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目的建立稳定、高效表达重组铜绿假单胞菌外毒素A(rEPA)的工程菌发酵及表达产物纯化工艺。方法规模化发酵表达rEPA的重组大肠杆菌rPE553D,离心收集菌体,渗透压调解使菌体周质间隙蛋白释放后,高速离心收集蛋白溶液。经DEAESepharoseFF、PhenylSepharose6FF疏水层析和SOURCE30Q强离子交换层析,超滤浓缩纯化rEPA。用HPLC、SDS-PAGE和Westernblot等方法检定生化和免疫学特性,并用小鼠和Vero细胞检定毒性。结果每55L培养基中rEPA产量超过4g,纯度在95%以上,细胞毒性降低了至少32000倍。其余各项指标均符合《中国生物制品规程》要求。结论已建立了收率高、纯度好、稳定、适合规模化生产rEPA的工艺。 相似文献
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假单胞菌AB93066产鼠李糖脂发酵条件的优化 总被引:4,自引:0,他引:4
通过单因素实验和正交实验对铜绿假单胞杆菌AB93066产鼠李糖脂(RL)的摇瓶发酵培养基配方和产生规律进行了研究。结果表明,最佳培养基配方为:ρ(酵母膏)=0.2 g/L,ρ(豆油)=120 g/L,ρ(NaNO3)=6.5 g/L,ρ(KH2PO4)=1.0 g/L,ρ(Na2HPO4.12H2O)=1.0 g/L,ρ(MgSO4.7H2O)=0.1 g/L,ρ(FeSO4.7H2O)=0.2 g/L,pH=6.0。RL的收获期在发酵后156~168 h最佳。发酵生产RL的扩大实验表明,在最优发酵条件下RL的产量可达56 g/L以上,提取后的RL可将去离子水的表面张力降至29.01 mN/m。用高效液相色谱/质谱联用仪进一步分析了所提取的RL的组成,它分别为二鼠李糖脂(R1)和单鼠李糖脂(R2)两种同系物。R1和R2的表观临界胶束浓度(CMC)分别为0.03 mmol/L和0.04 mmol/L。 相似文献
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目的建立铜绿假单胞菌注射液(Pseudomonas aeruginosa,PA-MSHA)体外抗肿瘤生物活性检测方法。方法将系列稀释的PA-MSHA在体外直接作用于人肝癌细胞BEL-7402,光学显微镜下观察细胞的生长状态;MTT比色法检测其对细胞增殖水平的影响;对10批PA-MSHA成品分别检测3次,以半数抑制浓度(IC50)为指标,计算批内和批间变异系数(CV),验证方法的精密性。结果随着PA-MSHA稀释度的降低,光镜下贴壁的BEL-7402细胞数量逐渐减少,细胞皱缩并破碎;MTT比色结果显示,随着PA-MSHA稀释度的降低,孔内颜色逐渐变浅,BEL-7402细胞增殖抑制率逐渐升高,呈一定的剂量-效应关系;10批PA-MSHA成品3次检测的IC50值范围为(3.584~7.778)×108个/ml,批内变异系数为4.58%~24.17%,批间变异系数15.08%~16.95%,总变异系数为15.81%,均符合细胞实验变异系数应小于30%的标准;PA-MSHA成品经该方法检测后,得到的IC50值在(3.109~7.383)×108个/ml范围内时,表明成品的生物活性合格。结论建立了PA-MSHA体外抗肿瘤生物活性检测方法,该方法稳定性好、精密性高,而且具有操作简便、节约成本和时间等优点,可用于对PA-MSHA以及其他类似细菌类生物制品的体外生物活性研究。 相似文献
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目的在原核系统中表达铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)PAO1的调控蛋白RhlR,制备兔抗RhlR抗血清。方法构建重组表达载体pGEX-4T-1-rhlR和pET-22b-rhlR并转化至大肠埃希菌BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达GST-RhlR和His-RhlR蛋白,经GST或Ni~(2+)亲和层析纯化重组蛋白。将His-RhlR蛋白免疫新西兰大白兔,制备RhlR抗血清,GST-RhlR蛋白包被ELISA板,检测效价。结果构建的表达载体pGEX-4T-1-rhlR和pET-22b-rhlR经双酶切及测序鉴定证明构建正确;构建的工程菌表达的目的蛋白His-RhlR和GST-RhlR相对分子质量分别为29 000和54 000,表达量均约占菌体总蛋白的85%,纯度大于90%。制备的RhlR抗血清效价可达1∶80 000。结论获得高效价的RhlR抗血清,为PA中rhl调控系统的研究奠定基础。 相似文献
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铜绿假单胞菌外毒素A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A,PEA)是该菌分泌的外毒素之一,通过催化细胞延伸因子2(elongation factor-2,EF-2)的ADP核糖基化,抑制蛋白合成,从而导致细胞死亡,在铜绿假单胞菌导致的感染性疾病中发挥重要作用。PEA强烈的细胞毒性特点使得该毒素成为免疫毒素的重要成分之一,已广泛应用于肿瘤的靶向治疗中。此外,由于PEA可与抗原提呈细胞表面的α2巨球蛋白受体结合,通过胞饮作用进入胞内,辅助抗原的处理和提呈,可作为分子佐剂应用于各种疫苗的研发。本文对PEA在免疫毒素及疫苗佐剂方面应用的研究进展作一综述。 相似文献
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铜绿假单胞菌WJ-1降解原油特性 总被引:6,自引:1,他引:6
从蒙古林油藏地层水中筛选和驯化得到一株兼性厌氧烃降解菌WJ-1,经生理生化测试和16S rDNA鉴定该菌株为铜绿假单胞菌。为了研究菌株WJ-1降解原油的性质,利用该菌株对新疆、中岔口、大庆江桥、蒙古林等油田的不同黏度的原油进行了微生物降解实验,分析了微生物降解作用对原油饱和烃、芳烃、非烃以及胶质和沥青质等组分在原油中相对含量、组成和结构的影响。原油棒薄层分析结果表明:微生物作用引起原油性质发生明显变化,各原油中胶质、沥青质、非烃类含量均降低10%以上;气相色谱分析结果表明:原油饱和烃中轻组分含量相对增加,重组分含量相对减少;芳香烃中的菲组分相对减少。黏度和凝固点分别平均降低45%和6℃,原油的流动性增强。多孔介质中的物理模拟实验表明:在不同黏度原油(新疆、中岔口、大庆江桥、蒙古林)的驱油实验中,菌株WJ-1能在空白水驱的基础上分别提高原油采油率4.78%、5.15%、7.39%、相似文献
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选用铜绿假单胞菌为降解菌,研究了苯酚、葡萄糖、乙酸钠参与下,邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)的共代谢降解,挑选出了最佳的共代谢基质乙酸钠,并得到了最佳共代谢降解条件:p H=7、T=30℃、转速=200 rpm、共代谢基质与DEHP的浓度比=10∶1。最后对共代谢基质参与下的DEHP的降解过程进行了一级动力学拟合,拟合结果表明速率常数K苯酚K葡萄糖K乙酸钠。 相似文献
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铜绿假单胞菌分泌鼠李糖脂能力对原油降解影响的研究 总被引:3,自引:0,他引:3
研究了铜绿假单胞菌分泌鼠李糖脂能力对原油生物降解的作用.将保存在原油中的铜绿假单胞菌转接至甘油培养基进行继代培养,观察到各继代培养下鼠李糖脂分泌量越高则该发酵液对原油的乳化降解能力就越强,推测该菌产鼠李糖脂能力决定了该培养液对原油的乳化与降解程度.鉴于此,分别将鼠李糖脂提取液、发酵液加入到原油培养基中,观察其各自的原油乳化程度的变化趋势,发现鼠李糖脂本身可以乳化原油但不能降解原油,且其乳化能力不如去菌体的发酵液.去菌体发酵液能很快地乳化原油而同样不能降解原油.只有含菌体的发酵液既能乳化又能降解原油.因此,可以认为鼠李糖脂本身具有乳化原油的能力,但是由铜绿假单胞菌同时分泌的其它表面活性物质可能协同鼠李糖脂更好地乳化原油以促进微生物对原油的利用与降解. 相似文献
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从6种细菌(铜绿假单胞菌、黄杆菌、枯草芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、恶臭假单胞菌和金色葡萄球菌)中筛选出降解光氧化褐煤的优势菌株恶臭假单胞菌,并通过单因素实验优化了恶臭假单胞菌降解光氧化内蒙古胜利褐煤的工艺条件。确定恶臭假单胞菌降解光氧化内蒙古胜利褐煤的最佳工艺条件为:煤加量0.3 g·(20 mL)~(-1)、接种量2.0 mL·(20 mL)~(-1)、培养箱振荡频率160 r·min~(-1)、降解时间12 d、煤样粒度(-0.15+0.075) mm、降解温度30℃。 相似文献
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《中国生物制品学杂志》2016,(6)
目的建立测定重组铜绿假单胞菌外毒素A(recombinant exotoxin of Pseudomonas aeruginosa,r EPA)含量的SDSPAGE法,并进行验证。方法采用SDS-PAGE,经考马斯亮蓝R-250染色后,利用Image Lab软件分析获得目标蛋白条带光密度值,计算目标蛋白在待测样品中的含量。对建立的方法进行专属性、准确性和重复性验证,确定检测范围,并用建立的方法检测r EPA宿主湿菌体中r EPA发酵产量及r EPA宿主菌休克液柱层析纯化样品中r EPA含量。结果 r EPA含量在100~600μg/ml范围内与其对应条带的光密度值具有良好的相关性,决定系数在0.97以上。大肠埃希菌固有组分及纯化过程中常用的添加物对r EPA含量检测均未产生明显影响,专属性较好;用建立的方法检测500、300、150μg/ml r EPA样品10次的回收率分别为(102.32±4.18)%、(102.77±4.94)%和(95.04±16.41)%,CV值分别为4.08%、4.81%和17.27%。各批r EPA发酵产量为250~500 mg/L,三步柱层析纯化后,r EPA总回收率约为50%。结论建立了测定r EPA含量的SDS-PAGE法,该方法专属性、准确性和重复性良好,为r EPA生产工艺的优化奠定了基础。 相似文献
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随着微生物技术的发展,通过微生物技术治理工业生产中的“三废”已经成为未来行业发展的主流趋势。本文就微生物降解异丁醛过程开展了合理的分析,并对微生物体系进行了16-SrDNA检测,结果表明该体系中含有大量铜绿假单胞菌,可以利用碳源形成多糖类生物膜。综上所述,本文对铜绿假单胞菌在挥发性有机化合物降解中起到的作用进行合理的分析与研究。 相似文献