大肠杆菌ATCase抗反馈抑制突变体的构建及其对胞苷积累的影响

为解决胞苷生物合成途径中天冬氨酸氨甲酰转移酶受胞苷三磷酸反馈抑制调节的问题,通过对其碱基序列和蛋白质结构分析,利用基因定点突变的方法构建了大肠杆菌的ATCase突变酶,得到三个突变体：M1（H20L）、M2（K60E）、M3（K94E）,并在E.coli DH5α中对融合蛋白进行了表达．酶活测定表明,M1、M2、M3的ATCase酶相对活性都比野生型M0的高,分别为野生型M0的1．10、1．22和1．37倍,且比活力都有不同程度提高．与含野生型pyrBl基因的M0相比,含突变型基因的M1、M2和M3均对15mmol／L的CTP具有强的抗反馈抑制作用,且M1、M2和M3的抗CTP反馈抑制作用分别是M0的5．4、6．0和8．5倍．最后将各突变质粒转入到E．coli Cytl0（Acdd）中进行发酵培养,结果表明,与未含突变基因菌株相比,各含突变基因菌株的胞苷积累量均有不同程度的提高,说明ATCase定点突变使胞苷的合成积累途径得到了不同程度的强化．     

大肠杆菌L-组氨酸生物合成途径的改造及其对工程菌L-组氨酸产量的影响

改造大肠杆菌L-组氨酸生物合成途径,以提高L-组氨酸的产量．用NTG诱变大肠杆菌M-17（SG^r）,依次赋予其2噻唑丙氨酸（2-TA）和组氨酸氧肟酸盐（HisHx）遗传标记,再以突变株M-18（SG^r＋2-TA^r＋HisHx^r）基因组为模板,扩增组氨酸操纵子基因,构建出重组质粒pUC118-his—operon,将重组质粒导入突变株M—18（SG^r＋2-TA^r＋HisHx^r）得到工程菌Ecoli M-19（SG^r＋2．TA^r＋HisHx^r／pUC118-his—operon）．根据硝和prs基因序列分别合成引物进行PCR扩增,PCR产物与载体pSTV28连接,构建重组质粒pSTV28-zwf、pSTV28-prs和pSTV28-zwf-prs,将重组质粒分别转化至工程菌E．coli MZH-19,摇瓶发酵测定重组工程菌L-组氨酸的产量．摇瓶发酵结果显示,L-组氨酸产量与对照株相比,工程菌E．coli M-19提高了4．5倍,双质粒系统重组工程菌E．coli MZH-19、Ecoli MPH-19和E．coil MZPH-19分别提高了5．14、5．78、8．43倍．     

纤维素酶E_5基因在E.coli中的克隆与表达

将含纤维素酶 E5基因的质粒 p D5 4 1用 Nco I和 Eco R I双酶切后 ,经电泳分离获取含 E5基因的小片段 ,将该片段定向插入表达质粒 p SE4 2 0的多克隆位点上 ,进一步将重组 DNA转入大肠杆菌宿主 .采用刚果红染色法检测出选择性平板上的转化子具有羧甲基纤维素酶 (CMCase)活性 .摇瓶产酶试验进一步表明 ,基因重组后的大肠杆菌能高效表达 E5基因并将产物分泌出胞外 ,培养液中可检测到的CMCase活力达 31.6 U/ m L .该研究结果为进一步构建高效纤维素分解菌株打下了良好的基础 ,具有重要的学术意义和实际应用价值 .     

TRAIL 胞外区编码基因的设计、人工合成及其表达

根据大肠杆菌密码子偏爱性要求, 设计编码TRAIL 胞外段(114 ～ 281 氨基酸)的DNA 序 列, 分段合成拼接引物并连接, 得到目的基因, PCR 扩增后克隆于T 载体中, 经测序证实后, PCR 法在目的基因的5′, 末端引入肠激酶识别位点EKsite 的编码序列, 重组于胞内融合表达型T 载体 中, 构建成pDsbA-6Hi s-EKsi te-TRAI L 胞内融合表达质粒, 重组质粒转化表达宿主E .coli BL21 (DE3).在33 ℃条件下, 添加终浓度为0 .4 mmol/L 的IPTG 诱导表达, 全菌SDS-PAGE 分析结果 表明:所构建的工程菌能表达44 kD 左右的TRAI L 融合蛋白, 与理论值相符.     

纤维素酶E5基因在E．coli中的克隆与表达

将含纤维素酶E5基因的质粒pD541用Nco Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后,经电泳分离获取含E5基因的小片段,将该片段定向插入表达质粒pSE420的多克隆位点上,进一步将重组DNA转人大肠杆菌宿主．采用刚果红染色法检测出选择性平板上的转化子具有羧甲基纤维素酶(CMCase)活性．摇瓶产酶试验进一步表明,基因重组后的大肠杆菌能高效表达E5基因并将产物分泌出胞外,培养液中可检测到的CM-Case活力达31．6U／mL．该研究结果为进一步构建高效纤维素分解菌株打下了良好的基础,具有重要的学术意义和实际应用价值．     

耐热β-半乳糖苷酶基因bgαB在枯草芽孢杆菌中的整合表达

来源于嗜热脂肪芽胞杆菌Bacillus stearothermophilus的耐热β-半乳糖苷酶基因bgαB被克隆到大肠杆菌—枯草芽胞杆菌穿梭质粒pMA5中，然后将外源基因及其表达调控序列亚克隆到枯草芽胞杆菌整合栽体pSAS144中，转化Bacillus subtilis受体菌BD170，在5μg／mL的氯霉素抗性平板上筛选抗性转化子，经摇瓶发酵后，得到耐热乳糖酶的比酶活为0．32U／mg，是出发菌株比酶活的2倍。     

蜡样芽胞杆菌深圳株754-1 PLC基因的克隆及表达

以本实验室分离筛选的高产PLC的蜡样芽胞杆菌深圳株754—1为供体菌，以大肠杆菌DH5仅和BL21（DE3）为受体菌，构建高效表达胞内PLC的工程菌。以754-1菌基因组为模板。经PCR扩增，将得到的PLC基因连接到T载体上，转入大肠杆菌DH5仅。经Amp抗性筛选的阳性克隆子提取重组质粒，双酶切，回收含PLC基因的片段并将其克隆到pGEX-KG载体，获得重组质粒pGEX-KG-PLM，该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）。用IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析，在分子量为38kd处有一条明显的表达带。     

利用5-氨基乙酰丙酸脱水酶缺失的重组大肠杆菌合成5-氨基乙酰丙酸

生物法合成5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）大多通过添加5-ALA脱水酶（ALAD）的抑制剂乙酰丙酸（LA）减少5-ALA的降解,造成生产成本增高,发酵工艺复杂．本文利用ALAD缺失的大肠杆菌ZSEc2作为出发菌株,通过紫外诱变的方法,获得可利用外源血红素恢复正常生长的大肠杆菌突变株ZGEcl,并过表达来自沼泽红假单胞菌的5-ALA合成酶（ALAS）基因,最终建立一条不需要添加ALAD抑制剂的5-ALA的生物合成新路线．经过培养基初步优化,重组菌可在胞外积累约1g／L的5-ALA．     

提高碱性磷酸酶在E.coli胞内表达的可溶性及活性

以E.coli DH5a基因组为模板PCR扩增得到无信号肽的碱性磷酸酶基因片段,与胞内融合表达型T栽体连接得到重组质粒,转化表达宿主E.coli BL21(DE3)和E.coli origami(DE3),经0.1 mM IPTG诱导表达,超声破碎细胞后,SDS-PAGE分析可溶性,融合蛋白在E.coli origami(DE3)中的可溶蛋白含量比E.coli BL21(DE3)中高.融合蛋白的可溶部分经Ni2+螯合亲和纯化,纯化后E.coli origami(DE3)中蛋白活性比E.coli BL21(DE3)中明显提高,达到1 614.3U/mg蛋白.     

大肠杆菌中乙醇合成途径的构建

采用PCR技术扩增了运动发酵单孢菌Zymomonas mobilis的两个产乙醇的关键酶基因pdc和adhⅡ，分别克隆到载体pUC19和pUC18中，形成重组质粒pUC19::pdc和pUC18:adh，从中分离出两基因并串联到经Eco RI酶切的pUC18中，转化大肠杆菌E.coli DH5a获得重组质粒pPA。携带pPA的重组菌Pp a被证明具有丙酮酸脱羧酶酶活且提高了乙醇脱氢酶酶活。通过代谢工程在Escerichia coli中成功地构建了乙醇合成途径。     

过量表达苏氨酸脱水酶对谷氨酸棒杆菌合成L–异亮氨酸的影响

考察过量表达解除反馈抑制的苏氨酸脱水酶对谷氨酸棒杆菌发酵生产L-异亮氨酸的影响.将解除反馈抑制的苏氨酸脱水酶基因ilvA（F383V）连接大肠杆菌/谷氨酸棒杆菌穿梭质粒pXMJ19,过量表达于L-异亮氨酸生产菌株Corynebacterium glutamicum YILW.经5 L发酵罐分批补料发酵产酸实验,与出发菌株C.glutamicum YILW相比,耗糖高峰期滞后,L-异亮氨酸产量增加了10.3%,副产物L-蛋氨酸、L-赖氨酸含量分别降低了33.3%2、6.5%,发酵液中没有L-苏氨酸的累积,乳酸的累积量增加了41.7%.对发酵稳定期的代谢流分布研究表明,过量表达解除反馈抑制的苏氨酸脱水酶使HMP途径流量增加了31.7%,L-异亮氨酸生物合成途径的代谢流提高了8.5%.     

嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶基因定向进化研究

为得到具有催化活性的重组亚油酸异构酶,对嗜酸乳杆菌AS1.1854菌株亚油酸异构酶基因进行体外定向进化.经过两轮连续易错PCR扩增及一轮DNA改组获得了突变基因片段,并克隆到pET30a质粒载体上,转化大肠杆菌,构建了该酶的基因突变文库.经IPTG诱导表达后筛选出一株重组菌,可表达可溶性重组酶蛋白,经紫外分光光度计法测定,重组酶蛋白活力为8.2 U.     

大肠杆菌DH12S菌株高效电击转化条件的探讨(英文)

探讨了电击转化法介导质粒DNA转化到大肠杆菌DH12S的最佳条件,以提高其转化效率．将pUC19质粒转化大肠杆菌DH12S菌株,观察不同的电击转化条件对转化效率的影响．结果表明,电击缓冲液的离子强度、细菌生长状态、感受态细胞保存时间及质粒DNA浓度对转化效率均有不同程度的影响;在电压2．5kV,电阻200Ω,电容25μF,脉冲时间4．3ms和低离子强度电击缓冲液的条件下能获得较高的电击转化率,证明该优化电击转化条件能提高转化效率．     

家蚕新基因Bmbzj的表达、抗体制备及亚细胞定位

在自建的家蚕蛹cDNA文库中发现了一条新基因序列,GenBank登录号为DY231426.该基因是一个同源性很低的基因,未发现保守结构域,将其命名为Bmbzj.Bmbzj基因全长661bp,由99 bp的5'端非翻译区序列(5'UTR)、486 bp的开放读码框(ORF)和76 bp的3'端非翻译区序列(3'UTR)组成.生物信息学分析结果表明蛋白Bmbzj可能存在跨膜区和信号肽.将该基因插入到载体pGEX-4T-3中,构建了该基因编码的重组质粒pGEX-4T-3-Bmbzj,转化大肠杆菌Rosetta后,IPTG诱导表达了该融合蛋白,并利用亲和层析的方法纯化该重组蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体.亚细胞定位实验结果表明该蛋白只存在于细胞质中.     

人瘦素基因在毕赤酵母中的分泌表达

将人瘦素成熟蛋白编码序列同义突变成毕赤酵母偏好密码子,人工合成全基因序列。将基因直接连接到pPIC9载体信号肽识别序列之后,构建毕赤酵母真核表达载体pPIC9-hLeptin,电转化毕赤酵母菌株GS115,用PCR法筛选阳性克隆,SDS-PAGE和Western blotting方法筛选能够稳定、高效分泌表达目的蛋白的酵母工程菌。结果表明,成功构建了重组人瘦素毕赤酵母工程菌株,能稳定、高效分泌表达重组人瘦素蛋白,表达量高峰出现在诱导96h后,摇瓶表达量为200mg.L-1。     

大豆LEA蛋白Em的表达可提高大肠杆菌和烟草耐盐性

将大豆Em（LEA1）基因构建到原核表达载体pET28-Em中．转化大肠杆菌，经SDS—PAGE电泳及电喷雾质谱鉴定．结果显示，经IPTG诱导的重组菌可表达约18kDa的特异蛋白．这种蛋白具有良好的可溶性和热稳定性．在含800m mol／L NaCl培养基中，含空载体的对照菌生长迟滞期约为50h，含Em基因的重组菌生长迟滞期为32h，表明大豆Em蛋白的表达可提高大肠杆菌对盐胁迫的适应能力及耐盐性．在此基础上，构建了含Em基因的真核表达载体pBI—Em．再利用根癌农杆菌介导法将该基因转入烟草．PCR及RT-PCR结果显示，大豆Em基因已整合到转基因烟草的基因组DNA中，并能正常转录．转化率为53％．转Em基因烟草植株在含有质量分数1．5％NaCl的培养基中生长状况好于对照植株，叶片的叶绿素含量高于对照植株的叶片．结果表明，大豆Em基因的表达可提高大肠杆菌和转基因烟草的耐盐性．     

中国明对虾溶菌酶点突变基因的原核表达

为解决中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)溶菌酶成熟肽(FcLys)可溶性问题,构建了点突变基因的原核表达质粒,并进行重组表达。以已构建的带有FcLys目的基因的重组克隆质粒为模板扩增FcLys点突变(FcLysM)的基因片段,将该对虾溶菌酶成熟肽序列的N端和C端中含有几个疏水性氨基酸经点突变改为亲水性氨基酸,但不改变其活性中心和二硫键的形成。将FcLysM的基因片段与表达载体连接并转化,制得基因工程菌pET-39b(+)-FcLysM/Rosetta(DE3)。通过基因测序方法验证该重组表达质粒读码框的准确性以及FcLysM目的基因序列的正确性。该工程菌表达后在SDS-PAGE结果显示,表达产物为分子质量约为43ku的融合蛋白FcLysM。进一步研究分析证明,该重组点突变蛋白的可溶性表达量高于非突变的对虾溶菌酶表达量。