血管内皮生长因子和胎盘生长因子在子痫前期及子痫患者胎盘组织中的表达

目的检测血管内皮生长因子(VEGF)和胎盘生长因子(PLGF)在子痫前期及子痫患者胎盘组织中的表达,探讨两者与子痫前期和子痫的相关性。方法采用亲和免疫细胞化学技术SABC(链霉素-生物素-过氧化物酶复合物技术)对正常妊娠组、轻度子痫前期组、重度子痫前期组和子痫组(每组各20名孕妇)胎盘组织中的VEGF和PLGF进行检测。结果各组孕妇胎盘组织中的VEGF和PLGF主要分布于滋养叶细胞,其次是蜕膜组织,绒毛血管内皮细胞和部分间质细胞也有表达。轻度和重度子痫前期组胎盘组织中VEGF和PLGF的表达强度明显低于正常妊娠组,重度子痫前期组明显低于轻度子痫前期组,且差异均有统计学意义;子痫组与重度子痫前期组比较,差异无统计学意义。结论VEGF和PLGF在子痫前期及子痫患者胎盘组织中表达的下降可能是其发病的重要因素。     

血管内皮生长因子化学发光免疫测定试剂盒的研制及验证

目的研制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)化学发光免疫测定试剂盒,并对该试剂盒进行验证。方法以试剂盒的技术指标和血清检测结果为参考依据,建立检测方法,确定检测范围,并对包被抗体(1∶500、1∶1 000和1∶2 000倍稀释)及酶标抗体浓度(1∶3 000、1∶5 000、1∶6 000和1∶8 000倍稀释)、包被温度(室温和4℃)、封闭液成分(1%小牛血清、1%和0.5%牛血清白蛋白)及干燥方法(超净台吹干和使用真空干燥机进行干燥)进行优化;同时对试剂盒的线性、检出限、精密性、准确度、特异性及热稳定性进行验证;采用本试剂盒对139例非肿瘤人群和100例肿瘤患者的血清样本进行初步检测。结果方法的最佳检测条件为:包被抗体浓度为1∶1 000,酶标抗体浓度为1∶3 000,对血清样本的检测范围为6.25~800 pg/ml,最佳包被浓度为4℃,最佳封闭液成分为0.5%牛血清白蛋白,最佳干燥方法为真空干燥法。试剂盒线性相关系数r0.99,校准曲线各点偏差的绝对值10%,最低检出限≤3.125 pg/ml,空白检出限≤3.125 pg/ml,批内差异5%,批间差异7%,回收率为85%~99%;特异性检验结果为本试剂盒对EGF、FGF-2、PDGF-AA、Pl GF-1、Pl GF-2、HGF、TNF-α、TNF-β检测的交叉反应率≤0.52%;经37℃保存3、7 d后,试剂盒线性相关系数r0.99,空白检出限≤3.125 pg/ml,批内差异8%,回收率为80%~82%。139例非肿瘤人群和100例肿瘤患者的血清样本中VEGF的中位水平(M)分别为44.6和83.4 pg/ml。结论本研究开发的试剂盒具有较高的准确性、灵敏性、特异性,适用于血清VEGF的临床检测,具有较好的临床应用前景。     

血管内皮生长因子抑制剂生物学活性检测方法的建立

目的建立血管内皮生长因子抑制剂(VEGF Trap)生物学活性检测方法。方法利用HEK293/D9/Flt-18R(al-pha)/Flt-IL18R(beta),clone V3H9细胞系,通过荧光素酶检测系统(Steady-Glo~ Luciferase Assaysystem)进行VEGF Trap的生物学活性检测,用VEGF Trap参考品计算供试品的相对百分效价,并对该方法进行精密性和准确性验证。结果VEGF Trap供试品及参考品在该方法中均存在量效关系,且符合四参数方程式:y=(A-D)/[1+(X/C)B]+D。3批VEGF Trap原液和6批成品经3次测定,相对百分效价的平均值在(90.00±2.40)%～(116.77±16.50)%之间,变异系数均小于15%。1批VEGF Trap原液及成品经3次测定,回收率分别为(90.40±2.67)%和(117.20±18.12)%。结论已成功建立VEGF Trap生物学活性检测方法,该方法重复性好,准确性高,可作为VEGFTrap生物学活性的常规检测方法。     

川芎嗪对脓毒症诱导的急性肺损伤小鼠血管内皮生长因子水平变化的影响

目的研究川芎嗪(Tetramethylpyrazine,TMP)对脓毒症诱导的小鼠急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)的保护作用以及对血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)水平变化的影响。方法将小鼠随机分为假手术组(Sham组)、脓毒症组(Sep组)、治疗对照组(NS组)、TMP-A组和TMP-B组,Sep组、NS组、TMP-A组和TMP-B组采用盲肠结扎穿刺术(Cecal ligation and puncture,CLP)复制脓毒症相关性ALI模型,造模成功后,TMP-A组和TMP-B组分别经腹腔注射100 mg/kg和40 mg/kg TMP,Sham组和NS组经腹腔注射等量生理盐水,Sep组不作处理。分别于造模后0、12、24和48 h取材,HE染色观察小鼠肺组织病理学变化;ELISA检测小鼠血浆中VEGF含量变化;Western blot检测小鼠肺组织VEGF蛋白水平。结果 TMP组小鼠在造模后12 h时肺组织病理变化与Sep组相比有所减轻,24 h时肺泡水肿、肺出血及中性粒浸润均明显减轻,48 h时TMP作用最理想;TMP组小鼠血浆VEGF水平造模后24 h开始低于Sep组(P<0.05),48 h持续下降,已接近Sham组水平;TMP组小鼠肺组织VEGF蛋白水平在造模后24 h比Sep组明显升高,但低于Sham组(P<0.05);100 mg/kg TMP的效果优于40 mg/kg;小鼠肺组织VEGF水平与血浆VEGF水平呈负相关(P<0.05)。结论 TMP能够有效减轻脓毒症所致ALI,这一作用与降低血浆VEGF水平,恢复肺组织VEGF蛋白水平有关。     

ELISA法间接检测血管内皮生长因子抑制剂的相对结合力

目的采用ELISA法间接检测血管内皮生长因子抑制剂(VEGF Trap)的相对结合力。方法以固定量的VEGF165与VEGF Trap结合,通过双抗体夹心ELISA法检测未结合的、游离的VEGF165,进而求得VEGFTrap的半数抑制浓度(IC50),计算其与反应体系中参比品的IC50之比,即为VEGFTrap的相对结合力。结果同一批次的3支VEGF Trap样品分别经3次测定,相对结合力分别为(100.86±9.43)%、(88.46±13.94)%和(82.66±9.60)%,均值为(90.66±12.60)%,符合该制品质量标准的要求。3次试验的变异系数分别为9.35%、15.76%和11.61%。结论 ELISA法精密性良好,结果客观,影响因素少,可用于VEGF Trap相对亲和力的常规检测。     

Aurora-A高表达对食管鳞癌血管生成及血管内皮生长因子受体-2表达的影响

目的探讨Aurora-A高表达对食管鳞癌血管生成及血管内皮生长因子受体-2(vascular endothelial growthfactor receptor 2,VEGFR-2)表达的影响。方法将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记的Aurora-A全长表达质粒pEGFP-C1-Aurora-A转染至食管鳞癌细胞KYSE150,经G418筛选获得Aurora-A高表达的细胞株(Aurora-A高表达组),同时设空质粒pEGFP-C1转染组(阴性对照组)和未转染组作为对照。Western blot检测各组细胞中Aurora-A蛋白的表达;采用小管形成及鸡胚尿囊膜试验检测Aurora-A高表达对肿瘤血管生成的影响;免疫组化法检测Aurora-A高表达对裸鼠移植瘤中微血管密度(microvessel density,MVD)的影响;Western blot检测Aurora-A高表达对KYSE150细胞中VEGFR-2及p-VEGFR-2(Tyr1059)表达的影响。结果 Aurora-A高表达组中总Aurora-A蛋白的表达量约为阴性对照组和未转染组的2.5倍,提示Aurora-A高表达细胞系构建成功;Aurora-A高表达组生成的血管数量、MVD值和p-VEGFR-2的表达水平均显著高于阴性对照组(P<0.01)。结论 Aurora-A高表达可促进食管鳞癌中的血管生成,其机制可能与活化VEGFR-2有关。     

胎衣不下奶牛母体胎盘中血管内皮生长因子A异常表达的分析

目的分析胎衣不下(retained fetal membrane,RFM)奶牛母体胎盘组织中血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor-A,VEGFA)的表达情况。方法提取RFM及胎衣正常排出奶牛母体胎盘组织中的总蛋白,采用荧光定量PCR及Western blot法检测两组奶牛母体胎盘组织中VEGFA的mRNA转录及蛋白表达水平。结果与胎衣正常排出组相比,RFM组奶牛母体胎盘组织中VEGFA的mRNA转录及蛋白表达水平均显著降低,差异均有统计学意义(P 0. 01)。结论发生RFM的奶牛母体胎盘组织中VEGFA表达减少,提示VEGFA可能参与该病的发生发展。     

重组人血管内皮生长因子165b在毕赤酵母中的表达及纯化

目的在毕赤酵母中表达重组人血管内皮生长因子(recombinant human vascular endothelial growth factor,rhVEGF)165b(rhVEGF-165b),并进行纯化。方法 PCR扩增hVEGF165b基因,插入毕赤酵母表达载体pPIC9k,构建重组表达质粒pPIC9k-VEGF165b,SalⅠ酶切线性化后,电击转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达。表达产物经Ni-NTA sephrose镍柱纯化后,进行Western blot鉴定。结果重组表达质粒pPIC9k-VEGF165b经双酶切和测序,证明构建正确;表达的rhVEGF165b蛋白相对分子质量约为23 000,纯化后纯度达90%以上,具有人VEGF的抗原性。结论成功在毕赤酵母中表达了rhVEGF165b蛋白,纯化的蛋白纯度较高,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

重组人血管内皮生长因子抑制剂理化对照品质控方法及质量标准的建立

目的建立重组人血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)抑制剂理化对照品质控方法及质量标准。方法利用HEK293细胞增殖抑制法测定重组人VEGF抑制剂理化对照品生物学活性;紫外分光光度法测定蛋白含量;质谱法进行相对分子质量测定、液质肽图及糖基化位点分析、二硫键分析、N-寡糖糖型及比例分析;SDS-PAGE及SEC-HPLC法分析纯度;等点聚焦法进行电荷异质性分析;Edman降解法进行N-末端氨基酸序列分析。结果重组人VEGF抑制剂理化对照品各项检定指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国药典》三部(2015版)相关要求。结论建立的质控方法和质量标准符合理化对照品的相关规定,具有保证该理化对照品结构正确、质量可控的特点。检定合格的理化对照品可用于该类产品的常规检定。     

可溶性血管内皮生长因子受体2片段的表达及其对血管内皮细胞增殖的影响

目的探讨可溶性血管内皮生长因子受体2(sKDR)抑制血管内皮细胞增殖及在血管生成中的作用。方法提取脐静脉内皮细胞(HUVEC)总RNA,扩增KDR基因膜外1~4结构域,构建原核表达载体pQE40-KDR,转化E.coli M15,经IPTG诱导表达,镍离子柱亲和层析纯化后复性,用Western blot检测sKDR蛋白的表达,MTT比色法和鸡胚尿囊膜(CAM)试验分别检测其对HUVEC增殖的影响及其对血管生成的作用。结果经RT-PCR扩增得到了1150 bp左右的sKDR片段,并在pQE40原核表达系统中表达了sKDR蛋白,以包涵体形式存在。纯化后蛋白电泳呈现相对分子质量50000左右的单一条带,纯化蛋白占总蛋白的98%,蛋白含量为80μg/ml。Western blot证实其为重组sKDR蛋白。MTT检测结果显示,sKDR可抑制血管内皮生长因子(VEGF)刺激的HUVEC增殖,并阻滞VEGF诱导的CAM血管增生。结论已成功构建sKDR原核表达载体,并在大肠杆菌M15中获得表达,纯化的sKDR片段具有与VEGF结合的生物学功能,有望成为基因治疗肿瘤血管形成的理想靶点。     

The Role of Vascular Endothelial Growth Factor A Polymorphisms in Breast Cancer

Breast cancer is the most common cancer in females and the leading cause of cancer death in women worldwide. Angiogenesis, the formation of new blood vessels, plays an important role in the development and progression of breast cancer. Vascular endothelial growth factor A (VEGFA), the key modulator of angiogenesis, is highly expressed in cancer tissue and correlates with its more aggressive features. Polymorphisms of VEGFA alter the levels of expression and subsequently influence the susceptibility and aggressiveness of breast cancer. Assessment of VEGFA polymorphisms may be used for the identification of patients suitable for anti-VEGFA therapy.     

人血管内皮细胞生长因子在大肠杆菌中的表达及纯化

目的　为了获得大量重组人血管内皮细胞生长因子（ Ｈｕｍａｎ Ｖａｓｃｕｌａｒ ＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＧｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ, ｈＶＥＧＦ）,以研究其在心血管和药学领域具有的潜在药用价值。方法　用ＰＣＲ方法扩增目的基因ｈＶＥＧＦ１６５,连接到 ｐＥＴ－３ａ载体上,并转化到大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中,建立可高效表达的ｐＥＴ－３ａ／ｈＥＶＧＦ１６５重组质粒,经ＩＰＴＧ诱导表达, Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测表达产物的抗原性,通过 Ｍｏｎｏ Ｑ阴离子层析和ＦＰＬＧ　Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２分子筛柱层析,进行初步纯化,用 ＭＴＴ法检测其生物学活性。结果 　ｐＥＴ－３ａ／ｈＥＶＧＦ表达产物经纯化后,其纯度可达到９０％以上,表达的ｒｈＥＶＧＦ１６５能 呈剂量依赖性地促进人静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）的增殖。结论组建了天然形式ｈＥＶＧＦ１６５的大肠杆菌菌株,并摸索 出一套纯化工艺,为大规模生产重组ｈＥＶＧＦ１６５奠定了基础。     

Vascular Endothelial Growth Factor,a Key Modulator of the Anti-Tumor Immune Response

During tumor growth, angiogenesis is required to ensure oxygen and nutrient transport to the tumor. Vascular endothelial growth factor (VEGF) is the major inducer of angiogenesis and appears to be a key modulator of the anti-tumor immune response. Indeed, VEGF modulates innate and adaptive immune responses through direct interactions and indirectly by modulating protein expressions on endothelial cells or vascular permeability. The inhibition of the VEGF signaling pathway is clinically approved for the treatment of several cancers. Therapies targeting VEGF can modulate the tumor vasculature and the immune response. In this review, we discuss the roles of VEGF in the anti-tumor immune response. In addition, we summarize therapeutic strategies based on its inhibition, and their clinical approval.     

血管内皮生长因子反义基因真核表达载体的构建及其对乳腺癌细胞的生长抑制作用

目的构建反义血管内皮生长因子(VEGF165)基因真核表达载体,分析该基因对乳腺癌细胞的生长抑制作用。方法将人VEGF165cDNA反向克隆至pcDNA3真核表达载体中,构建VEGF165反义基因的真核表达载体,转染人乳腺癌细胞MCF-7,观察转染前后MCF-7细胞的VEGF165表达及细胞生长周期。结果所构建的VEGF165反义基因真核表达载体转染MCF-7细胞后,VEGF165表达下降,细胞生存率下降,G1期细胞数量增加,S期细胞数量减少,细胞增殖能力降低。结论成功构建了VEGF165反义基因表达载体,该基因对乳腺癌细胞的生长具有明显的抑制作用。