钙调神经磷酸酶对金黄色葡萄球菌肠毒素C2超抗原活性的作用

目的探讨钙调神经磷酸酶(Calcineurin,CaN)对金黄色葡萄球菌肠毒素C2(staphylococcal enterotoxin C2,SEC2)发挥超抗原活性的作用。方法以终浓度为0.5、1、2、3和4μg/ml的重组野生型rSEC2及其增强型突变体蛋白mSEC2(T20L/G22E/H118A/H122A)刺激SD大鼠脾淋巴细胞,MTT法检测大鼠脾淋巴细胞增殖水平;检测终浓度为1μg/ml的rSEC2和mSEC2在诱导大鼠脾淋巴细胞增殖过程中CaN活性的变化、终浓度为0.1、0.5、1、2和3μg/ml的CaN特异性抑制剂环孢菌素A(cyclosporine A,CsA)对该过程的影响,以及CaN3个亚基CaN Aα、CaN Aβ、CaN B在mRNA水平上的变化。结果在低浓度rSEC2和mSEC2刺激下,大鼠脾淋巴细胞增殖指数(proliferation index,PI)与给药浓度成正比,高浓度刺激下,可明显抑制大鼠脾淋巴细胞的增殖,1μg/ml浓度增殖效果最好;CsA对大鼠脾淋巴细胞增殖具有较强的抑制作用,呈明显的剂量依赖性,当CsA浓度为0.5～1μg/ml时,rSEC2和mSEC2的刺激作用即被完全抑制;CaN的活性及其相关亚基(CaN Aβ和CaN B)mRNA水平与其超抗原的刺激增殖活性具有明显相关性。结论 CaN对SEC2发挥超抗原活性具有重要作用,为提高SEC2的临床应用价值及规避毒副作用奠定了理论基础。     

金黄葡萄球菌肠毒素C3基因的克隆及原核表达

目的克隆并原核表达金黄葡萄球菌肠毒素C3(SEC3)基因。方法以金黄葡萄球菌基因组DNA为模板,扩增SEC3基因中编码成熟蛋白的基因片段,克隆至pET-32a(+)表达载体,构建重组表达质粒SEC3-pET-32a,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经Ni-NTA亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果经PCR扩增获得720bp的SEC3基因;重组表达质粒构建正确;表达产物的相对分子质量约为43000,为可溶性表达;纯化的重组蛋白具有良好的反应原性。结论已成功克隆并原核表达了SEC3基因,为单克隆抗体和诊断试剂的制备及SEC3抗毒素的研制提供了材料。     

金黄色葡萄球菌肠毒素A基因克隆、表达、纯化与鉴定

目的构建含SEA基因的原核表达载体,并在大肠杆菌表达系统中表达。方法应用PCR扩增SEA基因片段,与克隆载体pGEMT-easy连接,插入到表达载体pET-30a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经诱导表达及鉴定。结果PCR扩增约770bp的基因片段,克隆至载体后,经测序与文献报道结果一致,表达蛋白相对分子质量约31000,纯化后鉴定为SEA蛋白。结论已成功获得SEA蛋白,为其进一步研究和应用奠定基础。     

金黄葡萄球菌野生株肠毒素B重组蛋白的表达及纯化

目的在大肠埃希菌中表达金黄葡萄球菌野生株肠毒素B(SEB)重组蛋白,并进行纯化。方法采用PCR方法从金黄葡萄球菌基因组中扩增出SEB基因片段,与pMD18-T载体连接,构建重组质粒pMD18-T/SEB,测序分析后,亚克隆入表达载体pGEX-4T-2,转化感受态E.coliJM109,IPTG诱导表达。表达产物采用B-PER GST Fusion Protein Purification Kit纯化后进行Western blot鉴定。结果SEB基因扩增片段大小为705bp,测序结果显示与金黄葡萄球菌S6株序列相比无碱基的插入或缺失,同源性为98.4%,存在11个碱基变异,其中7个为无义突变,4个为有义突变(突变位点位于第364、699、899和988位,编码氨基酸变化分别为:Ser→Ala、Gln→His、Asn→Ser和Met→Leu);表达的含GST的融合蛋白相对分子质量约53000,纯化后经SDS-PAGE分析,可见单一条带。Western blot显示表达产物可被兔抗SEB抗体所识别。结论已成功表达并纯化了金黄葡萄球菌野生株SEB重组蛋白,为开发SEB免疫诊断试剂提供了材料。     

重组金黄色葡萄球菌肠毒素B的原核表达、纯化及其免疫原性

目的 对金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B,SEB)基因定点突变体进行克隆、表达及纯化,并检测其免疫原性,为研制马抗SEB免疫球蛋白F(ab′)2制品奠定基础。方法 对SEB基因序列进行定点突变和修饰以及偏性密码子优化后,构建重组表达质粒pET-22b-SEB,转化E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达重组SEB蛋白,经离子交换层析纯化后,HPLC法检测重组SEB蛋白抗原纯度。Western blot法检测重组SEB蛋白抗原免疫活性;将不同浓度重组SEB蛋白抗原腹腔注射BALB/c小鼠,进行致病力、抗体效价、中和抗体活性检测。结果 质粒pET-22b-SEB经双酶切及测序鉴定证明构建正确。纯化的重组SEB蛋白相对分子质量约28 300,纯度大于90%,与天然SEB具有一致的免疫活性,且具有良好的安全性;免疫小鼠抗体效价达1∶81 920,可有效诱导小鼠产生中和抗体。结论 成功对SEB进行了定点突变减毒,经克隆、表达及纯化获得高纯度的重组SEB蛋白抗原,具有良好的免疫原性。     

重组金黄葡萄球菌肠毒素B及热休克蛋白65融合蛋白的原核表达及其在小鼠体内的体液免疫效果

目的原核表达重组金黄葡萄球菌肠毒素B(recombinant Staphylococcus aureus enterotoxin B,r SEB)及热休克蛋白65(heat shock protein 65,HSP65)融合蛋白r SEB-HSP65,并探讨其在小鼠体内的体液免疫效果。方法采用分子生物学方法将修改过TCR Vβ结合区的r SEB基因与HSP65基因融合,构建重组表达质粒p ET-28a-r SEB-HSP65,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,经铜柱亲和层析纯化。将纯化蛋白经小鼠背部皮下注射,分别于第0、14、28天各免疫1次,分别于第14、28、42 d经小鼠尾静脉采血,分离血清,间接ELISA法检测小鼠血清中抗-SEB的Ig G水平。结果重组表达质粒p ET-28a-r SEB-HSP65经双酶切及PCR鉴定,证明构建正确。表达的重组蛋白r SEB-HSP65的相对分子质量约85 000,主要以包涵体形式表达,表达量约占全菌总蛋白的40.81%,纯化蛋白纯度约为90%。各组免疫小鼠均可产生较高滴度抗体,且在第14、28及42天大部分含铝佐剂疫苗组的效价显著高于相同剂量的无铝佐剂疫苗组(P<0.05),第42天时无铝佐剂低剂量疫苗组与含铝佐剂低剂疫苗量组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功在E.coli BL21(DE3)中表达了重组蛋白r SEB-HSP65,且可诱导小鼠产生较高的抗体水平。     

金黄色葡萄球菌肠毒素B的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal entertoxin B,SEB)。方法以合成的SEB全基因序列为模板,PCR扩增SEB基因片段,插入原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-SEB,转化E.coil BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经硫酸铵盐析、SP阳离子层析柱、Chelating金属鳌合层析铜(Cu2+)柱纯化后,用Thrombin切除组氨酸标签,再经Chelating金属鳌合层析铜(Cu2+)柱和DEAE阴离子层析柱纯化。结果重组原核表达质粒pET-28a-SEB经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为31 000,主要以可溶性形式表达,表达量约占菌体总蛋白的30%。最终纯化后的重组SEB蛋白纯度可达90%以上。结论成功构建了SEB基因重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达并纯化了重组SEB蛋白,为进一步研究其致病机理及防控方法奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌肠毒素B在不同动物模型中的应答及治疗策略的研究新进展

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的感染引起的多种临床症状均与其分泌的金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B,SEB)密切相关,临床对SEB毒素中毒尚无特效疗法。本文对SEB在不同动物模型中的应答及治疗策略的研究新进展作一综述。     

葡萄球菌肠毒素B基因真核表达系统的构建及目的蛋白的鉴定

目的　克隆葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因 ,构建其真核表达系统并表达目的蛋白。方法　采用高保真PCR从金黄色葡萄球菌FRIS6B株中扩增全长SEB ,目的片段T A克隆后测序。重组质粒pUCm T SEB经酶切获得的pUCm T SEB基因片段与真核表达载体pPIC9K连接。将重组真核载体pPIC9K SEB转化入P .pastorisGS115株 ,经PCR筛选并鉴定pPIC9K SEB P .pastorisGS115。在 0 5 % (v v)甲醇诱导下 ,采用SDS PAGE检测重组SEB(rSEB)的表达 ,并对rSEB的N端氨基酸序列和诱导人脐静脉内皮EVC 30 4细胞分泌IL 1α和TNFα的作用进行了检测。结果　所克隆的SEB基因核苷酸及氨基酸序列的同源性分别高达 98 84 %～ 10 0 %和 10 0 %。表达的SEB在SDS PAGE图谱的位置与预期相符。rSEB氨基末端氨基酸序列与预期完全相符。rSEB与SEB商品有相似的促人脐静脉内皮细胞EVC 30 4分泌IL 1α和TNFα的活性。结论　已成功地构建了SEB的真核表达系统 ,为进一步分析SEB分子中毒性相关活性位点、定位突变获得减毒或无毒的突变体奠定了基础。     

金黄葡萄球菌核酸探针检测方法的建立

目的建立快速检测食品中金黄葡萄球菌的核酸探针检测法。方法通过使用吖啶酯标记的特异DNA探针检测金黄葡萄球菌,确定最高和最低探针浓度,验证该方法的特异性及敏感性,并与传统国标法的检测结果进行比较。结果核酸探针法最高探针浓度为2pmol∕50μl,最低探针浓度为0.25pmol∕50μl;该方法特异性良好,检出纯培养菌落最低限约为106cfu∕ml;与国标法检测结果一致性较高。结论核酸探针法可用于食品中金黄葡萄球菌的快速检测。     

黄芪苷对丙型肝炎病毒的抑制作用

目的研究黄芪苷对丙型肝炎病毒(HCV)的抑制作用。方法 MTT法检测不同浓度黄芪苷对Huh7.5.1细胞的抑制作用;间接免疫荧光试验检测不同浓度的黄芪苷、利巴韦林和干扰素(IFN)的抗HCV效果;Western blot法检测不同浓度黄芪苷、利巴韦林、IFN作用的Huh7.5.1细胞中HCV NS5A蛋白的表达情况。结果不同浓度黄芪苷对Huh7.5.1细胞的抑制率不同,并呈剂量依赖性。在最佳细胞密度1×10~4个/孔、最适MOI为1的条件下进行试验,利巴韦林对细胞的毒性呈剂量依赖性;IFN无明显的细胞毒性,其抗病毒滴度为7×10~(1.77) PFU/ml;黄芪苷的细胞毒性较小,其抗病毒滴度为7×10~(3.67) PFU/ml。黄芪苷能降低NS5A蛋白的表达,且随浓度增加抑制作用越明显。结论黄芪苷具有抗HCV的能力,其作用机制是通过抑制NS5A来实现的。     

Inhibitory effect of topical maize glucosylceramide on skin photoaging in UVA-irradiated hairless mice

We investigated the effect of topical application of the glucosylceramide prepared from maize on photoaged mice. Six-week-old hairless female mice were swabbed on the back with glucosylceramide solution or vehicle, following UVA irradiation for 9 weeks. Wrinkle formation was evaluated at 3, 6, and 9 weeks by skin replica analysis by using a three-dimensional (3-D) imaging system. Moreover, epidermal thickness was analyzed at the end of the experiment. Topical application of glucosylceramide significantly reduced UVA-induced wrinkle formation in the skin as well as epidermal hypertrophy. These results suggest that topical glucosylceramide has an inhibitory effect on UVA-induced photoaging.     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌裂解性噬菌体PhMASA-WJ的生物学特性及其对小鼠败血症的疗效

目的探讨耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)噬菌体PhMASA-WJ的生物学特性及其对小鼠败血症的疗效,为开发高效低毒的抗菌药物奠定实验基础。方法以MRSA(USA300)为宿主菌,从地下污水中分离筛选出1株噬菌体PhMASA-WJ,双层琼脂平板培养法测定噬菌体效价,点滴法测定噬菌体裂解谱,确定最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI),提取噬菌体全基因组并进行酶切鉴定,电镜观察噬菌体形态,并检测噬菌体的体外裂解效果、安全性及其对小鼠败血症的疗效。结果 PhMASA-WJ在USA300菌苔上形成直径1～2 mm的圆形、透明且边界清晰的噬菌斑,PhMASA-WJ效价为7. 1×10⁸ PFU/m L,其为专一裂解金黄色葡萄球菌的噬菌体,最佳MOI为0. 001,属于RNA病毒,基因组大小约23 000 bp。电镜观察显示,PhMASA-WJ属于有尾噬菌体目肌尾噬菌体科。动物实验证实,PhMASA-WJ对小鼠无毒副作用,败血症小鼠经PhMASA-WJ...     

纳米氧化铈对人乳腺癌Bcap-37细胞裸鼠移植瘤的生长抑制作用

目的探讨纳米氧化铈(nm-Ce O2)对人乳腺癌Bcap-37细胞裸鼠移植瘤的生长抑制作用。方法建立人乳腺癌Bcap-37细胞裸鼠皮下移植瘤模型,随机分为阴性对照组(等体积双蒸水)、阳性药组[九州虫草2 000 mg/(kg·次)]、nm-Ce O2高、中、低剂量组[300、100、33.33 mg/(kg·次)],共5组,各组荷瘤裸鼠均经口灌胃给药,每天1次,共17 d,观察各组裸鼠移植瘤生长情况,计算肿瘤体积(VT)、肿瘤生长抑制率,称量肿瘤重量,观察移植瘤组织病理变化,采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(terminal dexynucleotidyl transferase mediated d UTP nick end la beling,TUNEL)法检测移植瘤细胞凋亡率。结果与阴性对照组比较,nm-Ce O2各剂量组均具有抑制人乳腺癌Bcap-37细胞裸鼠皮下移植瘤生长的作用,并能促进瘤细胞的变性、坏死和凋亡(P<0.05)。nm-Ce O2高剂量组的肿瘤生长抑制作用低于阳性药组(P<0.05),但nm-Ce O2高、中剂量组促进肿瘤细胞凋亡的作用高于阳性药组(P<0.05)。结论 nm-Ce O2对人乳腺癌Bcap-37细胞裸鼠皮下移植瘤具有显著的生长抑制作用。     

Inhibitory effect of boldine on fish oil oxidation

The antioxidative effect of boldine, an alkaloid extracted fromPeumus boldus Mol. (boldo), was assayed on the spontaneous and on the metal-induced oxidation of fish oil. The inhibitory effect of boldine was compared to those of dl-α tocopherol, the flavonoid quercetin and the synthetic antioxidants butylated hydroxytoluene and butylated hydroxyanisole. Boldine, in all assays, showed a good antioxidative effect, which was comparable to that of quercetin and even better than that of dl-α tocopherol and the synthetic antioxidants. Additive effects were observed when mixtures of boldine and quercetin or dl-α tocopherol were assayed. The present study supports the potential use of boldine as a novel natural antioxidant for fish oil.