鼬獾狂犬病病毒分离株的培养及其免疫原性

目的对分离的鼬獾狂犬病病毒BHK-21细胞适应株进行毒力和免疫原性检测,为兽用狂犬病疫苗的生产奠定基础。方法将分离获得的鼬獾狂犬病病毒野毒株JX08-45在BHK-21细胞上连续传代,采用直接免疫荧光法测定病毒滴度(TCID50);PCR法检测外源病毒和支原体。以β-丙内酯灭活病毒液,将灭活的病毒液免疫犬,采用FAVN法检测狂犬病病毒中和抗体水平,分析其免疫原性。结果鼬獾狂犬病病毒野毒株JX08-45在体外培养至130代时,病毒滴度可达1.0×107.75 TCID50/ml;未从狂犬病病毒JX08-45株中扩增出犬瘟热病毒、细小病毒、冠状病毒、腺病毒和支原体的特异性核酸;灭活的病毒液接种犬后产生的中和抗体可持续1年以上,且均在0.5 IU/ml以上。结论鼬獾狂犬病病毒野毒株JX08-45经BHK-21细胞传代适应性较好,病毒滴度较高,且具有较好的免疫原性,已具备制备疫苗的基本条件。     

狂犬病病毒CVS-11株全基因序列测定及分析

目的对狂犬病病毒标准攻击毒株CVS-11株进行全基因序列测定,并就主要抗原位点与我国现用狂犬病疫苗生产毒株进行比较,评价CVS-11株作为抗狂犬病病毒中和抗体检测毒株的适用性。方法将CVS-11全基因组RNA分成8段进行RT-PCR扩增,分别将产物克隆入pGEM-TEasy载体中,测定全序列;用DNAStar软件包中的相应软件对基因全序列进行分析,并与5株生产用狂犬病病毒(CTN-1、aG、FluryLEP、PM和PV)进行基因比对分析和主要抗原位点比较。结果 CVS-11株基因组全长11927bp,其结构基因排列与已知其他狂犬病病毒相同,但G和M基因的非编码区偏长。CVS-11株与我国现用疫苗株的序列同源性在84.3%～99.5%之间。以相对保守的N基因作进化树分析,CVS-11株与PM株同源性最高,与CTN-1和aG株的亲缘关系较其他疫苗株远。各毒株G蛋白抗原位点存在一定的氨基酸差异。结论 CVS-11株与我国现用疫苗株具有较高的同源性;CVS-11株与不同疫苗株G蛋白抗原位点的差异可能对不同疫苗免疫效果评价产生不同程度的影响。     

3株我国狂犬病病毒街毒株在细胞和乳鼠脑内的培养及生长特性

目的比较3株来自我国不同地区的狂犬病病毒街毒株在细胞和乳鼠脑内的生长特性,为建立狂犬病病毒感染模型奠定基础。方法分别通过乳鼠脑内接种和细胞培养法进行连续传代,测定不同代次SXYQ、YN01和GDMMD57株狂犬病病毒街毒株的病毒滴度,计算半数细胞感染量(TCID50)。结果 SXYQ、YN01和GDMMD57株病毒乳鼠脑内接种传代至10代,病毒滴度随传代次数的增加,呈上升趋势,至第8代后,病毒滴度趋于稳定,分别为105.85、105.63和105.97 TCID50/g,不同毒株间病毒滴度存在差异。SXYQ、YN01和GDMMD57株病毒接种N2a细胞后,随着传代次数的增加,病毒对细胞的适应性不断增强,病毒滴度呈上升趋势,至第15代后,病毒滴度趋于稳定,不同毒株间病毒滴度存在差异;第20代SXYQ株病毒的滴度在感染后2.5 d达到峰值(106.80 TCID50/ml),YN01和GDMMD57株病毒滴度在感染后3 d达到峰值(均为107.30 TCID50/ml)。结论 3株病毒在细胞和乳鼠脑内经连续传代后均能达到较高滴度,可用于狂犬病病毒感染模型的建立及新型疫苗的研究。     

狂犬病病毒糖蛋白基因重组逆转录病毒的构建及其免疫效果

目的构建狂犬病病毒SRV9株糖蛋白(GP)基因的重组逆转录病毒,并检测其对小鼠的免疫效果。方法酶切含狂犬病病毒SRV9株GP基因的质粒pVAX-G,将其克隆至逆转录病毒载体,构建重组质粒pLNCX-G,以脂质体介导转染包装细胞系PA317,筛选阳性细胞克隆并扩大培养。将病毒颗粒感染BHK细胞,采用PCR和RT-PCR法检测GP基因在细胞中的整合及转录,在NIH3T3细胞上测定病毒滴度。以重组逆转录病毒免疫昆明小鼠,通过荧光抗体病毒中和试验(FAVN)法检测小鼠血清抗狂犬病病毒中和抗体效价。结果所构建的重组质粒pLNCX-G经酶切鉴定正确;狂犬病病毒GP基因已整合至BHK细胞基因组中并能正常转录;病毒滴度最高可达1.2×104CFU/ml;肌肉和腹腔注射均可使部分小鼠产生抗狂犬病病毒中和抗体,其阳转率分别为6.7%和86.7%,有效保护率分别为0和76.9%。结论已成功构建了狂犬病病毒SRV9株GP基因的重组逆转录病毒,并可诱导小鼠产生一定的中和抗体,为进一步研究奠定了基础。     

乙型脑炎减毒活疫苗病毒SA14-14-2株经三带喙库蚊胸腔接种后的生物学和分子生物学特性

目的研究乙型脑炎病毒减毒活疫苗SA14-14-2株经三带喙库蚊胸腔接种繁殖后的生物学和分子生物学特性,进一步评价该株病毒的稳定性和安全性。方法将乙型脑炎病毒减毒活疫苗SA14-14-2株胸腔接种的三带喙库蚊研磨,离心收集上清液,接种于BHK21细胞中培养,得到SA14-14-2M1C1病毒液。应用空斑形成单位法测定病毒滴度,再进行小鼠脑内毒力测定和乳鼠脑内回传后毒力返祖试验。提取病毒RNA,RT-PCR扩增E基因片段,测序后与SA14-14-2原株的E基因序列进行比较分析。结果SA14-14-2M1C1病毒液滴度达1.4×107PFU/ml,小鼠脑内毒力测定结果无小鼠发病死亡,乳鼠脑内传代对小鼠的脑内致病力很低,毒力为1.9LgLD50/0.03ml,小于《中国药典》规定的3.0LgLD50,且皮下注射未见小鼠发病死亡。扩增出的E基因片段序列与原株相比较,只有E区1340位一个核苷酸的变化A→G,导致E447位1个氨基酸的改变D(Asp)→G(Gly),此差异位点不是SA14-14-2株发生基因变异的8个位点之一。结论SA14-14-2疫苗株病毒经三带喙库蚊胸腔接种繁殖后,其生物学(弱毒)特性和基因特征(E区8个氨基酸突变)未发生改变,进一步证实了该病毒的稳定性。     

乙型脑炎病毒SA_(14)-14-2减毒疫苗株的生物学和基因稳定性

目的研究乙型脑炎病毒(JEV)SA14-14-2减毒疫苗株传代过程中的生物学和基因稳定性,为疫苗的安全性和免疫原性提供依据。方法将JEVSA14-14-2减毒疫苗株PHKC7代病毒在原代地鼠肾细胞(PHKC)上连续传代,检测各代次病毒的培养特性以及第8、12、17和22代病毒的安全性及免疫原性;对起止代次病毒(PHKC8和22代)进行全基因组序列测定,对中间代次病毒(PHKC12和17代)的结构蛋白基因进行测序,并与基因库乙脑病毒SA14-14-2株(D90195)比较。结果各代次病毒产生的细胞病变基本一致,病毒滴度在17代前较稳定;在BHK21细胞上形成的蚀斑形态一致;小鼠脑内的致病力未发生变化,乳鼠传代返祖试验高代次病毒毒力有升高趋势。8、12、17和22代病毒免疫小鼠后,对P3强毒攻击均具有保护作用。E蛋白核苷酸和氨基酸序列,PHKC8代与D90195完全一致;而PHKC12、17和22代出现单个碱基(第2142或2143位)突变,导致E389氨基酸改变(D→N或D→A),但并非回复突变。4个代次病毒的PrM-C区结构蛋白基因均未发生变化。PHKC8、22代病毒的其他核苷酸突变发生在基因组非结构蛋白区和3′端非编码区;全序列PHKC8和22代与D90195比较,发现7～8个核苷酸不同,导致3～4个氨基酸的差异,核苷酸和氨基酸的同源性分别大于99.93%和99.88%,且以上突变不存在于明确的相关减毒位点上。结论JEVSA14-14-2减毒疫苗株在PHKC上连续传15代,仍保持高度的生物学和基因稳定性,疫苗生产用病毒控制在10代以内较为安全。     

吉林省2011年手足口病死亡病例肠道病毒71型分离株全基因组基因特征分析

目的分析吉林省2011年手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)死亡病例标本中分离获得的肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)毒株全基因组基因特征。方法采用分段RT-PCR法对2011年吉林省HFMD死亡病例EV71分离株JL2011-56全基因组进行扩增和测序。利用Clustal X2和MEGA5软件构建分离株JL2011-56与Gen Bank中27株参考株的全基因组序列和VP1区全基因组序列的进化树,分析Jl2011-56株的流行病学特征;同时与Gen Bank中12株C4a基因亚型参考株进行全基因组核苷酸和氨基酸序列的同源性分析。结果 JL2011-56分离株属于C4a亚型,核苷酸序列和氨基酸序列与山东分离株SDLY107(JX244186.1)同源性最高,分别为99.2%和99.5%,与EV71原型株Br Cr的同源性分别为79.9%和95.7%。结论 JL2011-56分离株与山东株亲缘关系较近,可能存在共同的与中枢神经毒力相关的氨基酸突变位点。     

狂犬病病毒减毒株CTN-181的免疫原性

目的评价狂犬病病毒减毒株CTN-181的免疫原性。方法用不同病毒滴度的CTN-181株病毒对小鼠分别进行口腔或肌肉免疫,14 d后,分别用狂犬病病毒CVS株进行脑内或肌内攻毒,14 d后,计算小鼠的免疫保护力;同时于免疫后14、21和30 d,采用RFFIT法检测小鼠血清抗狂犬病病毒中和抗体水平。结果两种途径免疫的小鼠均产生了较强的保护作用和较高的中和抗体水平。口腔免疫后脑内和肌内攻毒的50%保护剂量分别为1.4×105和1.4×104PFU/ml;肌肉免疫后脑内和肌内攻毒的50%保护剂量分别为1.4×106和1.4×105PFU/ml。小鼠口腔免疫CTN-181病毒量≥1.4×105PFU/ml 14 d后,即可产生有效的保护,至30 d时,1.4×106和1.4×107PFU/ml剂量组中和抗体水平达20 IU/ml以上;肌内免疫产生的中和抗体水平较低。结论 CTN-181减毒株具有良好的免疫原性,以较低病毒量免疫小鼠即可产生高水平的中和抗体和保护作用。     

中国狂犬病疫苗株CTN-1、PV-2061全基因组序列分析

目的对中国狂犬病疫苗株CTN-1、PV-2061全基因组序列进行分析。方法通过RT-PCR法获取CTN-1和PV-2061株主种子批的全基因组序列,与国内分离的全基因组序列进行比对,并对狂犬病病毒主要抗原进行比对分析。结果 CTN-1和PV-2061株具有较高的同源性,CTN-1株与我国街毒株的亲缘关系更近,符合作为疫苗候选株的要求。PV-2061株在氨基酸序列中具有独特的突变,推测与中和抗体的产生相关。结论对中国狂犬病疫苗株CTN-1、PV-2061全基因组进行了多重比对,为研制安全高效的狂犬病疫苗奠定了理论基础。     

新型狂犬病病毒中和抗体检测方法的建立

目的建立一种安全、快速、经济的新型狂犬病病毒中和抗体的检测方法。方法在狂犬病病毒弱毒株HEP-Flury基因组Ψ区插入增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein eGFP)基因,利用反向遗传技术,拯救重组病毒rHEP-eGFP,分别采用荧光显微镜观察、直接免疫荧光染色鉴定及电镜观察等方法对rHEP-eGFP病毒进行鉴定;分别绘制rHEP-eGFP和亲本毒株HEP-Flury的生长动力学曲线;将rHEP-eGFP在BHK-21细胞中连续传代9次,测定各代次rHEP-eGFP的滴度,荧光显微镜下观察eGFP的表达;采用TCID50法检测狂犬病病毒标准攻击毒株CVS-11和rHEP-eGFP的毒力;以rHEP-eGFP病毒为抗原,建立新型荧光抗体病毒中和试验(fluorescent antibodyvirus neutralization,FAVN)-eGFP,对25份犬血清的抗体效价进行测定,并与标准FAVN检测结果进行比较。结果经荧光显微镜观察、直接免疫荧光染色鉴定和电镜观察表明,成功拯救出rHEP-eGFP病毒;重组病毒rHEP-eGFP与亲本病毒HEP-Flury的生长特性相似;rHEP-eGFP连续传代9次,均能稳定表达eGFP;CVS-11的毒力为108TCID50/ml,rHEP-eGFP的毒力为107.3TCID50/ml;FAVN-eGFP与FAVN测定25份犬血清抗体效价的结果具有良好的一致性。结论建立的新型狂犬病病毒中和抗体检测方法(FAVN-eGFP)准确度高,特异性好。     

亚洲西尼罗河病毒的系统发育及E蛋白分子进化特征分析

目的 分析亚洲区西尼罗河病毒(West Nile virus,WNV)的流行情况,探讨其系统发育和分子进化特征.方法 从NCBI数据库中分别获取亚洲区流行的WNV 全基因组序列和E 蛋白序列,进行比对和同源性分析后构建系统进化树,分析来自不同株型病毒的结构蛋白E 的核苷酸和氨基酸的突变率,进一步找出氨基酸的替代位点.结...     

狂犬病病毒糖蛋白富集表位基因克隆及其在原核系统中的表达

目的构建狂犬病病毒标准强毒株(CVS-24)糖蛋白富集表位基因原核表达系统。方法通过RT-PCR扩增CVS-24株糖蛋白两段表位富集区基因,并将其克隆至载体pET-28a(+),构建重组表达质粒pET-G1和pET-G2,转化大肠杆菌Rosetta,IPTG诱导表达。表达产物分别经12%SDS-PAGE和Western blot检测。结果大肠杆菌可高效表达目的基因,所表达的蛋白可被狂犬病病毒标准阳性血清所识别。经薄层扫描分析,目的蛋白表达量可占菌体总蛋白的42%(G1)和34%(G2)。结论已成功构建了狂犬病病毒标准强毒株(CVS-24)糖蛋白富集表位基因原核表达系统,所表达的目的蛋白具有良好的免疫反应性,有可能作为检测狂犬病病毒血清抗体的候选基因。     

狂犬病-干扰素联合制剂的免疫原性及治疗作用

目的 研究狂犬病疫苗和干扰素组成的联合制剂的免疫原性和暴露后的治疗作用。方法 将人用精制Vero细胞狂犬病疫苗（PVCRV）和基因工程干扰素（rHuIFNs）按一定比例配制成联合制剂,进行安全和效力试验,以PVCRV-HuIFNs和PVCRV分别免疫小鼠,在第1针免疫后9和18d,采用快速免疫荧光灶抑制试验,检测小鼠中和抗体水平,用MTT法检测特异的细胞毒作用（CTLs）。一定剂量的狂犬病病毒标准攻击株（CVS）肌肉感染小鼠后,分别用PVCRV-HuIFNs和PVCRV在0、3和7d皮内免疫感染小鼠,分别在末次免疫的第7和21d进行CTLs试验,并在30d内观察小鼠发病和死亡情况。结果 联合制剂安全有效,效价高于单一疫苗,在暴露前诱导的中和抗体水平与单一疫苗比较差异有显著意义;在暴露前后激发的CTL,联合制剂均高于单一疫苗,差异有显著意义。结论 联合制剂可用于狂犬病暴露后的免疫治疗。     

甲型肝炎灭活疫苗的研制

甲型肝炎病毒8347毒株在人二倍体细胞（2BS株）中增殖4周，收获的病毒液经冻融、超声、过滤．德液用1：4000福尔马林、37℃灭活6天以上制成灭活疫苗，病毒灭括前的滴度（TCID50／ml）至少可达6．5左右．疫苗免疫豚鼠和小鼠三针后，75％～100％的动物甲肝抗体阳转。经超声处理后疫苗免疫原住可大幅度提高，三针后动物血清中的中和抗体效价可达1：20以上．     

狂犬病病毒糖蛋白基因重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因重组慢病毒表达载体,并进行鉴定。方法将狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因克隆至慢病毒载体pLVX-ZsGreen-IRES上,筛选阳性重组克隆。将质粒pLVX-ZsGreen-IRES-SRV9G、包膜质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2共转染293T包装细胞系,通过荧光显微镜观察报告基因表达情况。收集上清,经浓缩后接种293T细胞,进行重组慢病毒感染细胞的鉴定;用限制性内切酶切除质粒pLVX-ZsGreen-IRES-SRV9G绿色荧光蛋白基因,采用直接免疫荧光试验检测狂犬病病毒糖蛋白的表达情况。结果重组慢病毒表达载体经酶切和测序证明构建正确。荧光显微镜下可见重组慢病毒感染的293T细胞有大量绿色荧光出现,病毒滴度为3×107 IU/ml;直接免疫荧光检测表明,糖蛋白基因在293T细胞内获得有效表达。结论成功构建了狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因重组慢病毒载体,为狂犬病基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

轮状病毒P[8]G1株在KMB17细胞上的适应性及其免疫原性

目的研究轮状病毒P[8]G1株(Wa株)在人胚肺二倍体细胞KMB17上的适应性及其免疫原性。方法将人轮状病毒P[8]G1株(Wa株)在KMB17细胞上进行适应培养,连续传代10代,免疫荧光法检测病毒的增殖情况,免疫胶体金法检测病毒的抗原性,微量滴定法检测病毒的感染性滴度,并进行病毒基因组稳定性及免疫原性检测。结果轮状病毒Wa株在KMB17细胞上连续传代后,细胞病变逐渐增快;抗原性逐渐增强;至第10代达增殖高峰,病毒滴度达4.25CCID50/ml;在传代过程中,病毒基因组核酸带型保持一致;经皮下和口服2种途径免疫小鼠,血清抗体效价均达1:8192。结论轮状病毒Wa株可在KMB17细胞上稳定增殖,病毒保持了毒株的基本生物学特性,且具有较好的免疫原性。