

利用经过分生孢子的原生质体紫外线-氯化锂、NTG复合诱变得到的米曲霉沪酿3.042的8株突变株作为候选株文库,采用基因组改组(genome shuffling),利用原生质体,进行多亲株双灭活PEG介导融合,优化融合条件.以酪蛋白平板初筛,以及固体发酵测定中性蛋白酶酶活复筛,通过2轮融合操作,筛选出6株高产中性蛋白酶的融合株.其中融合菌株FII-41酶活达到7412U/g(干基),比原始出发菌株4212 U/g(干基)提高1.76倍,且遗传稳定.     

米曲霉GX0015β-果糖基转移酶分离纯化及酶学性质研究

β-果糖基转移酶是由蔗糖生产低聚果糖所必需的酶。从米曲霉GX0015菌株分离纯化β-果糖基转移酶,并对该酶酶学性质进行了研究。     

酸性淀粉酶菌株的诱变选育及酶学性质研究

为了筛选酶活力较高的酸性酶淀粉酶菌株,多次采用紫外(UV)、化学诱变剂硫酸二乙酯(DES),对黑曲霉(ATCC-1602)进行处理,通过淀粉透明圈的大小快速检测出酶活力较高的菌株,再经固态发酵测定酶活,筛选出一株酶活力较高的菌株(ATCC-1694),酶活力为394.1u/g,比原始菌株酶活力提高10倍。该酶最适温度为75℃、最适pH为4.0。在50℃、pH4.0条件下酶活力相当稳定,在酿造工业有良好的应用前景。     

高糖化力白曲霉的复合诱变及固态发酵条件优化

采用紫外线及常压室温等离子体（ARTP）复合诱变技术对白曲霉（Aspergillus candidus）Nz 3.602进行诱变选育。对诱变致死率进行测定,确定最佳诱变条件为：15 W紫外灯照射12 min,ARTP处理40 s。对突变菌株进行透明圈法初筛、糖化力测定法复筛,最终得到产酶能力较高的突变菌株B5。其糖化酶酶活为1 050.32 U/g,较出发菌株糖化酶酶活提高85.53%,并且遗传稳定性较好。以菌株B5为研究对象,经单因素试验和响应面分析法对其固态发酵条件进行优化,最佳固态发酵条件为：糠壳添加量15%,原料含水量70%,接种量12%,培养时间5 d,培养温度30 ℃。该条件下糖化酶酶活为（1 254.17±6.14） U/g,比优化前提高了19.41%。     

酯化红曲霉原生质体制备及紫外线诱变育种

以红色红曲霉（Monascus ruber）为出发菌株,用混合酶制取原生质体并对原生质体形成条件进行探讨,并进行紫外诱变选育。采用50h菌龄的菌丝体,使用蜗牛酶（0.6%）＋溶菌酶（0.4%）＋纤维素酶（0.6%）的复合酶液,30℃酶解2h,在该条件下原生质体浓度可达7.8×106个/mL,再生率为7.3%。在最佳紫外照射时间80s下,突变株经筛选,得到一株酯化酶活显著提高、遗传性能稳定的诱变株HN215-6,其酶活达468.4mg/100mL,比出发菌株HN215提高了1.66倍。     

产β-mannanase内生菌的诱变育种和酶学特性研究

以实验室筛选的产β-甘露聚糖酶的黄豆内生菌Bacillus subtilis HD-1(54.6 U/mL)为出发菌株,分别采用紫外线,硫酸二乙酯,紫外线-光复活和紫外线-硫酸二乙酯对其进行诱变,结果表明,以紫外线-硫酸二乙酯复合诱变效果最好,获得一株高产β-甘露聚糖酶的突变菌株Bacillus subtilis UD-20,酶活达89.5 U/mL,比出发菌株提高了63.9%,遗传性能稳定。该β-甘露聚糖酶的最适反应温度和pH分别为50℃和7.0,该酶在50℃以下,pH 5.0~8.0之间稳定性较好,属于中性酶。亚铁离子和钴离子对酶有较强的激活作用,相对酶活分别提高了13.2%和31.7%,但锰离子对酶有强烈的抑制作用,相对酶活仅有对照组的55.6%;金属离子钾、钙、钴和钡都能增强酶热稳定性,其中钴离子的增强效果最为明显,残余酶活约是对照组的1.5倍。     

几丁质脱乙酰酶高产菌株的选育及其发酵特性研究

以一株海洋丝状真菌（Penicillium janthinellum）UV-0S为出发菌株,通过多级紫外线诱变育种后获得几丁质脱乙酰酶（CDA） 高产突变株UV-3S,并对该菌株产CDA的发酵特性及其细胞壁几丁质的脱乙酰度（DD）进行研究。 结果表明,突变株UV-3S的胞外 CDA酶活力为11.05 U/mL,是出发菌株UV-0S的2.1倍。 该菌株产胞外CDA的最适初始pH值为9.0,最适无机盐为NaH2PO（4 11 mmol/L）, 胶体几丁质最适添加量为0.5%。 在此最佳发酵条件下,突变株UV-3S的CDA酶活力最高,为11.83 U/mL,说明CDA是一种诱导酶。 细 胞壁几丁质的脱乙酰度随真菌生长而增加,且在发酵96 h后脱乙酰度达到最高（90.52%）。     

高产蛋白酶和淀粉酶米曲霉菌株的选育

从J2、M2和Q2三株米曲霉菌中选择出总酶活力最高的J2作为出发菌株,通过紫外诱变后,得到突变菌株Y3,其酸性蛋白酶活力由出发菌株的313 U/g提高至986 U/g,提高了215％,碱性蛋白酶活力由出发菌株的6936 U/g提高至10385 U/g,提高了49.7％,中性蛋白酶活力由出发菌株的5675 U/g提高至9034 U/g,提高了59.2％,且淀粉酶活力也由出发菌株的284 U/g提高至412U/g,提高了45.1％.经传代实验表明,突变菌株Y3的遗传特性稳定.     

紫外线诱变选育酸性α-淀粉酶菌株

为了提高菌株产酶能力,研究了紫外线处理对枯草芽孢杆菌BF7658产酸性α-淀粉酶的影响。结果表明：采用30W紫外线照射90s获得较好的突变效果,利用变色圈法初筛结合摇瓶发酵复筛,筛选得到一株理想的突变株UV-12,其酶活为3418．8U／mL,比出发菌株提高了59．7％。对UV-12进行紫外线二次诱变,酶活提高不显著,表现出一定“抗性”。     

紫外-亚硝酸钠复合诱变高产纤维素酶菌株

为得到高产纤维素酶的菌株,改善菌种产纤维素酶的能力,该研究以贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）为原始菌株,以纤维素酶酶活为考察指标,通过单因素和正交试验优化复合诱变条件。结果表明,最优复合诱变条件为紫外（UV）处理150 s、0.25 mol/L亚硝酸钠（NaNO2）在诱变温度23 ℃下诱变处理23 min。在此优化复合诱变条件下,突变株UN-5纤维素酶酶活为101.48 U/mL,比原始菌株的酶活提高了205.8%。经10代传代,纤维素酶酶活仍有100.5 U/mL,说明该突变株产纤维素酶能力强且遗传性状稳定。     

蜡样芽孢杆菌胶原蛋白酶基因的异源表达与活性分析

研究采用降解骨胶原蛋白的蜡样芽孢杆菌MBL13-U作为原菌种,并对蜡样芽孢杆菌MBL13-U进行全基因组测序,克隆获得胶原蛋白酶(ColM13)基因。将目的基因与大肠杆菌的表达载体pET30a进行连接,转入大肠杆菌宿主菌株BL21,获得降解骨胶原蛋白的工程菌pET30a-ColM13/BL21。通过SDS-PAGE测定异源表达的重组蛋白酶ColM13的分子质量,并测定不同诱导时间和诱导浓度对ColM13酶活性的影响,最终确定重组蛋白酶ColM13的酶活最适条件:6‰异丙基硫代半乳糖苷(IPTG,100 mmol/L),37℃诱导6 h,优化后酶活力最高为64.99 U/mL,较优化前提高4.24倍。通过水解圈试验、紫外光谱和扫描电子显微镜等方式验证,表明工程菌构建成功,这为我国畜禽骨骼资源的深度开发和综合利用提供了新的研究思路。     

产果糖基转移酶米曲霉菌株的选育

通过紫外线、紫外线和氯化锂复合、微波、微波和氯化锂复合4种诱变方法，对米曲霉GX-0010菌株进行了诱变，选育得到果糖基转移酶酶活高于GX-0010菌株的突变株8株，其中UVLi-3突变株的酶活最高，比GX-0010菌株高45．4％。