大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌临床分离株的耐药性分析

目的分析临床分离的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的分布情况及耐药性。方法收集吉林大学中日联谊医院临床标本中分离的221株大肠埃希菌和152株肺炎克雷伯菌,采用纸片扩散法检测抗菌素的敏感性;双纸片协同试验和纸片表型确证试验筛选并确证产超广谱β-内酰胺酶的菌株;按照美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)2005年版的标准判断结果。结果大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对亚胺培南和美罗培南的敏感性最高,均达100%;对头孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦和头孢西丁的敏感性也较高,均大于70%,而对氨苄西林的耐药性均大于90%。共检出产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌118株,检出率为53.4%;肺炎克雷伯菌21株,检出率为13.8%;产超广谱β-内酰胺酶的两种菌株与非产超广谱β-内酰胺酶的同种菌株相比,对抗菌素的耐药性均明显增加。结论大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌仍是产超广谱的β-内酰胺酶的主要菌株,且对常用抗菌素产生了较高的耐药性。     

1株牛源大肠埃希菌的分离及鉴定

目的分离及鉴定内蒙古自治区通辽市某牛场犊牛腹泻致病菌。方法无菌采集犊牛腹泻粪便,通过分离培养、染色镜检、致病性检测、药敏检测、生化鉴定、16S r RNA PCR鉴定、血清型鉴定及系统进化树的构建进行病原研究。结果致病菌的16S rRNA基因序列与大肠埃希菌的相似性在99%以上;生化鉴定该致病菌为大肠埃希菌的置信度为99%,在20种常用药品中仅对阿米卡星、庆大霉素、亚胺培南、美洛培南敏感;血清鉴定该大肠埃希菌菌株的血清型为O17。结论该致病菌鉴定为大肠埃希菌,该菌具有多重耐药性,有成为人畜共患病病原的潜在可能。该研究为通辽地区牛场流行的大肠埃希菌防控提供了参考。     

人工神经网络优化大肠埃希菌摇瓶培养基

目的 采用人工神经网络(artificial neural network,ANN)优化一种可获得高生物量及菌体活力大肠埃希菌(E.coli)的摇瓶培养基。方法 以葡萄糖(glucose,Glu)、酵母浸出物(yeast extract,YE)、酵母蛋白胨(yeast peptone,YP)、大豆蛋白胨(soy peptone,SP)和酵母基础氮源(yeast nitrogen base,YNB)占比为混料分量,菌体悬浮液A₆₀₀(A1)、培养物湿菌重(G,g/L)和菌体活力指标值(A2,A₄₆₀)为响应值,采用混料设计试验筛选对响应值具有显著影响的混料分量。以混料设计试验结果为训练和验证数据样本构建ANN模型,输入变量为混料分量且约束同混料分量上下限,输出变量为混料设计响应值。通过所构建ANN获得的优化后培养基配方和参考值,应用蒙特卡洛模拟进一步调整培养基配方,并获得E.coli摇瓶培养基配方,再对培养基配方进行10次验证试验。结果 E.coli摇瓶培养基配方：Glu 26 g/L、SP26 g/L、YNB 13 g/L,培养基总浓度为65...     

大肠埃希菌超广谱β-内酰胺酶基因型分析

目的研究临床分离产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌医院感染的临床分布及其基因型特征,为临床合理用药治疗大肠埃希菌引起的感染提供参考依据。方法采用聚合酶链反应(PCR)分别检测162株产ESBLS大肠埃希菌3种易常见的ESBLS基因TEM,SHV和CTX-M并对其标本来源和科室分布进行分析。结果ESBLS大肠埃希菌最多的科室为重外科(22.9%),可能与手术预防性用抗生素的因素有关。     

大肠埃希菌与酿酒酵母偶联合成S-腺苷甲硫氨酸

目的为大规模工业化生产S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)提供一套经济合理的生产工艺。方法将经DNA序列测定正确的SAM合成酶基因(SAMS)片段,经Eco RⅠ和NotⅠ双酶切,亚克隆至大肠埃希菌表达载体p ET-28a上,构建SAMS基因重组表达质粒p ET-28a-SAMS。将重组表达质粒转入大肠埃希菌表达宿主BL21(DE3),构建大肠埃希菌表达菌株BL21(p ET-28a-SAMS)。采用混合悬浮培养法,利用含有SAMS基因的重组大肠埃希菌BL21(p ET-28a-SAMS)中的SAM合成酶系和酿酒酵母JM-310中的ATP生物合成酶系,构建一个以葡萄糖为能源的中间偶合ATP再生系统,并对两种细胞的偶联合成比例、偶联时间、通透剂的种类及浓度、偶联缓冲液主要成分的浓度进行优化。结果经双酶切及菌落PCR鉴定证明,重组表达质粒p ET-28a-SAMS及大肠埃希菌表达菌株BL21(p ET-28a-SAMS)构建正确。大肠埃希菌BL21(p ET-28a-SAMS)与酿酒酵母的最佳偶联合成比例为4∶1,最佳偶联时间为5 h,添加5%甲苯通透效果最好,200 mmol/L磷酸缓冲液、200 mmol/L葡萄糖、10 mmol/L腺苷、30 mmol/L Mg Cl2·6H2O、30 mmol/L L-甲硫氨酸为最适偶联缓冲体系。最佳偶联条件下,偶联系统中SAM的浓度最高达1.7 g/L,对照组中SAM的浓度为0.17 g/L。结论本研究建立的方法操作方便,工艺简单,为SAM的廉价生产提供了一条新的途径。     

重组人神经生长因子在大肠埃希菌中的表达及活性测定

目的在大肠埃希菌中表达重组人神经生长因子(recombinant human nerve growth factor,rhNGF),并检测其活性。方法通过密码子优化,设计表达rhNGF的基因,构建重组表达质粒pET-28a(+)-hNGF,转化大肠埃希菌BL21pLyS(DE3)中,IPTG诱导表达。表达的蛋白经层析纯化后,SDS-PAGE及HPLC法检测纯度,Lowry法检测蛋白浓度,TF-1细胞增殖法检测生物学活性。结果构建了融合表达rhNGF的大肠埃希菌表达系统,表达的3批外源蛋白纯化后纯度均达到100%,比活分别为5.5×10~5、6.8×10~5和7.4×10~5 IU/mg,均高于小鼠颌下腺提取的NGF标准品。结论成功表达了rhNGF,纯化后纯度高,比活强,为规模化生产hNGF提供了参考。     

受污染缢蛏大肠埃希氏菌的净化研究

本研究探讨了受污染缢蛏在海水理化特性:水温:22℃,pH:7.9,盐度:31.2 ppt,溶解氧:7.02 mg/L,颜色及透明度:无色透明;实验室室温:25℃,湿度:65%的条件下充气放养几天才能使大肠埃希氏菌完全净化。试验结果表明该缢蛏样品经过海水的暂养和净化,可以降低其大肠埃希氏菌和菌落总数的数量,而且暂养的时间越长,样品中大肠埃希氏菌和菌落总数的数量越少。     

产肠毒素性大肠埃希菌K99-987P-F41原核表达载体的构建、表达及其纯化

目的构建产肠毒素性大肠埃希菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)K99-987P-F41原核表达载体,诱导表达后进行纯化。方法利用PCR技术,从ETEC基因组DNA中扩增出K99、987P、F41部分基因片段,将3段目的基因融合亚克隆至大肠埃希菌原核表达载体p ET30a(+),构建重组质粒p ET30a(+)-K99-987P-F41,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,表达的重组蛋白经镍离子亲和层析纯化。结果重组表达质粒p ET30a(+)-K99-987P-F41经PCR、酶切及测序鉴定证明构建正确。表达的重组蛋白相对分子质量约60 000,主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的63.8%,纯度为81.2%,浓度为8.953 mg/ml,可同时被天然和重组抗原多抗识别,具有良好的反应原性。结论 ETEC重组质粒p ET30a(+)-K99-987P-F41可在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,利用镍离子亲和层析柱纯化可获得融合蛋白。     

内蒙古通辽地区犊牛腹泻大肠埃希菌毒力基因检测及耐药性分析

目的 对内蒙古通辽地区犊牛腹泻大肠埃希菌(E. coli)的毒力基因进行检测,并分析其耐药性及耐药基因分布情况。方法 采用药敏纸片法检测从腹泻犊牛粪便样品分离鉴定的82株致病性E. coli对13种抗菌药物的敏感性,PCR法检测其13种毒力基因和12种耐药基因携带情况,并对其进行系统进化分群。结果 82株致病性E. coli中48.78%(40/82)、31.71%(26/82)、14.63%(12/82)和4.88%(4/82)分别属于A、B1、B2和D群,优势群系为A群(48.78%,40/82);共检测到11种毒力基因,未检测到tsh和LT1,其中irp2、fyuA、eaeA和STb的检出率较高,分别为79.27%(65/82)、63.41%(52/82)、53.66%(44/82)和50%(41/82),其他毒力基因检出率均低于50%。82株致病性E. coli对13种抗菌药物的耐药情况严重,其中对四环素、多西环素和阿莫西林的耐药性普遍较高,耐药菌株占比分别为100%(82/82)、97.56%(80/82)和90.24%(74/82);全部菌株表现出多重耐药,耐8种抗菌药物的...     

肠出血性大肠埃希菌O157免疫磁珠的制备

目的制备可高效、特异性富集肠出血性E.coli O157(enterohemorrhagic Escherichia coli O157,EHEC O157)的免疫磁珠。方法分别用5种不同规格磁珠与E.coli O157特异性单克隆抗体偶联制备免疫磁珠,通过比较磁珠蛋白偶联量,选取包被效果最佳的磁珠规格;对制备工艺进行优化(包括活化时间、温度,偶联缓冲液p H值,偶联温度、时间);对制备的O157免疫磁珠选择性集菌的敏感性和特异性进行评价,并与进口磁珠吸附率进行比较。结果直径0.5~1.0μm羧基磁珠抗体包被效果及目的菌分离效果最好。加入NHS后,活化30 min为最佳时间;4℃磁珠活化温度、0.01 mol/L PBS(p H 7.4)构成的体系对磁珠偶联单克隆抗体效果最佳;偶联温度为37℃、偶联时间为120 min时,偶联蛋白量最高,且波动范围较小,为最佳偶联温度及时间。在复杂的微生物环境中,O157免疫磁珠的敏感性达到20 CFU/ml。在混合菌液中,E.coli O157菌含量在1.4×10~3 CFU/ml时,免疫磁珠特异性捕获率达到90%。结论获得羧基磁珠与E.coli O157单克隆抗体偶联的最佳条件。制备的免疫磁珠能够特异性富集EHEC O157,具有操作简便,分离速度快,捕获率高等特点,可用于临床样品或食品中EHEC O157的分离鉴定。     

犊牛腹泻大肠埃希菌O-抗原血清型鉴定

目的对犊牛腹泻大肠埃希菌O-抗原血清型进行鉴定。方法收集内蒙古部分地区牛场患犊牛腹泻病的犊牛直肠内容物或粪便共165份,经细菌分离培养、动物致病性试验及16s RNA PCR检测,筛选出致病性大肠埃希菌,并进行O-抗原血清型鉴定。结果分离的大肠埃希菌共165株,115株有致病性,除7株未能确定分型及3株自凝集外,其余105株鉴定为O-抗原血清型。结论大肠埃希菌O-抗原血清型鉴定对流行病学调查及疾病预防均有重要意义。     

黄芩苷对大肠埃希菌的抗菌活性及其作用机制

目的探讨黄芩苷对大肠埃希菌的抗菌活性及具可能的作用机制。方法在检测黄芩苷对大肠埃希菌最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)及抑菌活力的基础上,进一步检测1倍MIC的黄芩苷对大肠埃希菌胞外乳酸脱氢酶活力、前向散射光及DNA含量的影响。结果黄芩苷对大肠埃希菌的MIC为7 mg/mL,干预2 h时即可达到抑菌活性高峰。1倍MIC的黄芩苷作用大肠埃希菌后,菌液中乳酸脱氢酶活力逐渐上升,8 h时抑菌活力高达(201. 48±19. 06)U/L。1倍MIC的黄芩苷作用大肠埃希菌2 h后,细胞体积缩小、DNA含量减少,与对照组相比,差异均有统计学意义(P <0. 05)。结论黄芩苷通过对大肠埃希菌细胞膜造成损伤而增加其通透性,使菌体物质大量外渗,从而实现其抗菌活性。     

臭氧对水中大肠埃希氏菌和肺炎性军团杆菌的失活作用

臭氧是自然界中存在的强氧化剂。目前在许多发达国家和我国部分地区都有用作生活用水处理的最后消毒手段。本文利用近年来国外发表的文献资料和实验结果,简明扼要地介绍和讨论臭氧对大肠埃希氏菌(E Coli)和肺炎性军团杆菌(Legionella pneumophila)的失活作用。     

1例犊牛腹泻大肠埃希菌的分离鉴定及毒力基因检测

目的 对1例犊牛腹泻大肠埃希菌进行分离鉴定及毒力基因检测.方法 无菌采集发病牛肝脏、脾脏、肾脏及十二指肠等脏器,制备肝脾组织切片,HE染色后观察组织病理学变化,并对分离菌株进行动物试验、生化试验、药敏试验、16S rRNA的PCR鉴定、系统进化树分析、毒力基因检测及O抗原鉴定.结果 心脏、肝脏病理学组织切片有明显坏死及...     

益生菌对大肠埃希菌O157:H7的抑制作用

以11%脱脂牛奶和MRS肉汤作为培养基,在适宜大肠埃希菌O157:H7生长的条件(37℃,有氧)下,考察益生菌混合物对大肠埃希菌O157:H7生存生长的影响。前期实验获得了5株益生菌和大肠埃希菌O157:H7各自的生长曲线,确认了酸性条件(培养基pH值为3.8)对大肠埃希菌O157:H7的抑制作用。经过对酸性环境的适应并不能提高大肠埃希菌O157:H7菌株对益生菌的抵抗能力。大肠埃希菌O157:H7(37℃,有氧状态培养8 h)不能在经过益生菌有氧状态下培养后的培养基澄清液中存活,但将该澄清液的pH值调到6.5(新鲜MRS肉汤培养基的pH值),大肠埃希菌O157:H7又可以在其中生长。结果表明,高浓度的益生菌对大肠埃希菌O157:H7菌株有抑制作用,这一方面是由于益生菌降低了培养环境的pH值,另一方面也是由于益生菌本身在有氧状态下产生了抑制大肠埃希菌O157:H7的代谢产物。     

人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1在大肠埃希菌中的表达

目的探讨在大肠埃希菌中不同因素对高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)L1蛋白表达的影响,为研发针对多型别HPV的低价、广谱疫苗奠定基础。方法通过采用非融合、不同融合蛋白形式,不同基因型HPV L1序列,以及同一基因型但不同序列特征等构建HPV L1非融合及融合表达重组质粒及HPV L1谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione-S-transferase,GST)融合表达质粒,转化不同宿主菌(大肠埃希菌DH5α、BL21),在不同的温度下(37、20℃)进行IPTG诱导表达,12%SDS-PAGE分析融合蛋白的表达及其可溶性,Western blot鉴定表达的融合蛋白。结果 HPV 16 L1蛋白在GST融合蛋白形式下获得了高效表达,而非融合表达或硫氧还蛋白融合表达未见明显目的条带;不同的宿主菌未对GST融合蛋白表达水平产生明显影响;在37℃培养条件下,表达的GST融合蛋白以包涵体形式存在,而在20℃培养条件下,部分表达的蛋白以可溶性形式存在;HPV 16 L1基因不同序列获得了类似的表达水平;经酵母密码子优化的HPV 18 L1与HPV 58 L1基因均能以GST融合表达形式获得与HPV 16 L1相似的高效表达。结论在大肠埃希菌中以GST融合形式可获得多基因型别HPV L1蛋白的高效可溶性表达,为病毒样颗粒体外折叠制备奠定了基础,也为其他外源基因在大肠埃希菌中的高效表达提供了参考。     

大肠埃希氏菌荧光定量PCR法与酶底物法相关性分析

针对大肠埃希氏菌国标法中的酶底物法检测时间长的现状,使用荧光定量PCR法和酶底物法同步检测大肠埃希氏菌,并比较分析两种方法检测结果的相关性.结果表明:荧光定量PCR法能检出细菌数为50 CFU/(100 mL)及以上的样品,含量在50～2000 CFU/(100 mL)的大肠埃希氏菌与酶底物法相比具有较高的一致性,相关系数r=0.99,经t检验分析,两种方法的检测结果无差异.荧光定量PCR法具有操作简便和检测时间短的优势,能作为酶底物法的有效补充手段,在实际水样的应急检测中具有较强的应用价值.     

酶底物法在食品中大肠埃希氏菌MPN计数的应用研究

目的：探讨酶底物法在食品中大肠埃希氏菌MPN计数的应用,并对市售的2种酶底物试剂EC-MUG和科立得（Colilert）MMO-MUG进行比较。方法分别用两种酶底物试剂检测菌悬液和对6类食品大肠埃希氏菌MPN计数,同时用参考方法GB 4789.38—2012大肠埃希氏菌MPN计数检测,用McNemar’s检验对结果进行分析。结果 EC-MUG和科立得MMO-MUG酶底物检测菌悬液和6类食品的大肠埃希氏菌MPN计数,与参考方法比较,无统计学差异（χ2=0.01,P﹥0.05）。EC-MUG 和科立得 MMO-MUG 酶底物检测无统计学差异（χ2=0.01,P﹥0.05）;科立得 MMO-MUG酶底物检测结果易判断。结论酶底物法检测食品中大肠埃希氏菌MPN计数方便、快捷,有良好的应用前景。     

应用RED同源重组技术构建表面展示链球菌GapC1的大肠埃希菌

目的应用RED同源重组技术构建表面展示链球菌Gap C1-150 aa(Gap C1)的大肠埃希菌,为进一步构建大肠埃希菌表面展示重组菌株奠定基础。方法根据Gen Bank中登录的gap C基因序列(GI:30348860)设计引物,以质粒p KD3、p QE30/lpp-omp A-gap C为模板进行PCR扩增、融合,获得融合片段,转化入含p KD46质粒的大肠埃希菌HB101中,利用p KD46编码的RED系统将融合片段重组入基因组中,经氨苄西林(Amp)和氯霉素(Cm)抗性筛选,获得去除p KD46质粒的重组菌(HB101LOG)。对重组菌株进行PCR、Western blot、流式细胞术、荧光显微镜及生物学特性检测。结果 PCR结果显示,重组菌株构建正确;重组大肠埃希菌HB101LOG在菌体表面表达了外源蛋白Gap C1-150 aa;激光共聚焦显微镜观察到HB101LOG可见明显的绿色荧光,HB101未见绿色荧光;重组菌株HB101LOG和HB101的生长曲线符合大肠埃希菌的生长规律。结论应用RED系统成功构建了能展示链球菌Gap C1-150 aa的大肠埃希菌重组菌株。