轮状病毒P[8]G1株在KMB17细胞上的适应性及其免疫原性

目的研究轮状病毒P[8]G1株(Wa株)在人胚肺二倍体细胞KMB17上的适应性及其免疫原性。方法将人轮状病毒P[8]G1株(Wa株)在KMB17细胞上进行适应培养,连续传代10代,免疫荧光法检测病毒的增殖情况,免疫胶体金法检测病毒的抗原性,微量滴定法检测病毒的感染性滴度,并进行病毒基因组稳定性及免疫原性检测。结果轮状病毒Wa株在KMB17细胞上连续传代后,细胞病变逐渐增快;抗原性逐渐增强;至第10代达增殖高峰,病毒滴度达4.25CCID50/ml;在传代过程中,病毒基因组核酸带型保持一致;经皮下和口服2种途径免疫小鼠,血清抗体效价均达1:8192。结论轮状病毒Wa株可在KMB17细胞上稳定增殖,病毒保持了毒株的基本生物学特性,且具有较好的免疫原性。     

Ⅰ型登革病毒D06063株人二倍体细胞适应株的筛选及纯化

目的筛选Ⅰ型登革病毒(Dengue virus,DV)中国株D06063人胚肺二倍体细胞KMB17的适应株,经噬斑纯化后,分析其生物学特性。方法将Ⅰ型DV中国株D06063在C6/36细胞上进行扩增,采用微量滴定法测定病毒的感染性滴度;RT-PCR法鉴定DV型别;病毒连续以4.0 MOI的量感染KMB17细胞,传代至病毒完全适应在细胞内扩增,再连续传10代,筛选出KMB17细胞适应株,并进行3轮噬斑纯化;免疫荧光法检测纯化病毒,电镜观察病毒颗粒的形态。结果在C6/36细胞上扩增的Ⅰ型DV D06063株的滴度为6.0 lg CCID50/ml,经RT-PCR可扩增出511 bp的DV特异基因和482 bp的Ⅰ型DV型特异性基因;病毒感染KMB17细胞后,可产生明显的细胞病变,至第10代,病毒的感染性滴度达峰值,为6.75 lg CCID50/ml;纯化的病毒经免疫荧光检测呈阳性,电镜观察显示病毒形态正常。结论成功筛选出传代稳定性好、病毒扩增量高的Ⅰ型DVKMB17细胞适应株,纯化的病毒株保持了原始毒株的基本生物学特性。     

轮状病毒P[2]G3株在人二倍体细胞KMB17上的适应性

目的探讨轮状病毒P[2]G3株在人二倍体细胞KMB17上的适应性。方法轮状病毒P[2]G3株在猴肾细胞MA104上经蚀斑筛选纯化后,得到的克隆以不同MOI接种至人二倍体细胞KMB17上。用微量滴定法与蚀斑法平行检测病毒滴度,用免疫荧光法检测病毒的增殖情况,最后进行病毒基因组稳定性检测。结果经MA104细胞培养的轮状病毒P[2]G3株在人二倍体细胞KMB17上可产生明显的细胞病变(CPE),但病变出现的时间随病毒传代次数的增加而延迟,抗原性也逐渐减弱。通过蚀斑筛选纯化得到的克隆病毒,可在KMB17细胞上稳定地增殖。以0.05MOI病毒量接种可产生稳定的CPE,时间为72～96h。连续传代至第10代,病毒滴度达105.5PFU/ml,病毒基因组稳定。结论轮状病毒P[2]G3株在人二倍体细胞KMB17上表现出毒力及增殖能力的衰退;经蚀斑筛选纯化可获得毒力较强的病毒株,并在KMB17细胞中稳定复制、增殖。     

悬浮吸附法在人胚肺二倍体细胞(KMB17)中培养脊髓灰质炎减毒活疫苗病毒

目的研究在KMB17细胞中培养脊髓灰质炎减毒活疫苗病毒及其用于生产疫苗的可行性。方法应用悬浮吸附和添加血清的方法,在KMB17细胞上培养SabinⅠ、Ⅱ、中Ⅲ2型病毒,用微量法检测病毒滴度。结果在悬浮吸附加10%血清培养条件下,SabinⅠ滴度可达8.125 LgCCID50,SabinⅡ滴度可达7.5 LgCCID50,中Ⅲ2滴度可达7.583 LgCCID50。与传统的猴肾原代细胞培养的病毒滴度比较,差异无显著意义(P>0.05)。结论可进一步研究应用KMB17细胞进行疫苗生产。     

人二倍体细胞(2BS株)细胞库的建立及生物学特性鉴定

目的建立人二倍体细胞(2BS株)主细胞库和工作细胞库。方法将人二倍体细胞(2BS株)扩大培养后冻存,建立主细胞库和工作细胞库,采用台盼蓝染色计数细胞,计算细胞活力,并进行染色体、外源病毒因子、微生物污染、致瘤性的检测及鉴别试验。将全面检定合格的工作细胞库细胞分别接种至T75一次性培养瓶、3 L玻璃转瓶和10层细胞工厂,观察细胞形态;将水痘病毒分别按0.010 5、0.012 8、0.018 8 MOI接种至T75一次性培养瓶、3 L玻璃转瓶和10层细胞工厂上的单层细胞,收获病毒原液,检测病毒滴度。结果主细胞库细胞活力为94.1%,工作细胞库细胞活力为94.4%;1 000个处于分裂相时期的细胞的核型分析结果均在《中国药典》三部(2010版)人二倍体细胞染色体分析标准的规定范围内;细胞上清液和裂解液中人外源病毒因子检测结果均为阴性,符合《中国药典》三部(2010版)规程要求;细胞均贴壁,成纤维细胞形态,种属鉴别为人细胞B型;细胞库未被细菌、真菌、病毒及支原体污染,也未出现致瘤性。建立的细胞库在3种培养器皿中均可在工艺要求时间内生长为单层,单位面积活细胞浓度在(2.01~2.59)×105个/cm2之间,收获的病毒滴度在5.0~5.25 lg PFU/ml之间,符合成都生物制品研究所有限责任公司《水痘减毒活疫苗制造及检定规程》要求。结论建立了人二倍体细胞(2BS株)主细胞库和工作细胞库,为2BS细胞应用于水痘减毒活疫苗的研发和生产提供细胞资源和理论依据。     

轮状病毒P[2]G3株在人二倍体细胞KMBl7上的适应性

目的 探讨轮状病毒P[2]G3株在人二倍体细胞KMB17上的适应性.方法 轮状病毒P[2]G3株在猴肾细胞MA104上经蚀斑筛选纯化后,得到的克隆以不同MOI接种至人二倍体细胞KMB17上.用微量滴定法与蚀斑法平行检测病毒滴度,用免疫荧光法检测病毒的增殖情况,最后进行病毒基因组稳定性检测.结果 经MA104细胞培养的轮状病毒P[2]G3株在人二倍体细胞KMB17上可产生明显的细胞病变(CPE),但病变出现的时间随病毒传代次数的增加而延迟,抗原性也逐渐减弱.通过蚀斑筛选纯化得到的克隆病毒,可在KMB17细胞上稳定地增殖.以0.05 MOI病毒量接种可产生稳定的CPE,时间为72～96 h.连续传代至第10代,病毒滴度达105.5PFU/ml,病毒基因组稳定.结论 轮状病毒P[2]G3株在人二倍体细胞KMB17上表现出毒力及增殖能力的衰退;经蚀斑筛选纯化可获得毒力较强的病毒株,并在KMB17细胞中稳定复制、增殖.     

甲肝病毒YN5D株在人二倍体细胞系W2上的适应性

目的研究甲肝病毒YN5D株在人二倍体细胞Walvax-2(W2)上的传代适应性,并确定其在W2细胞上培养的最适条件。方法将甲肝病毒YN5株P23代采用混合吸附的方式接种于T225细胞培养瓶,连续传至30代,检测各代次YN5D株病毒的抗原滴度及感染性滴度;将甲肝病毒YN5D株P29代以不同的MOI接种W2细胞,以最佳MOI接种细胞,确定最佳收毒时间;建立甲肝病毒YN5D株三级种子库,并进行检定。结果甲肝病毒YN5株连续传至30代,抗原滴度及感染性滴度均保持在10 240 EU/mL和7.00 lgCCID_(50)/mL以上;当接毒比例为0.5 MOI时,抗原滴度及感染性滴度均达到最高;当培养至24~28 d时,抗原滴度及感染性滴度均达到最高,分别为2 560 EU/mL和7.24 lgCCID_(50)/mL。三级毒种库各项检定结果均符合《中国药典》三部(2015版)要求。结论确定了甲肝病毒YN5D株在人二倍体细胞系W2上的传代适应性,并优化了细胞工厂的培养条件,为人二倍体甲肝疫苗临床申报样品的制备工艺奠定了基础。     

甲型肝炎病毒SYX1株在人二倍体细胞MRC-5上的适应性及遗传稳定性

目的 探讨甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)SYX₁株在人二倍体细胞MRC-5上的适应性及遗传稳定性。方法 将来源于甲肝患者粪便的HAV SYX₁株接种至MRC-5细胞,连续传代至第28代,检测第1～26代病毒的抗原含量和病毒滴度;镜下观察第6代病毒的形态,并检测其理化性质。取第13～15代病毒进行病毒增殖动态研究,确定病毒增殖高峰期。选择第8、12、18、20、22、25、26和28代病毒,提取病毒基因组RNA进行序列测定,分析其遗传稳定性。建立HAV SYX₁株主种子批和工作种子批,按照《中国药典》三部(2020版)要求进行检定。结果 HAV SYX₁株在MRC-5细胞上连续传至8代后,抗原含量稳定在160～320 EU/mL之间,病毒滴度维持在7.3～8.3 lgCCID₅₀/mL;病毒颗粒有空心和实心两种类型,直径为27～32 nm,呈球形,无包膜,表面无突起;可耐受低pH及乙醚。确定病毒增殖高峰期为10 d,抗原含量达160 EU/mL以上,病...     

流行性乙型脑炎病毒在二倍体细胞上的适应性

目的研究流行性乙型脑炎病毒在二倍体(2BS)细胞上的传代适应性,确定在2BS细胞上培养乙脑病毒的条件和方法。方法通过病毒毒力和免疫原性检测,观察在不同培养条件下乙脑病毒在2BS细胞上的增殖情况。结果pH值在7·4～7·6之间、人血白蛋白含量为0·2%、病毒稀释度为1:1000时,病毒维持液培养的病毒滴度最高。在2BS细胞上传50代的病毒滴度均在7·0logLD50以上,且差异无显著意义。连续传代后病毒的免疫原性下降。结论建议用于建立病毒种子库的流行性乙型脑炎病毒,在2BS细胞上传代不应超过3代。     

3种培养方法培养脊髓灰质炎病毒过程中病毒繁殖特性比较

目的比较3种培养方法培养脊髓灰质炎病毒过程中病毒繁殖动力学特性。方法分别用悬浮吸附法、静止吸附法和非吸附法培养脊髓灰质炎病毒(SabinⅠ、Ⅱ、中Ⅲ2型),分别在间隔12h时取样,至细胞完全病变或96h,用微量细胞病变法检测感染性滴度,绘制病毒一步生长曲线。结果悬浮吸附法病毒增殖快,2∶1分种率时,60h细胞完全病变,滴度最高,分别为SabinⅠ型9.000LgCCID50/ml、SabinⅡ型8.500LgCCID50/ml、中Ⅲ2型8.750LgCCID50/ml;1∶1分种率时,SabinⅠ型在60h完全病变,滴度为8.875LgCCID50/ml,SabinⅡ型和中Ⅲ2型在70h完全病变,滴度分别为8.000LgCCID50/ml和8.125LgCCID50/ml;静止吸附法1与静止吸附法2差异不明显,96h时,仍有约10%~20%细胞未发生病变,静止吸附法1滴度为SabinⅠ型7.125LgCCID50/ml、SabinⅡ型6.500LgCCID50/ml、中Ⅲ2型6.375LgCCID50/ml,静止吸附法2滴度为SabinⅠ型7.250LgCCID50/ml、SabinⅡ型6.875LgCCID50/ml、中Ⅲ2型7.000LgCCID50/ml;非吸附培养法,在96h,有20%细胞未发生病变或病变程度较轻。滴度为SabinⅠ型7.250LgCCID50/ml、SabinⅡ型5.625LgCCID50/ml、中Ⅲ2型6.375LgCCID50/ml。在12h,悬浮吸附法(分种率2∶1)培养三型病毒滴度已分别达到6.000、6.125和6.250LgCCID50/ml,略高于悬浮吸附法(分种率1∶1)达到的值,而静止吸附法及非吸附法培养至36h,病毒滴度才达到相近的水平。结论在3种培养方法中,悬浮吸附法明显优于静止吸附法和非吸附法。     

人二倍体细胞株KMB-17细胞代次检测模型的建立

目的建立人二倍体细胞株KMB-17细胞代次与端粒长度之间的关系模型。方法将KMB-17细胞按照1∶2的分种率连续传代,以传代后再长满瓶为1代,取第22、25、28和30代KMB-17细胞,提取基因组DNA,采用实时荧光定量PCR法检测端粒重复拷贝数(T)及单个拷贝基因(S),以T/S值表示不同代次KMB-17细胞的端粒长度。结果第22、25、28和30代KMB-17细胞的T/S值分别为1 224±48、818±86、671±118和505±41,T/S值随细胞代次的增加而降低。结论 KMB-17细胞代次与细胞端粒长度间具有明显相关性,即细胞代次越高,细胞端粒长度越短。     

肠道病毒71型Lanzhou01株的分离及其生物学特性

目的对肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)Lanzhou01株进行分离、鉴定,并分析其生物学特性,为EV71疫苗候选毒株的筛选奠定基础。方法从兰州市手足口病患者的粪便样本中分离EV71,经蚀斑克隆传代后,RT-PCR法检测其特异性;Vero细胞甲基纤维素蚀斑法分析病毒的毒力;克隆病毒的VP1基因,进行序列测定及分析;扫描电镜观察病毒的形态;以不同的MOI接种Vero细胞,观察细胞病变,并绘制病毒的增殖曲线;连续传代,分析VP1基因和氨基酸序列,并测定毒力,检测其遗传稳定性。结果经细胞传代和蚀斑克隆,获得增殖性能稳定的分离株,RT-PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析可见约250bp的特异性条带;经VP1基因测序与进化树鉴定为EV71,其与浙江、深圳等地的EV71分离株的核苷酸序列同源性均大于99%,属于C4基因亚型;电镜下观察病毒颗粒为球形,直径20～30nm;该病毒在Vero细胞上培养后产生典型的细胞病变,毒力为6.8LgPFU/ml;经Vero细胞连续传30代,不同代次的病毒VP1基因序列的核苷酸序列同源性大于或等于99.6%,氨基酸序列几乎没有明显变异,毒力也无明显改变。结论已成功分离1株EV71,其生物学特性良好,为灭活疫苗的研制及疫苗候选株的筛选奠定了基础。     

轮状病毒基因重配株LD_9(G_2型)Vero细胞适应株的选育及其生物学特性

目的探讨轮状病毒基因重配株LD(9G2型)在Vero细胞上的传代适应性,选育高滴度的适应株。方法将3个轮状病毒基因重配株LD9克隆株(G2型)(LD9-1、LD9-2、LD9-3)在Vero细胞上分别以0.05、0.10、0.15和0.20MOI传代,选育出1株Vero细胞适应株,并确定其最适MOI,然后在Vero细胞上连续传代15代,检测病毒滴度及基因组核酸带型,采用nestRT-PCR法扩增其VP7基因。取第8、10、13代适应株病毒,以0.10MOI接种于Vero细胞,观察病毒的增殖动态。结果选育出的LD9-2株以0.10MOI接种Vero细胞可产生明显的细胞病变(CPE),病毒滴度随传代次数的增加先下降后升高,至4代时最低,9代后稳定于6.75lgCCID50/ml左右;连续传代15次,病毒基因组核酸带型均与原始毒株一致,且均能扩增出502bp的VP7基因。LD9-2株病毒增殖高峰期均出现在第7～8天,病毒滴度为6.00～7.00lgCCID50/ml。结论轮状病毒基因重配株LD9株(G2型)经Vero细胞适应性培养,获得了病毒表达量高且能稳定传代的疫苗候选株。     

麻疹病毒长-47纯化株(2BS细胞)毒种库的建立

目的建立以人胚肺二倍体细胞(2BS)为基质的麻疹病毒长-47纯化株毒种库。方法将麻疹病毒长-47纯化株毒种(CEC)主代主种子批适应于2BS细胞,传至第4代和第8代,分别作为主种子批及工作种子批,对毒种进行鉴别试验、无菌试验、支原体检查、外源因子检查和病毒滴度检测,并对主种子批毒种进行猴体神经毒力试验和猴体免疫原性检测。将毒种连续传代,观察各代次病毒的收获时间,并测定病毒滴度,分析毒种的传代稳定性;将主种子批和工作种子批分别置于-20和-70℃保存,不同时间取样,检测病毒滴度,分析毒种保存温度稳定性;选取4个代次毒种(D4、D8、D15、D19)提取病毒核酸,扩增H基因序列,分析H基因在传代过程中的遗传稳定性。结果主种子批和工作种子批毒种鉴别试验、无菌试验、支原体及外源因子检查均符合《中国药典》三部(2010版)要求,病毒滴度分别为5.88和6.00 log CCID50/ml,主种子批毒种具有良好的安全性及免疫原性。麻疹病毒长-47纯化株毒种适应于2BS细胞后,收获病毒时间一般在6~7 d,病毒滴度稳定在5.5~6.5 log CCID50/ml之间。主种子批和工作种子批病毒于-20和-70℃保存10个月,病毒滴度无明显变化。D4~D19代病毒无核苷酸发生改变,与麻疹病毒Chang-47(Gen Bank登录号:EF033071)比对结果显示,D4~D19代病毒核苷酸序列21 nt由G→C,属于同义突变,同源性达99.9%。结论建立了麻疹病毒长-47纯化株(2BS)毒种库,并按照《中国药典》三部(2010版)要求进行了全面检定,为制备以人胚肺二倍体细胞为基质的麻疹减毒活疫苗奠定了基础。     

一株鸡源乳酸菌FCL67的鉴定及其生物学特性

目的对一株鸡源乳酸菌FCL67进行鉴定,并检测其生物学特性。方法通过形态观察、对酸及胆盐的耐受性、生长特性及DNA的检测,对鸡源乳酸菌FCL67进行鉴定。采用单因素试验设计,将180只健康肉雏鸡随机分为试验组Ⅰ(饲喂基础日粮)、试验组Ⅱ(基础日粮+0.01%黄霉素)及试验组Ⅲ(基础日粮+0.2%FCL67菌制剂),饲喂28 d,于第2周和第4周计算各组肉雏鸡的平均日增重(average daily gain,ADG)及料重比(food conversion rate,FCR),并取盲肠内容物,进行10倍稀释后,经平板涂布法测定盲肠内乳酸菌和大肠埃希菌数量。结果乳酸菌FCL67为球菌,耐酸耐胆盐消化,生长迅速、产酸能力强、为Enterococcus faecium(粪肠球菌)。日粮中添加FCL67菌制剂可明显提高肉雏鸡的ADG(P0.05),显著降低FCR(P0.05),可显著增加肉雏鸡盲肠中乳酸菌数量(P0.05),且对盲肠中大肠埃希菌数量有明显抑制作用(P0.05)。结论鸡源乳酸菌制剂对肉雏鸡的生长具有促进作用,且有同于抗生素的抑菌作用,但乳酸菌制剂更具有安全优势,可替代抗生素作为鸡用微生态制剂应用。     

白血病K562细胞株中CD34~+细胞群的分离及其生物学特性

目的分离白血病K562细胞株中CD34+细胞群,并分析其生物学特征,为从干细胞角度治疗白血病提供实验依据。方法采用免疫磁性分选法分离K562细胞中CD34+细胞群,台盼蓝拒染法检测细胞活性;流式细胞术检测CD34+细胞比例及细胞周期;单细胞克隆培养检测CD34+细胞自我更新能力;RT-PCR法检测CD34+细胞分化相关指标促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony stimulatingfactor,GM-CSF)基因mRNA的转录水平;并检测CD34+细胞耐药蛋白P-gp(P-glycoprotein)的表达。结果免疫磁性分选法可有效分离出CD34+细胞群,细胞活性为99%～100%;分离的CD34+细胞含量占细胞总数的78.5%～85.3%,细胞大部分处于静止状态,G0/G1期细胞比例达80%左右,显著高于分离前的K562细胞;CD34+细胞群具有形成混合集落的能力;与K562细胞相比,CD34+细胞EPO和GM-CSF基因mRNA的转录水平明显下降(P<0.01),P-gp表达阳性。结论成功从K562细胞株中分离了CD34+细胞群,其具有自我更新和多向分化的能力,表明其具有白血病干/祖细胞的生物学特点。     

尖锐湿疣患者角质形成细胞的培养及其生物学特性鉴定

目的 对尖锐湿疣(condyloma acuminatum,CA)患者皮损处角质形成细胞进行培养及鉴定,测定β-catenin m RNA表达情况,分析细胞周期的变化。方法 采用两步消化法对皮损细胞进行消化,获得原代角质形成细胞后,进行体外无血清培养基培养。镜下观察细胞形态,并进行免疫组化染色鉴定;绘制细胞生长曲线;MTT法检测细胞增殖能力;流式细胞仪测定细胞周期。结果 镜下可见细胞为多角形或不规则形,呈铺路石状,细胞生长旺盛,轮廓清晰,折光性好,胞浆均被染成红色,为角蛋白阳性,于第3天开始进入对数生长期,第7、8天进入平台期。获得的角质形成细胞可稳定增殖,在CA的发病过程中,β-catenin m RNA的表达异常,细胞周期发生改变。结论 CA的发病过程中β-catenin m RNA的表达异常及细胞周期的改变可为CA的临床治疗提供了理论依据。     

Vero细胞森林脑炎疫苗毒种的选育及其生物学特性检测

目的选育Vero细胞森林脑炎疫苗适应毒种。方法将森林脑炎疫苗鼠脑病毒“森张”株在Vero细胞上连续传代适应,并对不同代次收获的病毒液的病毒滴度、免疫原性、稳定性等进行检测。结果“森张”株病毒在Vero细胞上传代适应后,病毒滴度达8·5LgLD50/ml;免疫血清中和抗体效价高于1∶20,其它检测项目均符合疫苗生产用毒种的要求。结论Vero细胞适应的“森张”株毒种的初步特性显示可作为制备Vero细胞森林脑炎疫苗用毒种。     

柯萨奇病毒A组16型临床分离株的生物学特性分析

目的对引起手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)的重要病原体柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus group A type16,CA16)临床分离株的生物学特性进行分析,为后续的疫苗研发奠定基础。方法从昆明地区HFMD临床疑似患者178份咽拭子及粪便标本中分离并鉴定CA16毒株,并对病毒的生长特性、蚀斑形态以及对乳鼠的致病性等生物学特性进行分析。结果共分离出7株CA16病毒:KM1、KM15、KM154、KM165、KM168、KM263、KM881,均属于B1亚型;病毒在Vero细胞上增殖较快,多数毒株4~6 d即可达到增殖高峰,但感染性滴度差别较大,最低为4.75 lgCCID50/ml,而最高可达7.78 lgCCID50/ml;各毒株在Vero细胞上培养相同时间形成的蚀斑形态不同,其中KM15、KM154、KM168蚀斑呈圆形,针尖样大小,边缘较清晰,KM1、KM881、KM263、KM165蚀斑较大,不规则,边缘较模糊;各毒株毒力均较强,经乳鼠颅内注射后,乳鼠均于3~6 d陆续开始发病,除KM168、KM154、KM15组乳鼠为不同程度的发病及死亡外,其他组乳鼠发病率及病毒致死性死亡率均达100%;各毒株对乳鼠的脑、心肌、肺、肌肉、脊髓和肝脏等组织均有不同程度的损伤,其中损伤较严重的组织为脑和肌肉。结论分离的CA16毒株对Vero细胞均具有良好的适应性,蚀斑清晰,毒力较强,且多数毒株感染性滴度较高,可用于CA16病毒致病机理的研究及疫苗的研发。     

一株祁连山野生毛头鬼伞菌的分离鉴定及其生物学特性分析

目的对一株祁连山大型野生食用菌进行分离鉴定,并分析其生物学特性。方法经组织分离获得野生菌株QL-8,提取其基因组DNA,以其为模板扩增内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)片段,并进行测序及系统发育分析。采用单因素试验方法检测温度(18、20、22、24、26、28℃)、p H值(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)、碳源(蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、甘露醇、甘油、葡萄糖)、氮源(硝酸钾、蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵、酵母粉、尿素)、无机盐(硫酸铁、硫酸钙、硫酸锌、硫酸铜、硫酸锰、硫酸镁)、维生素(VB1、VB2、VB3、VB6、VB12、VB复合)对菌丝生长的影响。使用不同栽培料(棉籽壳、木屑、粪草)对野生菌进行栽培试验。结果菌株QL-8属于毛头鬼伞属,Gen Bank登录号为KF702392。菌丝生长的最适温度为24~26℃,最适p H为7.0,最适碳、氮源分别为蔗糖和酵母粉,添加一定量的硫酸镁和VB6有助于菌丝的生长。该菌株于木屑培养料中生长最快,满袋后覆土即可出菇。结论成功获得了菌株QL-8的生长特性和出菇条件,并培育出野生毛头鬼伞子实体,为天然野生菌实现人工栽培提供了实验依据。