链霉菌DDE转座酶基因的克隆及生物信息学分析

从实验室保藏的菌株中筛选出一株产DDE转座酶的菌,经形态及生理生化、16S rDNA及建树分析比对,该菌株属链霉菌属灰褐类群,暂将其命名为Streptomyces labedae sp. X1。从Streptomyces labedae sp. X1基因组DNA扩增一401 bp的DDE转座酶基因,通过Blast和ISfinder数据库进行序列比对,结果显示其与ISAzo13家族转座酶的基因有88%的相似度。通过对其进行生物信息学分析,发现该基因可编码133个氨基酸,且该DDE转座酶的保守的氨基酸三联体分别位于Asp43、Asp49、Glu91上,理化性质结果显示编码产物为稳定的亲水蛋白;二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,不存在信号肽和跨膜结构域,为非分泌蛋白;有14个磷酸化位点且仅有一个糖基化位点;高级结构以α-螺旋为主;通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,结果显示在27 ku处出现条带。该研究结果为研究链霉菌DDE转座酶基因的表达机制提供了重要信息,对以后鉴定DDE转座酶活性以及它的结构和功能奠定基础。     

海洋链霉菌KR结构域基因的克隆与分析

酮还原酶（Ketoreductase,KR）是聚酮合酶（Polyketide Synthase,PKS）重要的组分,可催化β-酮基的还原,是手性药物合成的重要手段,并在聚酮化合物合成中起着关键性作用。该研究从海洋链霉菌Streptomyces sp. X-66基因组DNA扩增出一条 1 331 bp的KR结构域基因,并进行生物信息学分析。Blast结果显示该序列包括了FAS KR和PKS KR两部分,核心功能区域集中于PKS KR基因部分序列;最大ORF区域拟编码333个氨基酸,理论等电点为4.80,分子式为C1500H2419N433O463S6,不稳定指数为24.85,为酸性稳定蛋白,并有较低亲水性,不含信号肽和跨膜结构,二级结构以α-螺旋和无规卷曲为主,SDS-PAGE显示其相对分子质量约为70 ku。通过氨基酸多序列比对,表明蛋白KR3属于B1型KR;以蛋白KR3氨基酸序列预测并检验其三级结构模型,利用分子对接和可视化分析预测蛋白KR3与配体结合的关键残基为204Thr、206Thr和207Leu,依据相关研究分析蛋白KR3引导底物进入活性中心的结合模式与B型KR较为符合,为进一步研究KR3的功能及新型手性药物和聚酮化合物的合成提供科学依据。     

海洋链霉菌差向异构结构域基因的克隆与分析

为研究差向异构结构域基因的序列特征以及其在非核糖多肽生物合成中的立体异构化特性,以海洋链霉菌 Streptomyces sp. X66基因组DNA为模板,采用PCR技术克隆获得目的基因序列,经测序及生物信息学分析表明,该基因序列长 1 099 bp,Blast序列比对该基因与Streptomyces albidoflavus strain W68的E结构域基因序列相似度达99.45%,具有典型的差向异构结构域的功能区域,且包含差向异构结构域独有的保守基序HHxxxD,证明扩增的基因片段为差向异构结构域基因序列。理化分析显示：其拟编码366个氨基酸,理论等电点为5.69,原子组成为C1752H2738N510O523S3,不稳定指数为32.68,平均亲水系数为-0.15,编码产物为酸性亲水稳定蛋白,且不含信号肽和跨膜结构,二级结构以α-螺旋和无规卷曲为主,SDS-PAGE显示其分子量约为55 ku,与预期相符。通过对差向异构结构域基因的研究,以期为进一步解析差向异构结构域功能及新型非核糖体多肽的研发提供科学依据。     

链霉菌L10608来源木聚糖酶xyn-GH10/11基因的克隆与生物信息分析

基于菌株L10608所产天然酶水解木聚糖底物时具有良好的水解木聚糖底物特性,通过设计简并引物,经巢式PCR克隆得到L10608菌株木聚糖酶基因全长(xyn-GH10与xyn-GH11),并对其进行生物信息学分析。由分析可知酶xyn-GH10全长1 469 bp,分子质量:50.677 ku;理论等电点pI:7.98;预测该木聚糖酶的信号肽为MGIQALPRAAVRQKLRTPLPALAAGVLGLTAALVPPTNADA;该木聚糖酶蛋白序列具有明显的第10族糖苷水解酶的八叠桶型保守区域,且能编码一段由108个氨基酸组成的RicinB-lectin非催化结构域。木聚糖酶xynGH11全长729 bp;分子质量:24.003 ku;理论等电点p I:8.98;预测该木聚糖酶的信号肽为MHQDGSQQDRT QNPAPFGGLSRRGFLVGGTGAAALAAGSGLLLPGTAHAA。该木聚糖酶蛋白序列具有明显的第11族糖苷水解酶的"右手半握状"保守区域。xyn-GH10与xyn-GH11基因经原核表达后其中木聚糖酶xyn-GH10酶活为160 U/mL,木聚糖酶xyn-GH11酶活为55 U/mL。     

产纤溶酶霉菌的筛选及诱变

本研究从我国传统发酵豆制品中筛选具有纤溶酶活性的霉菌三株,用PDA培养后进行分离纯化,并对纯化的菌种进行诱变、复筛和发酵培养。通过菌种特征、形态以及制片镜检对菌种进行初步鉴定,其中两株可以鉴定为根霉或毛霉,一株为枯青霉(Penicillium curinum Thom)。对其鉴定后的菌株进行紫外线诱变和紫外线-氯化锂复合诱变处理,纤溶酶活性由68、56和72U/g分别提高到488、416和660U/g。     

少根根霉发酵液纤溶酶的分离纯化及部分性质鉴定

以产纤溶酶的根霉菌8B进行发酵,发酵液通过蒸发浓缩、(NH_4)_2SO_4分级沉淀、透析除盐、DEAE阴离子交换纤维素层析、Sephadex G—75凝胶过滤层析对该酶进行纯化,纯化浓缩后酶液活力达到3 978.5U/ mL。结果表明,该纤溶酶在-18～37℃,pH 5～7时性质稳定。该酶即能直接分解纤维蛋白,又能激活血纤维蛋白溶酶原,间接分解纤维蛋白。对家兔血栓的溶解实验表明,8B纤溶酶6h对血栓的溶解率达到52.4%,并且对兔血细胞没有明显损伤,在体外是安全有效的。     

产纤溶酶海洋放线菌的筛选及初步鉴定

从渤海湾海水和海泥样本中筛选得到产纤溶酶的菌株。通过添加抑制剂对样品预处理、调整培养基配方和添加目标蛋白诱导培养以筛选得到菌株,通过生理生化实验和16S rRNA序列分析,进行菌株种属鉴定。结果表明,调整富集和筛选的培养基配方,获得了一株产纤溶酶的菌株MY0504,初步推断为链霉菌属（Streptomyces sp.）。     

沙门氏菌噬菌体SM-p2内溶酶及穿孔素的生物信息学分析和克隆表达

沙门氏菌是常见的危害公共安全的食源性致病菌。内溶酶和穿孔素作为新型生物抑菌剂,是噬菌体编码的具有细菌裂解作用的功能蛋白。本文利用十聚寡核苷酸引物和PCR技术对噬菌体SM-p2的DNA进行随机扩增并确定穿孔素基因Hol 2和内溶酶基因Lys 2;使用生物学信息软件分析预测Lys 2和Hol 2的特性;利用大肠杆菌原核表达系统对Lys 2和Hol 2进行克隆表达。结果表明:噬菌体SM-p2是一种具有“穿孔素-内溶酶”裂解体系的双链DNA烈性噬菌体。经生物信息学分析发现,Hol 2是一种仅有一个跨膜结构的Ⅲ型穿孔素,Lys 2是一种没有跨膜结构肽聚糖水解酶。利用大肠杆菌表达系统成功表达了Lys 2和Hol 2,然而,穿孔素能直接裂解细菌细胞内膜,对感受态表达细胞产生毒害作用,导致Hol 2表达量较少。最终获得质量浓度为5.419 mg/mL的内溶酶Lys 2和2.191 mg/mL的穿孔素Hol 2。本研究成功表达了沙门氏菌噬菌体SM-p2的内溶酶和穿孔素,为SM-p2的抑菌研究奠定了分子基础。     

枣GDPD甘露糖焦磷酸化酶基因的克隆及生物信息学分析

GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶（GDP-D-mannose pyrophosphorylase,GMP）是植物As A生物合成的第一个关键酶,至今未见该基因在枣中的相关报道。本研究根据Gen Bank中登录的苹果、桃和草莓等植物GMP保守序列设计引物,采用同源克隆法,从\     

豆豉纤溶酶研究概况及进展

豆豉纤溶酶是从我国传统发酵食品豆豉分离得到一种具有强烈纤溶作用丝氨酸蛋白酶。该文对豆豉纤溶酶产生菌筛选与诱变、发酵工艺、酶分离纯化、理化性质、分子生物学研究进行综述;同时还简介豆豉纤溶酶活性测定方法和抗栓、溶栓作用,并对其应用前景进行展望。     

Bacillus sp.nov SK006中纤维蛋白溶解酶的克隆及其在大肠杆菌中的表达

利用PCR技术从Bacillus sp.nov SK006中扩增得到纤维蛋白溶解酶(Fibrinolitic enzymes,FE)基因的DNA片段,将其连接到pMD-T载体上,经测序后克隆至载体PET-22b(+),转化至E.coli BL21(DE3)中,得到的重组菌能高效表达FE。诱导表达后,SDS-PAGE显示,重组FE分子量约为28 ku。     

微紫青霉酸性木聚糖酶xynA基因的克隆与序列分析

基于酸性木聚糖酶在饲料及酿酒行业良好的应用前景,通过基因组步移的方法克隆得到微紫青霉酸性木聚糖酶的全长基因xynA,然后采取重叠延伸PCR技术进行内含子的切除获得xynA的cDNA序列,并对其进行了生物信息学分析。序列分析结果显示xynA基因全长720 bp,内含子63 bp,cDNA全长657 bp。推测该木聚糖酶编码信号肽28个氨基酸,成熟肽190个氨基酸;预测该蛋白为分子质量20.61 kD、等电点7.0的亲水性蛋白,且分子内不含二硫键。与其他真菌来源的GH11族耐酸性木聚糖酶进行序列比对,结果显示该酶的相应位置具有特征天冬氨酸残基Asp,且具有糖苷水解酶11族的保守区域特征以及典型的"右手半握"状结构,重组木聚糖酶基因xynA能够在大肠杆菌中成功表达,比酶活力达220.5 U/mg。     

酸土脂环酸芽孢杆菌Fe-SOD基因克隆及生物信息学分析

酸土脂环酸芽孢杆菌具有嗜酸耐热的独特生理特性,从该属细菌中分离到的多种酶类都具有耐酸热稳定性,是筛选耐酸耐热酶的重要菌种资源。超氧化物歧化酶(SOD)由于具有重要的生理功能而广泛用于食品、药品及化妆品等行业。为了深入探讨酸土脂环酸芽孢杆菌SOD的分子生物学特性,本研究利用同源克隆、交错式热不对称PCR技术和生物信息学方法进行Fe-SOD基因克隆、测序及序列分析。结果表明,Fe-SOD基因(GenBank序列号:JN614998)ORF全长为606bp,编码202个氨基酸,其推测氨基酸序列与来源于酸热脂环酸芽孢杆菌DSM446的Fe-SOD(ACV58017.1)序列相似性最高,为78%。整个蛋白序列含有Fe/MnSODs家族的5个模体,SOD活性中心含有金属离子结合配基His27、His82、Asp164和His168,具有Fe/MnSODs家族典型的蛋白结构特征。酸土脂环酸芽孢杆菌Fe-SOD基因的克隆和生物信息学分析为进一步构建原核表达载体、获得生产耐酸热Fe-SOD的基因工程菌株奠定基础。     

枯草芽孢杆菌纤溶酶的纯化及性质研究

以从牛肉酱中筛选的1株高产纤溶酶的枯草芽孢杆菌为材料,进行发酵产酶。其发酵液经过硫酸铵盐析、Sephadex G-100凝胶过滤、C M SepharoseCL-6B离子交换层析和电泳制备,得到电泳纯的枯草芽孢杆菌纤溶酶;其分子质量为32.5ku;pI10.9～11.8;具有直接溶解纤维蛋白和激活纤溶酶原的双重作用;胰蛋白酶对此酶无降解作用,对其纤溶活性无影响;该酶在pH4.0～13.0稳定,对温度的适应范围较广。     

树莓RiPAL1基因克隆及生物信息学分析

苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine Ammonia Lyase,PAL）是苯丙烷类代谢的关键酶,能调节树莓中黄酮类的生物合成。为了深入研究树莓中RiPAL1基因的功能与调控机制,以树莓果实为材料提取总RNA,合成cDNA第一链,然后成功克隆出树莓果实RiPAL1基因,并对其进行了相关的生物信息学分析。结果表明,RiPAL1基因的编码序列（Coding Sequence,CDS）全长为2 133 bp,编码710个氨基酸,分子量为77.50 ku,等电点为6.21。RiPAL1蛋白疏水性最大值为4.50,最小值为-4.50,平均疏水指数为-0.49,为亲水性蛋白,无跨膜结构,无信号肽。含有4个N糖基化位点和67个特异性激酶位点,二级结构以α螺旋为主,三级结构为同型四聚体。多序列比对显示RiPAL1蛋白具有典型的苯丙氨酸解氨酶保守结构域,系统进化分析表明RiPAL1蛋白与同科植物草莓亲缘关系最近。该研究可为深入研究RiPAL1基因参与树莓果实黄酮类物质生物合成的分子机制提供参考。     

豆豉溶栓酶工程菌的发酵条件及重组溶栓酶的分离纯化

对豆豉溶栓酶工程菌株WB DFE5进行了摇瓶发酵条件的研究 ,确定了发酵的优化条件为 :可溶性淀粉 2 % ,酪蛋白 2 % ,大豆蛋白胨 0 5 % ,酵母粉 0 15 % ,K2 HPO40 2 5 % ,KH2 PO40 0 5 % ,CaCl2 0 0 2 % ,MgSO40 0 5 % ,pH7 0。通过硫酸铵分段盐析、离子交换和凝胶过滤 ,从 1L工程菌株WB DFE5的发酵液中分离纯化出 12 5mg重组豆豉溶栓酶 ,酶的比活为 5 918 7IU/mg。     

蜡样芽孢杆菌LJ01中亚硝酸盐还原酶的基因克隆和生物信息学分析

为研究蜡样芽孢杆菌LJ01(Bacillus cereus LJ01)中亚硝酸盐还原酶(NiR)的酶学性质,获得高表达量的基因工程菌,本文对B.cereus LJ01的NiR序列进行了生物信息学分析,并将NiR基因克隆到表达载体pET-28a(+)和pET-32a(+)中,构建了基因工程菌pET-28a(+)-nir-BL21和pET-32a(+)-nir-BL21,随后探究了不同诱导条件对重组NiR表达量的影响。结果表明NiR编码蛋白的理论分子量约为60 kDa,理论pI为5.47,二级结构主要为α-螺旋和无规则卷曲,是不具有跨膜结构的亲水性蛋白。随着诱导温度的升高,重组NiR的表达量逐渐减少,诱导温度为16℃时重组NiR表达量最高。在同一诱导温度下,NiR在pET-28a(+)-nir-BL21中的表达量明显高于pET-32a(+)-nir-BL21,因此选用pET-28a(+)-nir-BL21作为基因工程菌。从B.cereus LJ01中克隆了NiR基因,构建了基因工程菌pET-28a(+)-nir-BL21,为该重组NiR的理化性质研究和食源芽孢杆菌中NiR的异源表达奠定了基础。