BrdU标记家兔成纤维细胞的体外及体内实验观察

目的用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记家兔皮肤成纤维细胞,确定最佳标记方法,探讨其作为成纤维细胞示踪方法的可行性。方法取12～16周龄健康中国大耳白兔颈部皮肤,胶原酶消化,分离并培养成纤维细胞。取第3代细胞,加入终浓度分别为2.5、5、10和15μg/ml的BrdU共培养,MTT法检测细胞的生长情况。分别用2.5、5、10和15μg/ml的BrdU标记第3代细胞,标记6、12、24和48h后,采用免疫荧光法检测各组细胞的标记阳性率。以最佳剂量及时间标记家兔成纤维细胞,与壳聚糖-甘油磷酸钠水凝胶混合后,注入兔颈内动脉,1周后,免疫荧光法观察植入细胞。结果加入BrdU48h内,各浓度的BrdU对家兔成纤维细胞生长的影响均不明显。标记剂量及标记时间均可影响标记率,但标记时间的影响更大。5μg/ml剂量标记24h,标记率可达(94.50±2.08)%,再加大标记剂量或延长标记时间,标记率提高不明显。以该方法标记的家兔成纤维细胞注入家兔颈内动脉1周后,可在兔颈内动脉观察到大量标记细胞。结论BrdU对家兔成纤维细胞的最佳标记方法为5μg/ml标记24h,该方法对细胞影响小,标记率高,适用于成纤维细胞体内示踪。     

穿心莲内酯口服自微乳剂在大鼠体内的药代动力学研究

目的:研究穿心莲内酯自微乳在大鼠体内的血药浓度经时曲线,评价穿心莲内酯自微乳在大鼠体内的药代动力学特征及相对生物利用度。方法:分别单剂量给予大鼠穿心莲内酯自微乳和穿心莲内酯混悬液,用HPLC法测定大鼠血浆中的穿心莲内酯的质量浓度,采用DAS 2.0程序拟合药物浓度-时间曲线,计算药代动力学参数和生物利用度。结果:穿心莲内酯自微乳和混悬液的药动学参数分别是C_(max)为18.30μg·mL~(-1)和7.225μg·mL~(-1),Tmax为2.0 h和3.0 h,AUC0-24h为63.995μg·h·mL~(-1)和32.32μg·h·mL~(-1),穿心莲内酯自微乳相对于混悬液的生物利用度为156.39%。结论:穿心莲内酯自微乳相对于混悬液,能够显著提高穿心莲内酯在大鼠体内的生物利用度。     

QCM实时监测人脐静脉内皮细胞在不同KRGD浓度自组装膜上的动态粘附

采用自组装及化学耦合技术将细胞粘附分子KRGD(Lys-Arg-Gly-Asp)与3-巯基丙酸(MPA)以及防止细胞非特异性粘附的三乙二醇单-11-巯基十一烷基醚(TGME)修饰于石英晶体微天平(QCM)的金电极上,制备了KRGD-MPA/TGME/Au传感界面;采用QCM实时监测人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在不同KRGD浓度(0μg·mL~(-1)、25μg·mL~(-1)、50μg·mL~(-1)、75μg·mL~(-1)、100μg·mL~(-1))自组装膜上的动态粘附过程。结果表明,当KRGD浓度为50μg·mL~(-1)时,QCM频率变化Δf、动态电阻变化ΔR、细胞黏弹性指数CVI(ΔR/Δf)最大,表明该条件下HUVEC在QCM表面的粘附最强,显示出最有组织的细胞骨架结构而最硬;当加入肌球蛋白Ⅱ抑制剂blebbistatin后,粘附有细胞的QCM响应信号减弱,细胞粘附变弱,细胞变软。表明QCM可用于监测不同KRGD浓度自组装膜上HUVEC的动态粘附及细胞-药物作用,从而提供有关细胞粘附强度与黏弹性的动态信息。     

气相色谱法快速测定水体中残留的六种菊酯类农药

建立固相萃取气相色谱法快速测定水体中残留的6种菊酯类农药。水样经固相萃取柱(Supelco HLB)富集,乙酸乙酯洗脱,经气相色谱定量分析,6种菊酯类农药达到良好的分离,待测物浓度在0.05~5.0μg·mL~(-1)范围内线性关系良好,相关系数均不低于0.995;精密度相对标准偏差均小于5%(n=6);定量限分别为甲氰菊酯0.005μg·mL~(-1),氯氟氰菊酯0.005μg·mL~(-1),氯菊酯0.01μg·mL~(-1),氯氰菊酯0.01μg·mL~(-1),氰戊菊酯0.005μg·mL~(-1),溴氰菊酯0.005μg·m L~(-1);加标回收率在80%~120%之间。实验证明,该方法具有简单、准确、快速等优点,可用于测定水体中残留的6种菊酯类农药。     

珠子参总皂苷对大鼠成骨细胞的保护作用及其机制初探

离体培养大鼠原代成骨细胞,分别采用MTT法、EdU成像法、测定碱性磷酸酶法、茜素红染色法考察了不同浓度珠子参总皂苷对成骨细胞活力、增殖、分化、矿化等的影响;并采用Western bloting法研究了不同浓度珠子参总皂苷对成骨细胞OPG和RANKL蛋白表达的影响。结果表明,珠子参总皂苷浓度为100μg·mL~(-1)时可提高成骨细胞活力;浓度为50μg·mL~(-1)、100μg·mL~(-1)、200μg·mL~(-1)时可显著促进成骨细胞增殖、分化和矿化;珠子参总皂苷呈浓度依赖性地提高OPG/RANKL相对表达比值。     

HPLC法测定抗结核新药CZYS03-04的有关物质和含量

采用Thermo BDS HYPERSIL C18(250×4.6 mm,5.0μm)色谱柱,流动相A为30 m M磷酸二氢钾溶液(p H值6.8),流动相B为乙腈∶甲醇=50∶50,流速1.0 m L·min-1,检测波长为220 nm,柱温40℃。建立了测定抗结核新药CZYS03-04的含量和有关物质的高效液相色谱方法。主成分及其有关物质分离良好,主成分检测浓度线性范围为0.2838μg·mL~(-1)~425.6469μg·mL~(-1)(r=0.999 9),检测限为0.02 ng(0.001μg·mL~(-1)),定量限为0.08 ng(0.004μg·mL~(-1))。重复性RSD=3.4%(n=6),中间精密度RSD=7.8%(n=9)。样品溶液在24 h内稳定。     

顶空气相色谱法测定非达霉素原料药中残留溶剂

采用顶空气相色谱法,色谱柱为CP8756毛细管柱,顶空平衡温度为70℃,平衡时间为40min,通过程序升温测定非达霉素原料药中4种残留溶剂。结果表明,在3.00～359.48μg·mL~(-1)范围内,甲醇的浓度与峰面积线性关系良好(R~2=0.9999),平均回收率为98.27%;在2.50～601.03μg·mL~(-1)范围内,乙醇的浓度与峰面积线性关系良好(R~2=0.9998),平均回收率为98.55%;在2.06～49.44μg·mL~(-1)范围内,乙腈的浓度与峰面积线性关系良好(R~2=0.9999),平均回收率为99.40%;在1.25～598.60μg·mL~(-1)范围内,乙酸乙酯的浓度与峰面积线性关系良好(R~2=0.9999),平均回收率为98.51%。该方法操作简单、准确度高、重复性好,可用于非达霉素原料药中残留溶剂的质量控制。     

鞣花酸对人肺癌A549细胞的作用研究

目的:研究鞣花酸对人肺癌A549细胞的抑制作用。方法:通过不同药物浓度以及不同作用时间,以MTT以及LDH为观察指标,并以形态学观察,评价鞣花酸对A549细胞的作用效果。结果:在鞣花酸浓度在10~80μg·m L~(-1)内,对人肺癌A549细胞有明显抑制作用,且在作用时间在48 h时,作用较明显;当鞣花酸浓度超过40μg·m L~(-1),其杀伤作用明显;在一定范围内,其作用效果跟药物的作用时间呈正相关。结论:鞣花酸对人肺癌A549细胞有明显的抑制作用。     

响应面法优化秦艽多酚提取工艺及体外抗氧化活性研究

以乙醇体积分数、超声时间、料液比及超声功率为考察因素,以秦艽多酚得率为考察指标,进行单因素实验,在此基础上采用响应面法优化秦艽多酚提取工艺。选取维生素C(VC)作为阳性对照,考察秦艽多酚对DPPH自由基及ABTS自由基的清除能力,评价其体外抗氧化活性。确定秦艽多酚的最佳提取工艺为:料液比1∶21(g∶mL)、乙醇体积分数40%、超声时间50min、超声功率140W,在此条件下,秦艽多酚得率为1.012%。秦艽多酚具有一定的体外抗氧化活性,秦艽多酚和VC抑制DPPH自由基的IC50分别为13.590μg·mL~(-1)和5.757μg·mL~(-1);秦艽多酚和VC抑制ABTS自由基的IC50分别为3.275μg·mL~(-1)和3.419μg·mL~(-1)。该提取工艺稳定、可行。     

硅藻土矿提纯改性制备聚醚吸附剂的工艺研究

采用酸对硅藻土进行提纯改性,再吸附含钾钠离子的聚醚多元醇。研究结果表明:提纯剂浓度为6.5%的氯化氢水溶液和7%的冰乙酸水溶液,提纯温度60℃,改性剂浓度为1.5%的L-酒石酸水溶液、改性时间为12 h时,改性硅藻土加入量为聚醚多元醇的3%,可使聚醚多元醇中钾钠离子含量由95μg·g~(-1)和20μg·g~(-1)分别降至0.7μg·g~(-1)和0.9μg·g~(-1)。     

枇杷果肉总多酚提取及体外抗氧化活性研究

目的:以枇杷果肉为研究对象,辅以超声波法提取总多酚。方法:通过正交试验确定最优提取工艺条件:提取温度为60℃,料液比1:35(g·mL~(-1)),乙醇体积分数60%,超声提取时间18 min,总多酚提取率达0.94%。通过1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH·)清除率的测定对枇杷果肉总多酚进行体外抗氧化活性评价。结果:枇杷果肉总多酚DPPH·清除率明显高于维生素C(Vc),且枇杷果肉总多酚DPPH·半数抑制浓度(IC50=7.04μg·mL~(-1))优于Vc(IC50=7.70μg·mL~(-1))。结论:枇杷果肉总多酚是一种天然的抗氧化活性剂。     

N-乙酰-L-半胱氨酸抗H2O2诱导人体皮肤成纤维细胞损伤的研究

研究了N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)对H2O2刺激的人体皮肤成纤维细胞(HSF)的抗细胞损伤作用。细胞存活率和细胞阳性率实验结果表明:NAC在低质量浓度(50~100 mg·L-1)时对HSF没有明显的细胞毒性;在质量浓度为200~800 mg·L-1时可促进细胞增殖;而在质量浓度较高(1 000 mg·L-1)时则明显抑制HSF生长。空白组、H2O2组、H2O2(500μmol·L-1)+NAC(100 mg·L-1)组和H2O2(500μmol·L-1)+NAC(200 mg·L-1)组细胞阳性率分别为39.90%,69.57%,45.29%和36.60%,NAC可明显降低β-半乳糖苷酶染色阳性率,抵抗由H2O2引起的细胞损伤。     

油田化学助剂中挥发性有机氯化物的定性与定量检测

建立了基于顶空-气相色谱质谱法对油田化学助剂中挥发性有机氯化物的定性鉴定与定量检测方法。通过对市场上常用的水溶性油田化学助剂的定性鉴定分析,共鉴定出了25种挥发性有机氯化物;通过优化顶空孵化温度、孵化时间以及色谱升温程序,确立了25种挥发性有机氯化物的顶空-气相色谱质谱分析方法。在优化的分析条件下,25种挥发性有机氯化物浓度在1~1 000μg·L-1范围内,线性相关系数均大于0.995,检出限和定量限分别为0.278~2.000μg·kg~(-1)和0.926~6.667μg·kg~(-1)。采用该方法对水溶性油田化学助剂中的有机氯化物进行了定量测定,并对空白样品进行了不同浓度的加标实验,加标回收率均在85%~110%之间,进一步表明了该方法对水溶性油田化学助剂中挥发性有机氯定量测定的可靠性。     

智能手机比色法测定食品和水样中亚硝酸根的研究

在弱酸性条件下,亚硝酸根和对氨基苯磺酸反应生成重氮化合物,再与盐酸萘乙二胺偶联反应,生成紫红色的偶氮染料,将显色产物点样于微孔板,用安卓智能手机在自制测试盒抓取微孔板内样斑RGB颜色空间数值进行定量分析。在最佳实验条件下,在2.0~25μg·mL~(-1)范围,颜色强度与亚硝酸根离子浓度呈线性关系,线性回归方程为I=8.91 C/μg·mL~(-1)~3.07μg·mL~(-1)(R~2=0.9988)。方法的检出限LOD和定量限分别为0.5μg·mL~(-1)和1.7μg·mL~(-1)。该方法可用于午餐肉、腊肠、榨菜、腌蒜、火腿肠等腌制食品和环境水样中亚硝酸盐的快速测定,加标回收率在95.6%~107.8%之间。该方法具有较高的灵敏度、选择性和重现性,手机测试盒携带方便,易于实现快速现场测定需求。     

吴茱萸碱的体外抗肿瘤活性研究

采用MTT法在不同的时间点检测了不同浓度的吴茱萸碱对S180肉瘤细胞、H22肝癌细胞、人源HepG2肝癌细胞的抑制情况,探讨了吴茱萸碱的体外抗肿瘤活性。结果表明,吴茱萸碱在一定浓度下对S180肉瘤细胞、H22肝癌细胞、人源HepG2肝癌细胞有明显的抑制作用,且随药物浓度的增大,抑制率逐渐增大,与正常组比较作用极其显著。吴茱萸碱作用24h时,对H22肝癌细胞的生长抑制作用较好,IC50值最小(17.49μg·mL-1);作用48h时,对S180肉瘤细胞的抑制作用相对较好,IC50值最小(17.54μg·mL-1);作用72h时,对HepG2肝癌细胞的抑制作用最好,IC50值最小(13.26μg·mL-1)。     

PM2.5经皮肤暴露和气道滴注对小鼠肝脏的不同影响

大气细颗粒物(PM2.5)可通过呼吸、皮肤接触等途径进入机体,对机体健康产生危害。为了探究PM2.5经不同暴露途径对机体产生的不同影响,将小鼠随机分为:对照组,20μg·kg~(-1)·d(-1)、100μg·kg~(-1)·d(-1)、500μg·kg~(-1)·d(-1) PM2.5皮肤暴露组和20μg·kg~(-1)·d(-1)、100μg·kg~(-1)·d(-1)、500μg·kg~(-1)·d(-1) PM2.5气道滴注组。结果表明,随着PM2.5浓度的增加,小鼠肝脏细胞空泡化程度增强,同时小鼠肝脏ROS、MDA、8-OHdG和ALT含量升高;PM2.5经皮肤暴露和气道滴注均可对小鼠肝脏产生不利影响,且随着PM2.5浓度的增加损伤越严重,这可能与其诱导的氧化应激有关,且经气道滴注产生的损伤更严重。     

染料木黄酮对光老化成纤维细胞增殖作用的影响

目的探讨染料木黄酮对光老化成纤维细胞增殖作用的影响。方法经酶消化法分离培养真皮成纤维细胞,并进行细胞传代,免疫细胞化学鉴定细胞。实验分为3组:正常细胞对照组:未经处理的真皮成纤维细胞;8-甲氧补骨脂素(8-methoxypsoralan,8-MOP)/长波紫外线(ultraviolet A,UVA)对照组:用含50 ng/ml 8-MOP的培养基避光孵育细胞24 h,再以9 J/cm2UVA照射;8-MOP/UVA+染料木黄酮(0、1.25、2.5、5、10、20μg/ml)组:用含50 ng/ml8-MOP及各浓度染料木黄酮的培养基共同孵育细胞24 h,再以9 J/cm2UVA照射24 h。MTT法检测各组细胞增殖活力,流式细胞术检测各组细胞细胞周期,光镜下观察各组细胞分裂和分裂后表型,实时荧光定量PCR法检测各组细胞中基质金属蛋白酶-1、3水平。结果皮肤成纤维细胞阳性率达99%以上;8-MOP/UVA+染料木黄酮1.25、2.5μg/ml组细胞增殖率分别为8-MOP/UVA对照组的112.6%(P0.05)和146.6%(P0.05),染料木黄酮的光保护作用随浓度的升高而增强,然而随着浓度的继续升高,细胞增值率逐渐降低,当浓度达20μg/ml时,细胞增殖率仅为8-MOP/UVA对照组的19.4%(P0.01),选择染料木黄酮的最佳保护浓度为2.5μg/ml;8-MOP/UVA对照组细胞细胞周期阻滞于S期,而8-MOP/UVA+染料木黄酮2.5μg/ml组细胞细胞周期则由S期进入G2/M期;正常细胞对照组、8-MOP/UVA组及8-MOP/UVA+染料木黄酮2.5μg/ml组分裂细胞表型占总细胞数目的比率分别为(99.7±0.58)%、(7.7±1.15)%、(57.7±3.51)%,各组间差异有统计学意义(P0.01);8-MOP/UVA+染料木黄酮2.5μg/ml组细胞基质金属蛋白酶-1、3水平均明显低于8-MOP/UVA对照组,而高于正常细胞对照组,各组间差异均有统计学意义(P0.05)。结论染料木黄酮可在一定程度上解除8-MOP/UVA所致光老化成纤维细胞的生长抑制作用。     

炮仗花类胡萝卜素含量测定及抗炎活性研究

采用超声波辅助法提取炮仗花类胡萝卜素,采用分光光度法测定其含量,通过红外光谱对其结构进行表征,并利用脂多糖(LPS)诱导的小鼠巨噬细胞(RAW264.7)炎症模型评价其抗炎活性。结果表明,最佳提取方法为:以20 mL无水乙醇为提取溶剂,超声波辅助提取20 min。β-胡萝卜素浓度(x,μg·mL~(-1))在0.996～3.486μg·mL~(-1)范围内与吸光度(y)线性关系良好,其线性回归方程为y=0.1461x-0.0207,R~2=0.9999(n=6),精密度RSD为0.19%,稳定性RSD为0.59%,重复性RSD为0.74%,平均加样回收率为100.08%,RSD为1.46%(n=9),测得炮仗花类胡萝卜素含量为31.77μg·mg~(-1)。抗炎活性实验表明,炮仗花类胡萝卜素在高浓度时呈一定细胞毒性,且浓度依赖性抑制NO生成,具有一定的抗炎活性。     

盘龙七的体外抗氧化活性研究

以维生素C为对照,采用流动注射-化学发光法、紫外可见分光光度法和荧光光谱法测定盘龙七提取物对羟基自由基(·OH)、超氧阴离子自由基(·O_2~-)、过氧化氢(H_2O_2)的清除能力,研究其体外抗氧化活性。结果表明,流动注射-化学发光法测定盘龙七水提物和醇提物在鲁米诺-碳酸盐缓冲液-邻苯三酚体系中的IC50值分别为0.17μg·mL~(-1)和0.03μg·mL~(-1),在鲁米诺-碳酸盐缓冲液-H_2O_2体系中的IC50值分别为15.06μg·mL~(-1)和0.03μg·mL~(-1);紫外可见分光光度法测定盘龙七水提物和醇提物对·OH的清除率分别为91%和98%,对·O_2~-的清除率分别为96%和97%;荧光光谱法测定盘龙七水提物和醇提物对·OH的清除率分别为92%和91%,对·O_2~-的清除率分别为97%和94%。盘龙七具有较高的抗氧化活性,其对·OH、·O_2~-、H_2O_2等3种自由基的清除作用随浓度的增加逐渐增强,呈良好的线性关系。该研究为盘龙七药材的深度开发以及抗氧化性能研究提供了理论基础。     

HPLC同时测定咽炎片中4种指标性成分的含量

建立高效液相色谱法同时测定咽炎片中木蝴蝶苷B、黄芩苷、肉桂酸和芦丁的含量。方法色谱柱为Welch Ultimate XB-C_(18)(250 mm×4.6 mm,3μm),柱温30℃,采用梯度洗脱,以甲醇为流动相A,0.35%磷酸为流动相B,流速0.6 mL·min~(-1),检测波长280nm,进样量10μL。结果木蝴蝶苷B、黄芩苷、肉桂酸和芦丁进样浓度分别在2.39～71.64μg·mL~(-1)、1.92～57.51μg·mL~(-1)、0.52～15.66μg·mL~(-1)、2.08～62.34μg·mL~(-1)的范围内,与峰面积呈良好的线性关系(r分别为0.9999、0.9998、0.9994、0.9999),平均回收率(n=6)分别为99.39%、98.98%、98.99%、99.22%。结论该方法简便,准确,重复性好,可作为评价咽炎片的质控方法。