嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶基因定向进化研究

为得到具有催化活性的重组亚油酸异构酶,对嗜酸乳杆菌AS1.1854菌株亚油酸异构酶基因进行体外定向进化.经过两轮连续易错PCR扩增及一轮DNA改组获得了突变基因片段,并克隆到pET30a质粒载体上,转化大肠杆菌,构建了该酶的基因突变文库.经IPTG诱导表达后筛选出一株重组菌,可表达可溶性重组酶蛋白,经紫外分光光度计法测定,重组酶蛋白活力为8.2 U.     

嗜酸乳杆菌AS1.1854亚油酸异构酶基因的克隆与序列分析

将GenBank中已报道的罗伊氏乳杆菌亚油酸异构酶基因对已公布的嗜酸乳杆菌NCFM基因组全序列做tblast,找到一个同源编码框.参照此编码框的核苷酸序列及pQE30质粒图谱特性设计上、下游引物,利用PCR法扩增嗜酸乳杆菌AS1.1854亚油酸异构酶基因,并克隆到pQE30质粒载体上进行测序.分析测序结果表明,扩增得到的目的DNA全长1 776 bp,G C含量为37.5%,共编码591个氨基酸,理论相对分子质量67.5kDa.用Signal P3.0对其N端前70个氨基酸序列进行分析,结果表明,第20~40位氨基酸有较强的疏水性.不过,N端前70个氨基酸的C值、S值和Y值并不高,最有可能的酶切位点位于第45位与第46位氨基酸之间,但预测其被切割的可能性概率低于1%.可以推断,在嗜酸乳杆菌AS1.1854亚油酸异构酶的N端氨基酸序列中不存在信号肽序列.     

培养条件对一株嗜酸乳杆菌突变株亚油酸异构酶活力的影响

对一株嗜酸乳杆菌突变株产亚油酸异构酶的条件进行了研究,得到最佳产酶条件为:以脱脂乳作为培养基,添加3%的乳糖、1%的(NH4)2SO4、0 1%的亚油酸及1%的NaCl,接种量为1%,培养时间为36h.在此条件下,所合成的亚油酸异构酶活力达252 0U/mL.     

嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶在毕赤酵母中的分泌表达

以嗜酸乳杆菌AS1.1854来源的亚油酸异构酶基因为模板,用PCR方法扩增目的片段,并克隆到pMD19T载体.经双限制性酶切的pMD19T-LAI和载体pPICZαA连接转化得到重组质粒pPICZαA-LAI.将阳性重组质粒用sac Ⅰ进行线性化后,经化学法转化毕赤酵母GS115.提取重组酵母GS 115/pPICZαA - LAI基因组,利用交叉引物通过PCR方法筛选重组子.阳性毕赤酵母GS115/pPlCZαA-LAI经1％甲醇诱导,分泌表达出相对分子质量为69 000亚油酸异构酶.经测定发酵上清酶活力为0.107 U,未破碎重组酵母酶活力0.08 U.     

培养条件对一株嗜酸乳杆菌突变株亚油酸异构酶活力的影响

对一株嗜酸乳杆菌突变株产亚油酸异构酶的条件进行了研究，得到最佳产酶条件为：以脱脂乳作为培养基，添加3％的乳糖、1％的(NH4)2SO4、0．1％的亚油酸及1％的NaCl，接种量为1％，培养时间为36h，在此条件下，所合成的亚油酸异构酶活力达252．0U／mL。     

嗜酸乳杆菌表面疏水性对其亚油酸异构酶酶活的影响

研究碳源、氮源、生长时间以及生长温度对嗜酸乳杆菌细胞表面疏水性及其亚油酸异构酶酶活力的影响.通过Minitab15软件进行嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶酶活力对其表面疏水性的回归分析,结果表明,嗜酸乳杆菌菌体表面疏水性与其亚油酸异构酶酶活成正相关关系,回归方程为:y=1.5500x+78.163.R2=0.7507说明模型有较高的拟合度,显著性分析P(0.003)P(0.05),结果显著,可作为响应预测.     

嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌混菌发酵合成共轭亚油酸的动力学

利用Logistic方程建立发酵过程中菌体生长和共轭亚油酸合成的动力学模型;应用Origin 8.0对实验数据进行处理,得到了嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌混菌发酵合成共轭亚油酸动力学的模型及参数,相关系数R2分别为0.985 09和0.986 75,说明动力学模型与实验数据拟合较好,基本反映了嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌混菌合成共轭亚油酸的发酵过程。     

嗜酸乳杆菌酸奶的研制

在牛奶培养基中添加生长促进剂，可以使嗜酸乳杆菌 生长和产酸加快，保存期延长。用这种办法研制的酸奶不仅有良好的风味，而且含有大量活性乳酸菌，保健效果比普通酸奶更为理想。     

亚油酸异构酶高产菌株的选育及产酶条件的优化

共轭亚油酸是一种具有多种生理活性的天然脂肪酸.以嗜酸乳杆菌为出发菌株,经紫外诱变选育,获得1株共轭亚油酸高产菌株并对其发酵条件进行优化.紫外照射选择30 s为适宜的照射处理时间,诱变菌株酶活比原始菌株提高了1.51倍.对培养基的产酶条件进行优化,结果酶活是未优化前的1.1倍.     

罗伊氏乳杆菌亚油酸异构酶的生物信息学分析

综合利用多种生物信息学工具对罗伊氏乳杆菌亚油酸异构酶基因及其启动子区进行了定位,分析了4种乳酸菌亚油酸异构酶基因的上游调控区,发现了主要保守位点.分析证明罗伊氏乳杆菌亚油酸异构酶具有2个二硫键,1个糖基化位点,多个磷酸化位点,无信号肽序列,但在25(26)~42位存在跨膜区.证明罗伊氏乳杆菌亚油酸异构酶的密码子偏好性与大肠杆菌和酿酒酵母的密码子偏好性存在差异,初步分析了该基因在这些宿主菌中表达时可能存在的问题,并提出了改造方案.     

微生物亚油酸异构酶的生物信息学分析

运用生物信息学方法,对已在GenBank上公开发表的罗伊氏乳杆菌、疮疱丙酸杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和短双岐杆菌等的亚油酸异构酶基因序列进行了分析,并对这些基因序列编码的蛋白质进行了预测.     

植物乳杆菌在不同基质中转化生成共轭亚油酸的研究

将具有转化亚油酸能力的植物乳杆菌ZS2058分别接入脱脂奶、豆奶和番茄汁中,分别考察了亚油酸的添加量、亚油酸的添加方式和预培养对植物乳杆菌生长和转化亚油酸的能力的影响.结果表明,在脱脂奶中植物乳杆菌转化能力最强,在脱脂奶中该菌能将1 mg/mL亚油酸转化成152.05μg/mL共轭亚油酸.     

微生物共轭亚油酸异构酶的生物学研究

在各种共轭亚油酸异构体中,c9,t11-18∶2和t10,c12-18∶2这两种天然不饱和脂肪酸异构体被认为具有生物活性,如抗癌、抗动脉粥样硬化、减肥、促进生长、缓和免疫反应副作用等,因而在医药、食品、保健品、化妆品等领域有着广阔的应用前景.一些微生物能产生共轭亚油酸异构酶(Conjugated linoleic acid isomerase,EC 5.2.1.5),该酶又能专一性地催化亚油酸转化为活性共轭亚油酸异构体的反应,因此近几年来倍受关注,利用生物合成法生产共轭亚油酸已成为该领域未来的发展趋势.然而目前,共轭亚油酸异构酶的物种分布及进化关系、在细胞中的生物学功能、结构域、催化反应机理等尚未得到完整的阐释,利用基因工程技术大量高效地表达有活性的重组酶也尚未得到很好的解决.本文在前人对共轭亚油酸异构酶进行的多方面研究的基础上,对近年来共轭亚油酸异构酶的分布、生物学作用、酶的催化反应机理、酶基因的克隆表达等生物学方面的研究进展进行了综述,并利用生物信息学方法对已知的共轭亚油酸异构酶序列进行了初步分析.     

嗜酸乳杆菌LAJ90菌株部分生物学特性的研究

采用MRS培养基，对嗜酸乳杆菌LAJ90菌株的耐酸、耐胆汁盐及耐药性等部分生物学特性进行了研究。结果表明，该菌株能耐受0．1％～0．5％的猪胆盐，对pH1．5～4．5的酸度有较强的抵抗力，对青霉素和氨苄青霉素均具有中敏特性。     

产共轭亚油酸乳酸菌的选育和鉴定

采用紫外分光光度法测定共轭亚油酸的含量,从13株实验室保存的乳酸菌中筛选出8株具有转化亚油酸生成共轭亚油酸能力的菌株.其中As1.2686产量最高,发酵液中共轭亚油酸含量达到13.63 mg/L;其次是菌株B11693,共轭亚油酸产量为11.55 mg/L.选择B11693做进一步的菌种鉴定,将传统的形态学、生理生化鉴定方法和细菌16SrDNA分子生物学鉴定方法相结合,鉴定菌株B11693为短乳杆菌.