猪软骨Ⅱ型胶原蛋白的制备及结构表征

从猪软骨中提取纯化Ⅱ型胶原蛋白,并对其进行结构表征。结果表明,猪软骨Ⅱ型胶原蛋白的最佳提取条件为温度35℃、加酶量0.8%胃蛋白酶、时间25 h,该条件下胶原蛋白提取率可达49.28%,纯度为92.65%。SDS-PAGE结果显示Ⅱ型胶原蛋白有2条α链和1条β链。红外光谱和电镜扫描结果显示该胶原蛋白具有典型的酰胺基团,有完整的三股螺旋结构。     

六氟异丙醇对I型胶原分子结构完整性的影响

六氟异丙醇(HFIP)通常作为制备I型胶原纳米纤维的溶剂,然而,其对I型胶原分子结构的影响还需全面的论证。以HFIP为溶剂,配制质量浓度为3%、5%、7%的I型胶原溶液,室温(约20℃)下搅拌3d,冷冻干燥制得准变性胶原(PDC)。采用凝胶电泳法、紫外光谱法、傅里叶红外光谱法、热重法、超灵敏差式扫描量热法和X射线衍射法,对PDC分子结构进行表征。结果显示:HFIP的2个三氟甲基有助于打破疏水作用的联系,HFIP的醇羟基有助于打断I型胶原的氢键,使其三股螺旋结构遭到破坏,分子间氢键作用减弱,形成了与明胶不同的多肽链聚集结构,HFIP中的酸性二级醇羟基降低了I型胶原的热变性温度,且热稳定性均降低。结果表明,HFIP可能不适合作为I型胶原的良溶剂。     

利用猪副产物酶法制备胶原多肽

近年科学研究发现,人体摄取蛋白质经酶消化后,并非主要以氨基酸形式吸收,而以肽的形式吸收;一些肽不仅能提供人体生长发育所需营养物质,同时还具有多种生理功能。猪副产物中含有丰富的胶原蛋白,利用蛋白酶水解胶原蛋白生产胶原多肽,对促进猪副产物的精深加工发展具有积极作用。本文介绍目前酶法制备胶原多肽研究进展,讨论影响酶解效果的因素,阐述了胶原多肽生理功能及发展前景。     

猪源I型胶原/壳聚糖复合海绵的制备

研究以纯化猪皮为原料,采用酸-酶结合法制备得到了I型胶原。再以市售高脱乙酰度壳聚糖为原料,采用乙酰化反应,制备一定乙酰度的壳聚糖。接着将所提取的I型胶原与壳聚糖以不同质量比例混合制备复合海绵,并使用红外、DSC、AFM等对自制壳聚糖和复合海绵的结构进行表征,检测了壳聚糖的特性黏度。结果表明:红外证实了经乙酰化反应后的市售壳聚糖的酰胺键被有效置换,制备得到的壳聚糖的特性黏度为825.584,粘均相对分子质量为2.43×105;复合后I型胶原的三股螺旋结构存在一定程度地变化,随着壳聚糖含量的增加,复合海绵的热稳定性提高,有利于样品的存放。     

罗非鱼鳞胶原肽亚铁螯合物制备工艺优化及结构表征

以罗非鱼鳞胶原肽与氯化亚铁盐为原料制备多肽亚铁螯合物,并对其最佳螯合条件及螯合物结构进行探究。以螯合物得率为指标通过单因素和响应面法对螯合条件进行优化;通过扫描电镜、傅里叶红外光谱、X衍射和氨基酸分析等方法对螯合物结构及氨基酸组成进行分析。结果表明,制备螯合物的最佳反应条件为pH 5.30,多肽浓度3.00%,多肽与铁质量比3.2∶1.0,该条件下螯合率为82%,螯合物得率为65.43%;通过氨基酸组成分析表明,氨基酸组成符合胶原多肽的成分特征,螯合后天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、组氨酸和精氨酸含量增加;扫描电镜、红外光谱以及X衍射等结果表明多肽与亚铁盐以配位键结合成多肽亚铁螯合物。     

猪皮胶原的提取及其结构表征

分别以鲜猪皮和经过自制CO2 超临界处理器处理过的猪皮为原料 ,以醋酸钠 -盐酸为缓冲液 ( pH =2 .0 ) ,利用国产胃蛋白酶提取猪皮胶原。通过测定分子量、等电点以及利用DSC、IR等方法 ,对所提取的猪皮胶原结构进行了表征。结果表明 :从经过自制CO2 超临界处理器处理过的猪皮中提取的猪皮胶原的纯度 ,要比从未经自制CO2 超临界处理器处理过的猪皮中提取的猪皮胶原的纯度高很多 ,其它性质基本不变 ;同时两者都最大程度地保持了猪皮胶原的三股螺旋结构 ,因而适合用作生物医用材料及原料。     

鸡胸软骨粉中II型胶原的提取及结构分析

以鸡胸软骨为原料制备软骨粉,采用盐酸胍溶解去除非胶原成分后,添加胃蛋白酶酶解提取软骨粉II 型胶原。SDS-PAGE 电泳和RP-HPLC 色谱证实了所提取的软骨粉II 型胶原具有较高的纯度。氨基酸组成分析、紫外吸收光谱、FT-IR 谱图、圆二色谱和差示扫描量热分析的测定结果表明软骨粉II 型胶原保持天然构象,结构没有受到破坏。     

牛跟腱胶原与草鱼皮胶原的结构表征及自组装行为比较

以牛跟腱和草鱼皮为原料,采用“酸-酶”结合法提取I型胶原,研究两种胶原的结构特性及其自组装行为差异。结果表明：牛跟腱胶原和草鱼皮胶原均具有I型胶原的典型结构特点,具有相似的相对分子质量和二级结构,但氨基酸含量有所差异,其中牛跟腱胶原亚氨基酸（脯氨酸+胫脯氨酸）含量要高于草鱼皮胶原。胶原的自组装结果表明,当胶原质量浓度为2 mg/m L、温度为37℃时胶原自组装速率最高。而当温度过高（>42℃）时,相比牛跟腱胶原,草鱼皮胶原的组装受到更大地抑制,这可能归因于牛跟腱胶原中更多的亚氨基酸含量赋予了其更好的热稳定性。此外,增大胶原浓度可以提升胶原凝胶的存储模量,整体而言,牛跟腱胶原凝胶的存储模量优于草鱼皮胶原凝胶。     

不同来源Ⅱ型胶原结构及其免疫活性

采用酶法制备了不同来源的Ⅱ型胶原,并对其理化性质及免疫活性进行了研究。结果表明:3种来源的软骨中均含有丰富的II型胶原,其中鸡胸软骨含量为81.54%,猪膝关节软骨含量为81.31%,羊肋软骨含量为80.94%;氨基酸组成分析和紫外吸收光谱鉴定表明,提取的胶原蛋白为典型II型胶原;SDS-PAGE电泳结果表明,所提取的II型胶原具有较高的纯度;傅立叶红外光谱和园二色光谱分析表明,3种来源的II型胶原在提取的过程中均保持着完整的二级结构;采用MTT法测定的淋巴细胞增殖反应结果表明,3种来源的II型胶原均具有免疫活性,且鸡胸软骨的活性最高,淋巴细胞增值率为52.91%。     

猪Ⅱ型胶原及胶原肽抗关节炎的研究

本实验以猪鼻骨为原料,采用盐析法提取天然Ⅱ型胶原蛋白,采用碱性蛋白酶酶解制备胶原肽,并测定胶原蛋白的纯度,分析胶原蛋白及胶原肽的理化性质。通过构建小鼠CIA动物模型,研究Ⅱ型胶原蛋白及胶原肽对类风湿性关节炎的作用效果。结果表明,提取所得蛋白的胶原蛋白含量为82.86%,在紫外波长230 nm下有最大吸收峰,280 nm处几乎无吸收峰,分子量大于300 KD,具备天然Ⅱ型胶原蛋白特征;酶解得胶原肽不含Ⅱ型胶原蛋白,分子量小于20 KD;Ⅱ型胶原蛋白能够降低小鼠关节指数、降低关节变形率,明显降低小鼠血清中IL-17、MMP-3和TNF-α水平(p0.05),并能显著提高T细胞刺激指数(P0.05),对B细胞刺激指数无明显效果(p0.05);组织病理学显示Ⅱ型胶原蛋白能够减轻关节破坏程度,抑制软骨退化;而胶原肽不具有以上作用。     

胶原膜糖基化产物的制备及表征

采用D-木糖通过美拉德反应对天然可食用胶原膜进行糖基化改性,得到一种新型天然可食用有色胶原膜。通过单因素实验考察了不同实验条件对反应程度的影响,并对改性后的胶原膜进行了相关表征。研究结果表明,当D-木糖浓度10%,pH 8.0时,胶原膜在60℃的水浴中反应14 h进行糖基化改性较适宜。红外光谱分析表明,糖基化改性没有破坏胶原的高级结构。差示量热扫描分析和热重分析显示,改性后胶原膜的变性温度提高了8.5℃,起始分解温度升高了约100℃,耐热性得到了显著的改善。接触角和吸水率测定表明,改性后胶原膜的亲水性有所提高。     

两种大豆胰蛋白酶抑制剂的抑制活性及二级结构分析比较

研究了I型Kunitz大豆胰蛋白酶抑制剂(I-KSTI)和Bowman-Birk大豆胰蛋白酶抑制剂(BBTI)对胰蛋白酶的抑制活性及其二级结构的组成差异。发现I-KSTI及　BBTI对胰蛋白酶的抑制曲线分为两部分:活性急剧下降部分和缓慢下降部分。使胰蛋白酶的活性降为原来的一半时的I-KSTI和BBTI浓度为1.5μg/ml　和1.2μg/ml。使胰蛋白酶活性趋向于零(完全钝化)时的I-KSTI浓度为13.5μg/ml,而BBTI则为9μg/ml。两种抑制剂的存在不改变胰蛋白酶的Km值,但其Vmax随抑制剂浓度的增加而下降。表明其对胰蛋白酶的抑制作用是一种非竞争性抑制作用。远紫外圆二色谱的研究发现I-KSTI和BBTI的单一吸收负峰在200nm波长处,I-KSTI的克分子椭圆度[θ]200nm=-2545deg·cm2/d　mol,其二级结构由22.5%β折叠,16.25%β转角和61.4%无规卷曲组成;BBTI的[θ]200nm=-797deg·cm2/d　mol,由52.6%β折叠和47.4%无规卷曲组成。     

鸡关节软骨Ⅱ型胶原的制备

本文以鸡关节软骨为原料制备Ⅱ型胶原。在酸性条件下添加不同浓度的胃蛋白酶酶解鸡关节软骨Ⅱ型胶原三股螺旋链的端肽,使Ⅱ型胶原由不溶性转变为可溶性,研究底物粘度随酶解时间的变化,确定最佳的酶浓度及酶解时间。采用DEAE-Sephalose CL 6B离子交换柱和去离子水重复洗涤两种方法对酶解样品进行纯化制得Ⅱ型胶原,研究表明,胃蛋白酶最适添加浓度1%(W/W),最佳酶解时间24h。两种纯化方法的Ⅱ型胶原提取率分别为67%和81%。SDS-PAGE电泳、高效液相色谱、氨基酸成分分析及紫外吸收光谱测定结果证实了由鸡关节软骨所制备的Ⅱ型胶原具有较高纯度。     

猪皮胶原多肽螯合钙的制备及其结构表征

以猪皮明胶复合酶解胶原多肽和葡萄糖酸钙为原料,多肽钙螯合率为指标,在一定条件下制备多肽螯合钙。通过Plackett-Buiman（PB）和中心组合设计（CCD）,考察胶原多肽/水料液比、多肽/葡萄糖酸钙质量比、p H、反应温度、反应时间、搅拌时间、搅拌速度等因素对多肽螯合率的影响。结果表明:通过PB设计筛选出多肽/葡萄糖酸钙质量比、p H和反应时间为多肽钙螯合主要影响因素,经CCD优化确定最佳螯合工艺为多肽/葡萄碳酸钙质量比5.5∶1,p H6.0,反应时间130 min,胶原多肽/水料液比1.5∶100,反应温度60℃,搅拌速度30 r/min,搅拌时间20 min。在此条件下,多肽螯合率达78.3%。采用紫外光谱、红外光谱、扫描电镜、X衍射等手段,研究了猪皮胶原多肽螯合钙的结构,结果表明猪皮胶原多肽与钙形成了螯合物,且胶原多肽的氨基和羧基均与Ca2+发生了螯合反应。      

牛关节软骨中Ⅱ型胶原和硫酸软骨素的综合提取与表征

以新鲜牛关节软骨为原料,脱脂脱钙后采用乙酸与胃蛋白酶相结合的方法提取Ⅱ型胶原,然后采用稀碱与胰蛋白酶相结合的方法提取剩余残渣中的硫酸软骨素,并采用FT-IR、AFM和热重分析对所得Ⅱ型胶原和硫酸软骨素进行检测。结果表明,该方法提取得到的Ⅱ型胶原和硫酸软骨素均很好的保持了其天然结构,而且所得硫酸软骨素具有较高的纯度。     

高纯度牛骨胶原的制备及其结构表征

本实验以牛骨为原料,提供了一种经过粉碎、脱脂、脱钙、酶解、盐析、纯化、冷冻干燥等步骤来制备天然牛骨胶原的方法。并采用SDS-PAGE凝胶电泳、紫外吸收光谱、红外吸收光谱、氨基酸含量分析方法,对其进行了结构表征。结果表明,纯化的天然牛骨胶原的纯度达到99%,属于胶原I型([α1(I)]2α2(I)),且完整地保持了胶原的三螺旋结构,两条肽链的相对分子量为α1=123kD,α2=112kD。     

鸡胸软骨中Ⅱ型胶原的制备工艺优化

对鸡胸软骨Ⅱ型胶原的制备工艺进行优化。采用盐酸胍和NaCl 2 种抽提方法去除杂蛋白,然后用胃蛋白酶酶解并考察酶解温度、酶解时间和酶添加量对胶原提取率的影响。结果表明：4 mol/L的盐酸胍能有效去除杂蛋白;当酶解温度18 ℃、胃蛋白酶添加量1.59%、酶解43 h时提取率最高,且此条件下的胶原提取率为56.54%,且保持着完整的二级结构。经过酶解后制备的Ⅱ型胶原电泳图谱出现α、β 2 条带,无其他杂带,Ⅱ型胶原纯度较高。     

高压脉冲电场对大肠杆菌胞内蛋白的影响

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和傅里叶变换红外光谱研究了高压脉冲电场(PEF)处理对大肠杆菌(E.coli)胞内蛋白的影响,并应用去卷积和曲线拟合等数学方法和圆二(CD)色谱进一步分析PEF处理前后蛋白二级结构中α-螺旋、β-转角、β-折叠和无规卷曲相对含量的变化。结果表明,经过PEF(30 kV/cm,400μs)处理后,在分离胶的顶端出现了蛋白质的聚集。蛋白二级结构中β-折叠相当含量从45.40%降至21.50%,β-转角相对含量从23.8%降至8.81%,而无规卷曲结构从0.13%升至36.95%,α-螺旋结构没有明显的变化。     

胶原与聚酯复合凝胶的制备与表征

本文研究了固定2-异丁烯酰基磷酸胆碱（MPC）的胶原凝胶。用1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亚胺（EDC）和N-羟基丁二酰亚胺（NHS）在吗啉乙烷磺酸（MES）的缓冲液中与胶原交联成膜（EN凝胶）。分别在PH值4．5和9．0下制备EN凝胶，以便观察其与胶原交联能力的变化。MPC与甲基丙酸烯酸的聚合物（MPC-聚-甲基丙酸烯酸）（PMA）能选择性的交联胶原的羧基链。当结合NHs的中间体活化PMA来形成已用MPC固定了的胶原凝胶（Mic）时，加入EN凝胶。Mic凝胶分别在酸性条件和碱性条件下制备，以便观察其与PMA交联能力的差别。X-射线结果显示，PMA在酸性和碱性条件下都能与胶原交联。差示扫描热重分析（Dsc）结果显示，Mic凝胶的收缩温度增加了，而且在碱性条件下收缩温度增加大。数据显示，在碱性条件下制备的Mic凝胶溶胀程度要小。此过程可以不考虑胶原的生物降解因素，因为在碱性条件下制备的Mic凝胶有着稳定的内交联。