用硅橡胶膜生物反应器系统选育高性能酿酒酵母

应用硅橡胶膜生物反应器的发酵-渗透汽化耦合功能,进行长期封闭循环发酵,使酵母在这种特定环境下完成适应性自然进化,从而获得优势的突变株。以工业安琪酵母ADY为原始菌株,进行每一轮500h的封闭循环发酵,在发酵终点取菌悬液做平板筛菌,分离出遗传约200代的相对强势的新菌株,再转移新菌株进行同样的发酵和终点筛选实验。如此的发酵-筛选-转移实验共进行了3轮。试验结果表明:ADY遗传超过600代的菌株S33,在500h封闭循环发酵残液配制的培养基条件下,表现出了明显的环境适应性遗传优势,其细胞生长速率、产物乙醇的比生成速率和糖转化率都相对原种菌ADY分别提高了约71.8%、53.6%和52.7%。     

膜生物反应器封闭循环发酵系统对野生酵母的驯化

自然界中选育的野生酵母菌S3在PDMS膜生物反应器长期封闭循环系统中进行驯化,在经过3轮连续的封闭循环发酵适应性驯化实验后,对第四轮实验和第一轮实验的酵母发酵性能进行比较,分析野生酵母的适应性进化行为,乙醇-细胞平均比产率、葡萄糖转化率分别提高42.6%、2.1%,细胞平均死亡率减少11.04%;与商用的安琪酵母（ADY）相比,发酵性能也更优秀。结果表明在膜生物反应器封闭循环发酵系统中可以使野生酵母菌得到驯化。      

膜生物反应器封闭循环发酵系统对野生酵母的驯化

自然界中选育的野生酵母菌S3在PDMS膜生物反应器长期封闭循环系统中进行驯化,在经过3轮连续的封闭循环发酵适应性驯化实验后,对第四轮实验和第一轮实验的酵母发酵性能进行比较,分析野生酵母的适应性进化行为,乙醇-细胞平均比产率、葡萄糖转化率分别提高42.6%、2.1%,细胞平均死亡率减少11.04%;与商用的安琪酵母(ADY)相比,发酵性能也更优秀。结果表明在膜生物反应器封闭循环发酵系统中可以使野生酵母菌得到驯化。     

利用硅橡胶膜生物反应器适应性进化培育耐持久力酵母菌株

酵母是影响乙醇发酵的关键因素之一。本实验设计了一种通过适应性进化改进酵母菌株性能的方法:将工业酵母菌株接种到硅橡胶膜生物反应器中进行长期封闭循环连续发酵,通过递进转移的方式进行适应性培养并筛选出优势酵母菌株。硅橡胶膜渗透汽化同步分离乙醇使发酵过程长期连续运行,发酵代谢产物中多种非透过性物质连续累积,发酵液不断恶化的环境为酵母适应性进化提供了选择压力。通过实验发现,从每轮500 h连续发酵终止时分离繁衍约200代的菌株,在残液培养基中具有更高的生长速率和乙醇产率,表现出明显的适应性进化特征。研究表明,采用这种方法选育的酵母菌株,延长封闭循环发酵的时间并维持较高的乙醇得率是可行的,对推进封闭循环乙醇发酵生产工艺的发展有利。     

膜生物反应器用于乙醇连续发酵菌株的适应性培养

将一种耐高温酿酒干酵母在体积为5L、膜而积为0.08m2的硅橡胶膜生物反应器乙醇连续发酵系统中进行适应性培养,选育出适应该环境的优势菌种.三轮乙醇连续发酵实验的结果表明,糖的转化率差别不大,但单位酵母细胞代谢产生乙醇的能力有了提高,说明酵母细胞在长期封闭循环发酵环境条件下,原种菌经过几百代繁殖后其后代遗传特征发生了改变,能逐渐适应所处的不利环境.表明通过膜生物反应器长期封闭循环发酵对酵母细胞进行适应性培养,可以获得具有某种遗传优势的新菌株.     

PDMS膜生物反应器中ABE发酵的实验研究

采用PDMS膜生物反应器和丙酮丁醇梭菌进行了丙酮-丁醇-乙醇(ABE)发酵实验研究.进行了2轮封闭循环连续发酵实验,发酵时间分别为264h和300h.2轮实验的发酵-膜分离耦合操作模式有区别:第1轮实验仅在白天(每天8:00～20:00)运行膜渗透汽化同步分离提取ABE产物(间断耦合);第2轮实验则在前192 h发酵阶段全程运行膜同步分离(连续耦合),之后采用和第1轮相同的间断耦合发酵模式.结果表明,第2轮发酵细胞的生长状况和发酵能力好于第1轮;2轮实验发酵液平均浓度分别为1.781g/L和1.884g/L;第2轮实验丁醇体积产率、得率系数、丁醇总产量分别比第1轮提高了95.2％、14.2％、121.2％.对发酵动力学行为进行了初步分析.     

无醇啤酒酵母菌株HD34-1的生产性实验

从构建的乙醇脱氢酶(ADH)工程菌株中筛选到ADH活性最强的菌株HD34-1,以其为发酵菌株进行1吨发酵罐发酵实验,经过生产性发酵实验与理化指标的测定,证明HD34-1菌株的发酵酒精度低于1%(W/W),满足无醇啤酒的要求,并确定了该菌株啤酒发酵的发酵条件为1吨发酵罐密闭发酵,温度选择11℃,接种量为2%,糖度降为5%时终止发酵,降温至4℃封存。     

甘南传统牦牛酸奶来源抗氧化性乳酸发酵菌株的筛选

为寻找甘南传统牦牛酸奶中具有优良发酵与抗氧化性能的乳酸菌,对分离纯化的菌株以H_2O_2耐受力、耐酸、耐胆盐和凝乳发酵性进行初步筛选,再以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、羟基(·OH)自由基和超氧阴离子(O_2~-·)的清除率筛选抗氧化能力强的菌株。结果表明,所筛选出的6株乳酸菌中,菌株M5的发酵性能与抗氧化活性最强,生理生化及分子生物学特征鉴定结果为副干酪乳杆菌。该菌株凝乳发酵时间为6. 2 h;上清液对DPPH和羟自由基清除率分别为47. 8%和54. 4%;无细胞提取物对超氧阴离子的清除率为49. 9%。酵母存活细胞模型验证,其无细胞提取物、发酵上清液、完整细胞对酿酒酵母的存活率分别提高了95. 3%、130%和28. 5%。试验所筛选出的副干酪乳杆菌M5的发酵及抗氧化能力强,具有进一步开发利用价值。     

低产高级醇酿酒酵母菌株筛选及其单倍体制备

通过比较7株酿酒酵母菌株的发酵性能和高级醇生成量,筛选出发酵周期短、发酵速度快、酒精度最高和总高级醇含量较低的菌株AY-15.以AY-15为出发菌株制作单倍体,经过杜氏管发酵实验和酒精浓醪发酵实验,最终获得a-8和α-22 2株单倍体菌株,其发酵性能与AY-15基本相当,酒精度分别为15.6 %vol和15.5 %vol;高级醇含量均比AY-15高级醇生成量低,分别为302.268 mg/L和298.446 mg/L.a-8和α-22可为后续分子育种降低高级醇生成量奠定良好基础.     

耐高温酒精酵母诱变育种研究

以嗜鞣管囊酵母P-01为出发菌株,经亚硝基胍诱变处理,采用TIC筛选平板初筛,杜氏管发酵二级筛选和混合糖发酵三级筛选,得到3株38℃发酵温度时的乙醇高产菌株P-01-33、P-01-70和P-01-190,其乙醇产率为12.9g/L、12.1g/L和13.3g/L,分别比出发菌株P-01的乙醇产率(9.5g/L)提高35.80%、27.47%、30.81%.     

双轮底发酵酒醅加曲试验总结

在白酒发酵双轮底工艺中。对双轮底发酵酒醅进行加曲与不加曲试验,共进行了两轮试验,每轮试验中挑选四个窖池,两个试验窖两个对照窖。通过试验证实：西凤调味酒生产采用双轮底发酵有利于提高酒的质量。双轮底酒醅宜添加大曲继续发酵为好。     

超长发酵周期对特香型基础酒风味成分影响的研究

研究超长发酵周期对窖池不同糟醅层特香型基础酒总酸含量、总酯含量、风味骨架成分含量及感官风味特征等的影响。结果表明,连续超长发酵周期对特香型基础酒产量有较大影响,第1轮试验组与对照组窖池出酒率无明显差异,第2轮试验窖池出酒率比对照窖池低65.7%。两轮中丢糟总酸含量均为最高,第2轮丢糟总酸含量是第1轮丢糟的1.56倍;两轮中踩糟和丢糟总酯含量均为最高,第2轮踩糟和丢糟总酯含量分别是第1轮的1.29倍和1.26倍;两轮基酒中丢糟中异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、己酸、乙酸等酸类物质含量显著高于原料糟、踩糟及对照（P＜0.05）;两轮基酒中踩糟和丢糟大部分酯类、醇类及醛类物质含量较高,与对照差异显著（P＜0.05）。感官方面,丢糟和踩糟样品糟味和窖泥味较重;原料糟和对照样品则较为干净,口感更加协调。     

茅台镇酱香型白酒不同生产轮次酿造环境的细菌菌群结构特征

基于高通量测序技术并结合数理统计分析,系统地对2018年度茅台镇主酿区酱香白酒1～7生产轮次的酿造环境中细菌菌群结构组成及多样性、差异性进行研究。结果表明,在1～7生产轮次酿造环境中的细菌菌群多样性丰富度高,且各轮次间存在差异,但优势菌门、优势菌属的菌群结构在组成上具有相似性,其主要优势菌群结构较稳定;从酿造环境样品中共检出19 个细菌门,396 个细菌属。优势细菌门为Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes和Actinobacteria。Sphingobacterium、Enterobacter、Pantoea、Pseudomonas、Escherichia-Shigella和Staphylococcus等14 个属为优势细菌属。结合偏最小二乘法判别分析（partial least squares discriminant analysis,PLS-DA）和Adonis、PERMANOVA等分析,1～7轮次酿造环境的细菌菌群结构在门水平上无显著性差异,但在属水平上存在差异。各轮次间细菌菌群结构的差异菌属主要是Lentibacillus、Enterobacter、Escherichia-Shigella、Cronobacter、Stenotrophomonas等。本研究进一步揭示了茅台镇酱香白酒不同轮次酿造环境中的细菌菌群结构多样性及特征,为解析茅台镇酿造环境中的细菌菌群结构及酱香型白酒高品质酿造机制提供了一定科学依据。     

多轮底混合蒸馏工艺提高浓香型白酒品质的研究

通过对窖底酒醅进行多轮次循环发酵,得到高质量的多轮底发酵酒醅。同时,应用酯化酶回沙工艺强化积累多轮底发酵酒醅中的风味物质。然后将发酵好的多轮底酒醅与上层30天发酵酒醅混合蒸馏,使得多轮底酒醅中丰富的风味物质在酒精浓度相对较高的上层酒醅中得到充分的馏取。最后参与蒸馏的多轮底发酵糟醅与上层30天发酵的糟醅混合均匀后进入下一轮发酵。结果表明经过本试验可以将本厂浓香型白酒生产发酵周期缩短至30天,与42天生产发酵周期比较,窖池周转率提高40.6%,原酒特一级品率提高25%、特二级品率提高16%、优级品率提高25%、一级品率提高6%,各级原酒己酸乙酯含量提升2-3倍,四大酸、四大酯比例更加协调。     

茅台镇酱香型白酒酿造环境中真菌菌群多样性分析

采用高通量测序技术结合数理统计软件分析方法，系统研究茅台镇酱香型白酒不同酿造轮次生产环境中的真菌菌群结构及特征。7 个轮次中共检测到4 个真菌门、212 个真菌属。根据各菌门、属的相对丰度，子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）是茅台镇酱香型白酒酿造环节中各酿造轮次的优势菌门，节担菌属（Wallemia）、复膜孢酵母属（Saccharomycopsis）为各轮次绝对优势真菌属。不同轮次环境样品中真菌组成结构的相似度较高，但其各轮次标志性真菌属存在差异。7 个酿造轮次共有相同真菌属56 个，在各轮次占主导地位，特征性真菌属在各轮次当中相对丰度和占比较小但种类丰富。Ascomycota最强节点为德巴利酵母属（Debaryomyces），Basidiomycota最强节点为红酵母属（Rhodotorula）。本研究揭示了茅台镇酱香型白酒不同酿造轮次环境中真菌菌群结构及其特征，为深入研究酱香型白酒酿造机理以及对酿造环境中微生物结构的解析提供了参考依据。     

油茶籽水浆发酵分层现象研究

为了探索将茶叶籽油生物发酵生产工艺引入到油茶籽油生产中的可能性,通过观察不同打浆轮次及处于不同发酵时间段的油茶籽水浆状态,深入研究了油茶籽水浆发酵分层现象的发生过程。结果表明:油茶籽水浆发酵开始时上下是浑然一体的,呈乳白色,随着发酵时间的延长,发酵液分层逐渐由模糊变为清晰,发酵进行到4 h左右,发酵液明显分为3层:乳白色上层、淡黄色中层及灰褐色下层;此后,各层逐渐变得坚实,到发酵16 h左右,发酵液各层厚度已经稳定,上层、中层及下层的相对厚度分别为16%、75%、9%。不同打浆轮次油茶籽水浆发酵液上层形成时间随着打浆轮次的增加逐渐推迟,发酵液上层相对厚度随着打浆轮次的增加而降低;前3轮水浆发酵液上层相对厚度之和占所有打浆轮次上层相对厚度总和的95.9%。油茶籽水浆发酵分层现象发生过程与结果与茶叶籽水浆基本相同,因此茶叶籽油生物发酵生产工艺完全可以用于油茶籽油生产。利用茶叶籽油生物发酵工艺生产油茶籽油时,只需打浆3轮就可以达到效益最大化。     

酱香型白酒第四、五轮次基酒中游离氨基酸分析

该研究通过全自动氨基酸分析仪对酱香型白酒酿造中第四、五轮次基酒的加曲酒醅、入池酒醅和出池酒醅的游离氨基酸组成进行分析。结果表明,第四轮次和第五轮次酒醅分别检测到23种和21种氨基酸或化合物,第五轮次各个阶段酒醅中游离氨基酸总量明显高于第四轮次同阶段的游离氨基酸总量。出池酒醅中游离氨基酸含量最高,加曲酒醅中的游离氨基酸含量最低,堆积发酵和窖池发酵过程会产生大量的游离氨基酸。主成分分析结果表明,大多数游离氨基酸彼此之间具有较强的相关性,且第五轮次基酒氨基酸间的相关性较第四轮次更强。     

发酵温度对浓香型白酒杂醇油含量的影响

为探究发酵温度对浓香型白酒生产中杂醇油生成量的影响，该研究利用可实现夹套控温的固态发酵罐为发酵容器，分别进行两轮“控温发酵”实验，对控温发酵罐、未控温发酵罐（对照）和窖池发酵过程中糟醅中及基酒中的杂醇油进行对比分析。结果表明，通过控制固态发酵罐夹层水温可有效实现对发酵糟醅温度的控制，且第一轮控温后与对照罐（32.4 ℃）相比，控温后顶温（35 ℃）更高，中挺时间更长（13 d）；第二轮控温后发酵罐糟醅形成了2 ℃以上的温差，温度较高的发酵罐中挺时间较长（15 d）；经气相色谱分析检测发酵温度较高的发酵罐，其糟醅中正丙醇、异丁醇、正丁醇、异戊醇、正己醇等杂醇油含量增加了118.6%、21.2%、29.7%、21.7%、77.3%，其二段基酒中正丙醇、正丁醇、异戊醇、正己醇等杂醇油含量也较发酵温度较低的发酵罐高22.3%、0.6%、2.0%、25.4%。     

高产几丁质酶菌株的诱变选育及发酵条件的优化

以粘质沙雷氏菌G3-1为出发菌株,通过紫外-LiCl和微波-LiCl两轮复合诱变,得到一株产酶能力高且遗传稳定的突变株GF-21,通过单因素实验和正交实验对突变株GF-21的发酵培养基和发酵条件进行优化。结果表明,最优发酵培养基成分为:乳糖6 g/L,尿素10 g/L,KCl 1.0 mmol/L,NaCl 5 g/L,胶体几丁质10 g/L,此时,几丁质酶活力为4.73 U/mL,比优化前提高了109.3%,较出发菌株提高了470%;最优发酵条件为:培养基初始pH9.0,温度30 ℃,摇床转速220 r/min,接种龄5 h,接种量10%。本文为几丁质酶的生产应用奠定了良好的基础。