大肠杆菌ATCase抗反馈抑制突变体的构建及其对胞苷积累的影响

为解决胞苷生物合成途径中天冬氨酸氨甲酰转移酶受胞苷三磷酸反馈抑制调节的问题,通过对其碱基序列和蛋白质结构分析,利用基因定点突变的方法构建了大肠杆菌的ATCase突变酶,得到三个突变体：M1（H20L）、M2（K60E）、M3（K94E）,并在E.coli DH5α中对融合蛋白进行了表达．酶活测定表明,M1、M2、M3的ATCase酶相对活性都比野生型M0的高,分别为野生型M0的1．10、1．22和1．37倍,且比活力都有不同程度提高．与含野生型pyrBl基因的M0相比,含突变型基因的M1、M2和M3均对15mmol／L的CTP具有强的抗反馈抑制作用,且M1、M2和M3的抗CTP反馈抑制作用分别是M0的5．4、6．0和8．5倍．最后将各突变质粒转入到E．coli Cytl0（Acdd）中进行发酵培养,结果表明,与未含突变基因菌株相比,各含突变基因菌株的胞苷积累量均有不同程度的提高,说明ATCase定点突变使胞苷的合成积累途径得到了不同程度的强化．     

4,6-二氯嘧啶的合成工艺研究

以甲酰胺、丙二酸二甲酯为原料首先合成4,6-二羟基嘧啶,收率为59.73%,然后与POCl3反应合成目标化合物.以反应温度、反应时间及POCl3的用量作为考察因素进行正交实验,用这3个指标评定工艺的优劣.由正交实验得到最佳合成工艺条件为:反应温度75℃,反应时间3 h,n(4,6-二羟基嘧啶):n(POCl3)=1:6,收率为72.52%.2步反应总收率为43.31%,产物经红外光谱鉴定,结构正确.     

利用啤酒酵母生物合成胞苷三磷酸的研究

研究了利用游离的啤酒酵母将胞苷一磷酸(CMP)合成为胞苷三磷酸(CTP)，采用HPLC法分析反应过程中各工艺参数对转化率的影响并对其主要因素进行了正交优化。结果表明，在25g酵母量中加入20mL底物溶液，其中包括CMP 60mmol／L、葡萄糖150mmol／L、磷酸盐缓冲液(钠盐)250mmol／L、氯化镁8mmol／L、pH为6．0，温度35℃、反应时间2．0h，在此反应体系下，通过添加适量ATP、吐温，CTP的转化率可维持在80％以上。     

鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶的紫外吸收谱研究

利用紫外光度法对构成核酸的鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)的紫外吸收谱进行了研究.通过对含四种碱基的磷酸盐缓冲溶液(pH=7)分别进行分析,发现G在240～280nm范围内有两个紫外吸收峰,分别位于244nm和274nm处;而A、C和T的吸收峰值则较为接近.分别位于258nm、264nm和266nm处.对A、C和T分组混合或共混后进行测试,发现当峰值出现在260nm时,溶液中至少存在A和C.当峰值位于258nm处时.溶液中存在A或T.在300～1100nm范围内未发现该四种碱基的吸收峰.     

2-氨基-4,6-二甲氧基嘧啶的合成研究

以丙二酸二乙酯和硝酸胍为原料,在醇钠的碱性体系中发生亲核加成-消去反应(环化)首先合成了2-氨基-4,6-二羟基嘧啶;然后经氯化和烷氧基化反应合成了2-氨基-4,6-二甲氧基嘧啶。采用单因素法探索了反应时间、pH值和催化剂等因素对产物收率的影响,优化了反应条件,达到节省能源、降低成本和简化操作的效果,有利于大规模的工业化生产。     

淫羊藿苷糖苷酶产生菌的筛选及其酶反应条件

从6株微生物菌株中筛选出了高产淫羊藿苷糖苷酶的菌株Absidasp.E9r,该菌所产淫羊藿苷糖苷酶能将多糖基的淫羊藿苷水解成低糖基的淫羊藿苷。通过实验确定了该淫羊藿苷糖苷酶的最适反应条件:pH值4.0,反应温度50℃,底物质量浓度20 mg/mL,反应时间20 h。     

农药中间体2-乙氧基-4,6-二氟嘧啶的合成研究

主要研究了2-乙氧基-4,6-二羟基嘧啶的改进合成路线。用含有HCl的乙醇与单氰胺反应合成氧乙基异脲盐酸盐（简称异脲盐）,异脲盐脱HCl后与丙二酸二乙酯反应制得2-乙氧基-4,6-二羟基嘧啶（简称嘧啶醇）。嘧啶醇的反应温度必须维持在-10℃以下,试验完全要求在隔绝空气的条件下进行;本中间体对合成高效、低毒、低残留农药氯酯磺草胺具有重要作用。     

假单胞菌Ⅷ T 39壳聚糖酶的纯化和性质研究

粗酶液经硫酸铵盐析、透析、脱盐、SephadexG-100柱层析,假单胞菌ⅧT39壳聚糖酶被纯化了19.72倍,SDS-PAGE鉴定为一条带.试验表明,该酶为内切型水解酶,无CMCase活性,最适pH5.6～6.0,最适作用温度60～70℃,纯酶作用于可溶性壳聚糖的米氏常数为1.67mg/mL,最大反应速度为2.56μmol/mL.min.SDS-PAGE测定的相对分子质量为51.3×103.Mn2+、AL2+、Co2+对该酶有激活作用,Ag+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+对酶有强烈抑制作用.     

集胞藻ApcA和CpcA的体内生物重组研究

利用聚合酶链式反应(PCR)克隆出集胞藻Synechocystis sp.PCC 6803变藻蓝蛋白和藻蓝蛋白α亚基的编码基因apcA和cpcA,将脱辅基蛋白ApcA、CpcA分别与裂合酶CpeS1或CpcE/F以及血红素氧化酶HO1、胆绿素还原酶PcyA在大肠杆菌中共同表达。研究表明:通过大肠杆菌体内重组可以获得具有光学活性的重组色素蛋白PCB-ApcA和PCB-CpcA。吸收光谱、荧光光谱以及锌电泳均表明,藻蓝胆素与脱辅基蛋白形成了正确的共价连接。由此可知,利用大肠杆菌进行集胞藻藻蓝蛋白和变藻蓝蛋白α亚基的体内生物合成是可实现的。同时还对重组色素蛋白的摩尔消光系数和荧光量子产率进行了计算。     

基于神经网络和元胞自动机的滑坡运动过程模拟研究

集成GIS、元胞自动机和神经网络模型对滑坡滑动路径和范围进行模拟研究。采用神经网络模型挖掘出滑坡滑动规律,获取滑坡元胞转换规则,再耦合元胞自动机对滑坡进行模拟。首先确定滑坡关键影响因子,之后利用GIS空间分析能力,结合高精度DEM数据生成地形变量如坡度、坡向、曲率、地形湿度指数等,然后结合BPNN和CA构建滑坡预测模型,最后利用BPNN-CA模型对杉树槽滑坡进行实例分析和模拟,模拟精度较为理想。提出的模型能够为滑坡综合防治和管理提供科学依据,同时也为滑坡的综合研究提供新的视角。     

大肠杆菌L-组氨酸生物合成途径的改造及其对工程菌L-组氨酸产量的影响

改造大肠杆菌L-组氨酸生物合成途径,以提高L-组氨酸的产量．用NTG诱变大肠杆菌M-17（SG^r）,依次赋予其2噻唑丙氨酸（2-TA）和组氨酸氧肟酸盐（HisHx）遗传标记,再以突变株M-18（SG^r＋2-TA^r＋HisHx^r）基因组为模板,扩增组氨酸操纵子基因,构建出重组质粒pUC118-his—operon,将重组质粒导入突变株M—18（SG^r＋2-TA^r＋HisHx^r）得到工程菌Ecoli M-19（SG^r＋2．TA^r＋HisHx^r／pUC118-his—operon）．根据硝和prs基因序列分别合成引物进行PCR扩增,PCR产物与载体pSTV28连接,构建重组质粒pSTV28-zwf、pSTV28-prs和pSTV28-zwf-prs,将重组质粒分别转化至工程菌E．coli MZH-19,摇瓶发酵测定重组工程菌L-组氨酸的产量．摇瓶发酵结果显示,L-组氨酸产量与对照株相比,工程菌E．coli M-19提高了4．5倍,双质粒系统重组工程菌E．coli MZH-19、Ecoli MPH-19和E．coil MZPH-19分别提高了5．14、5．78、8．43倍．     

不同方法转化大肠杆菌和农杆菌转化效率的研究

将pBI121质粒采用冻融法和热激法转化大肠杆菌,用冻融法转化农杆菌。经Gus染色和电泳检测,获得了含有pBI121质粒大肠杆菌的DH5α和JM109菌株,以及农杆菌EHA105和LBA4404菌株,同时探讨了影响大肠杆菌和农杆菌转化效率的主要因素。结果表明,大肠杆菌感受态细胞在4℃保存18 h时转化效率较高,用甘油低温冻存的感受态细胞20 d具有感受性,但转化效率较低。农杆菌OD6000.45～0.65时转化效率较高。