PCR‐DGGE analysis on microbial communities in pit mud of cellars used for different periods of time

Polymerase chain reaction denaturing gradient gel electrophoresis (PCR‐DGGE) was used to analyse microbial community evolution in the pit mud of cellars used for different periods of time in production of Chinese Luzhou‐flavour liquor. The pit mud was collected from the cellars and the microbial DNA was extracted from the microbes in the pit mud. The Bf 968 primer was used for PCR‐DGGE to analyse the variable region 6 (V6) to variable region 8 (V8) of the microbial 16S rDNA. It was found that the band number, dominance, diversity and similarity of the 16S rDNA were clearly different in the DGGE patterns, because of the great diversity expressed by the different microbial communities in the different‐aged cellars. It is concluded that mutual collaboration and constraint exist between the different microbial communities in the different‐aged cellars, and this relationship leads to an evolutional change in the structures and in the numbers of the microbial communities in the pit mud of the cellars. Changes become more obvious with increasing age of the liquor cellars. Copyright © 2012 The Institute of Brewing & Distilling     

基于Miseq高通量测序技术的古襄阳酒窖泥细菌多样性评价

使用Miseq高通量测序技术对4份古襄阳酒业浓香型白酒窖泥样品的细菌多样性进行了评价,同时通过选择性培养分离出窖 泥中的优势乳酸菌,再利用16S rDNA序列分析方法,对其进行初步鉴定。 结果表明,乳酸杆菌是古襄阳酒窖池中的优势细菌,其相对 含量高达92.02%。在分类操作单元（OTU）水平上,发现8个核心OTU相对含量＞1.0%,其中7个隶属于乳酸杆菌属（Lactobacillus）。4份 古襄阳酒业浓香型白酒窖泥样品中共分离到12株菌株,初步鉴定其全部为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）。     

宜宾地区不同性状窖泥的细菌群落结构解析及代谢功能预测

该研究基于16S r RNA V3-V4区基因序列,采用高通量测序技术对宜宾地区不同性状窖泥（新窖泥、老熟窖泥、老化窖泥）的细菌群落结构差异进行分析,并采用PICRUSt预测不同性状窖泥微生物的代谢功能,解析宜宾地区不同性状窖泥的代谢功能差异。结果表明,该地区三种性状窖泥的细菌群落结构存在显著差异,老熟窖泥和老化窖泥细菌群落的丰富度高于新窖泥,而多样性相反。己酸菌属（Caproiciproducens）在老熟窖泥中的相对丰度较高,可能是该地区窖泥老熟的标志,该菌对浓香型白酒的风味物质形成具有重要的作用;乳酸杆菌（Lactobacillus）则在新窖泥中的相对丰度较高,可能是该地区新窖泥的标志。窖泥的碳水化合物代谢和氨基酸代谢功能最强,且其相对丰度同样呈现出老熟窖泥>老化窖泥>新窖泥的变化规律,说明老熟窖泥的细菌群落结构对浓香型白酒风味物质的形成最有利。     

基于高通量测序的浓香型白酒窖池细菌群落结构分析

本试验利用高通量测序技术研究浓香型白酒窖池窖泥微生物群落结构,建立了一套完整的窖泥微生物群落结构研究方法和相关数据分析方法,同时得到了川北地区不同窖龄的窖泥微生物群落结构。通过Roche GS junior高通量测序平台对川北地区不同窖龄窖泥微生物群落结构进行分析后发现:6口窖池的窖泥主要细菌类群为Firmicutes(厚壁菌门)占79%,Actinobacteria(放线菌门)占4.9%、Bacteroidetes(拟杆菌门)占4.1%、Lentisphaerae(黏胶球形菌门)占3.5%、Synergistetes(互养菌门)占2.5%,其它占6%;其中Clostridiales Family XI.Incertae Sedis随着窖龄的增加呈现减少的趋势,Actinobacteria类群和Synergistetes类群随着窖龄的增加呈现增加的趋势,而Haloplasmataceae类群和Clostridiaceae类群则只在30年窖龄的窖池中有检测出,Syntrophomonadaceae类群在5年窖龄的窖池中均有检出,Lactobacillaceae类群和Porphyromonadaceae类群则只在30年窖龄的一口窖池中是优势细菌类群。     

Illumina高通量测序技术分析中周羌稞养生酒窖泥细菌多样性

以不同窖龄（5年、10年、20年和30年）的中周羌稞养生酒窖泥为研究对象,利用Illumina高通量测序技术对窖泥细菌16S rRNA V4～V5区进行测序,分析其细菌多样性。结果表明,窖泥中细菌多样性（Shannon指数）和丰富度（Chao指数）随着窖龄的增加而显著提高（P＜0.05）。不同窖龄窖泥的细菌群落组成存在差异,盐扁菌科（Haloplasmataceae）、乳酸杆菌科（Lactobacillaceae）,瘤胃球菌属（Ruminococcaceae）和梭菌属（Clostridium）为不同窖龄窖泥的共有细菌;类芽孢杆菌属（Paemibacillus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、消化球菌科（Peptococcaceae）、喜盐芽孢杆菌属（Haloballus）和链球菌属（Streptococcus）只出现在30年窖龄窖泥中;PCA结果分析表明,相同窖龄窖泥中的细菌具有更高的相似性,说明窖龄是影响窖泥细菌群落组成的重要因素之一。     

培养原料种类的减少对人工窖泥发酵剂菌群结构的影响

为实现人工窖泥发酵剂（APMSC）的品质控制，从前期开发的发酵剂配方中分别取出老熟窖泥、曲药、酒糟和黄水初步形成4个简化配方，采用扩增子测序和色谱技术比较了各配方发酵剂的微生物群落结构及香味物质含量差异。结果显示，各配方发酵剂样品中共检测到70个微生物操作分类单元（OTU），其中71.43%为各组样品共有，未检测到独有OTU。各配方样品的优势微生物均存在于其余分组中，仅物种相对丰度有所差异。根据酿酒有益微生物的丰度高低，选择了一种简化配方（无老熟窖泥作原料）发酵剂养护窖池，使酿造白酒的主体香味物质含量得到显著提高。结果表明，即使缺失了某一种培养原料，人工窖泥发酵剂的功能微生物物种也可能由其他原料补充，而原料种类的减少是实现发酵剂品质控制的主要途径。     

新老窖泥细菌群落结构差异及其对酿造白酒质量的影响

该实验选取六尺巷酒厂产酒质量低的新窖池窖泥及附近酒厂产酒质量良好的成熟老窖池窖泥,提取总脱氧核糖核酸（DNA）,对细菌16S rRNA的V3-V4区基因进行扩增、高通量测序后分析群落结构的差异。结果表明,螺旋菌门（Spirochaetae）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）是不同浓香型白酒生产厂窖泥样品（标记为YRF、XJF及CXF）中的共有优势微生物;梭菌纲（Clostridia）是成熟窖泥中的绝对优势微生物;在窖泥细菌的系统发育多样性上,新窖泥样品（标记为LCX）中梭菌纲与芽孢杆菌纲（Bacilli）的相对丰度显著低于成熟窖泥,是新窖池产酒质量比成熟老窖池差的主要原因。对窖泥细菌群落结构的分析有助于揭示浓香型白酒质量的成因。     

宋河浓香型白酒不同窖龄窖壁泥与窖底泥真菌菌群结构分析

采用Illumina Miseq高通量测序技术分析宋河浓香型白酒不同窖龄（6年、16年）窖池窖壁泥和窖底泥真菌菌群结构变化。结果表明,老窖池窖泥中真菌菌群物种丰富度高于新窖池,窖底泥多样性高于新窖池,但窖壁泥低于新窖池;窖壁泥中真菌菌群物种多样性和丰富度均高于窖底泥。在门水平上,新老窖池窖泥的绝对优势菌门均为子囊菌门（Ascomycota）,相对丰度为68.7%～86.2%。在属水平上,相同窖龄窖池窖壁泥和窖底泥真菌菌群结构分布接近,不同窖龄窖池窖泥真菌菌群在优势物种组成上发生了改变,新窖池窖泥的优势真菌群（相对丰度≥1%）主要有青霉属（Penicillium）、毡盘菌属（Byssonectria）和被孢霉属（Mortierella）等,老窖池窖泥的优势真菌主要有嗜热真菌属（Thermomyces）、曲霉菌属（Aspergillus）和根毛霉属（Rhizomucor）等,表明窖龄及窖泥位置均可不同程度的影响真菌菌群结构分布,窖龄可能是影响的主导因素。     

酱香型白酒第四轮次酒酿造过程中细菌多样性分析

该研究应用Illumina MiSeq高通量测序技术解析酱香型白酒第四轮次酒酿造过程中细菌多样性,并阐明其优势真菌微生物群落结构及其随酿造工艺动态变化。结果表明,在酒曲中主要优势菌有芽孢杆菌科（Bacillaceae）、海洋芽胞杆菌属（Oceanobacillus）;堆积发酵中主要优势菌有芽孢杆菌科（Bacillaceae）、变形菌纲（Proteobacteria）;在窖内发酵中乳杆菌属（Lactobacillus）占绝对优势;窖泥中主要优势菌有放线菌（Actinomyces）和乳杆菌属（Lactobacillus）和醋杆菌属（Acetobacter）。同一酒厂和不同酒厂新老车间酒曲、堆积、窖内发酵、窖泥之间细菌组成相似度较高,但其优势菌群丰度差异显著。发酵车间使用年限及窖龄影响着酿酒微生物多样性;使用时间长的车间和窖池其环境微生物种群结构更稳定,优势菌群更突出。     

基于高通量测序的浓香型窖泥原核微生物群落的窖池空间分布

利用Illumina Miseq高通量测序技术解析河南某酒企6年和12年窖泥微生物群落多样性和组成。结果表明,两类窖龄窖池中窖泥原核微生物群落组成具有相似的空间分布特征,且物种丰度（Chao1指数）和多样性（Shannon指数）均分别在窖壁中层和下层窖泥最高;乳杆菌属（Lactobacillus）、产己酸菌属（Caproiciproducens）、嗜蛋白菌属（Proteiniphilum）及甲烷囊菌属（Methanoculleus）等14个属为窖泥优势属,其中78.6%优势属在两类窖龄窖池下部（下层和窖底）窖泥中含量均高于窖池上部（上层和中层）窖泥,且主要隶属于梭状芽胞杆菌纲（Clostridia）和拟杆菌纲（Bacteroidia）;57.6%（19/33）Top10属的空间分布特征与窖龄无关;随窖龄增加,Top10属产生了132个变化,其中75.6%的变化均较小（＜1%）;冗余分析（RDA）结果推测,铵态氮和有效磷可能是影响供试窖泥原核微生物菌群空间分布的主要环境因子。     

基于高通量测序的宋河浓香型白酒不同窖龄窖泥细菌群落结构分析

以宋河浓香型白酒不同窖龄窖泥为研究对象,采用Illumina Miseq高通量测序技术和典范对应分析（CCA）等方法探究细菌菌群结构变化特征及其环境影响因素。结果表明,16年窖龄窖泥的细菌群落结构多样性高于6年窖龄窖泥,相同窖龄、同一窖池的窖底泥高于窖壁泥。6年窖壁泥与窖底泥的细菌群落结构相似,绝对优势细菌属均为乳酸菌属（Lactobacillus）。16年窖壁泥与窖底泥的细菌群落结构差异较大,共有绝对优势细菌属为梭菌属（Clostridium）、氨基酸杆菌（Aminobacterium）、理研菌属（Petrimonas）、互营单胞菌属（Syntrophomonas）和Sedimentibacter。特有绝对优势细菌属中Lactobacillus相对丰度的降低以及Clostridium和Aminobacterium相对丰度的迅速增长均表明16年窖池已成为趋于老熟化的优质窖池。CCA分析结果推测,pH和有机物可能是影响16年窖池细菌群落结构改变的主要环境因子。     

陶融型白酒正常和退化窖泥细菌群落多样性解析及其理化影响因素

利用高通量测序技术解析陶融型白酒正常窖池和退化窖池窖泥细菌群落多样性及其在窖池中的空间异质性,并通过冗余分析（RDA）影响微生物群落的主要理化因素。结果表明,退化窖池窖泥的含水量（36.78%）、pH值（5.50）及铵态氮含量（23.48 mg/100 g）均低于正常窖池窖泥,而总酸含量（13.00 mg/g）和有效磷含量（27.32 mg/100 g）与之相反。窖泥中细菌群落存在明显的空间异质性。与正常窖池窖泥相比,退化窖池窖泥中主要优势细菌门厚壁菌门（Firmicutes）（64.32%）、拟杆菌门（Bacteroidetes）（12.58%）以及主要优势细菌属己酸菌属（Caproiciproducens）（3.03%）、嗜蛋白菌属（Proteiniphilum）（6.60%）、棒状杆菌属（Caldicoprobacter）（1.06%）的平均相对丰度较低。有效磷、总酸和铵态氮含量可能是影响不同质量窖泥细菌菌群空间分布的主要理化因子。     

宜宾产区浓香型白酒酿造生境中细菌的群落结构

该文利用高通量测序技术全面解析宜宾产区浓香型白酒酿造生境中的微生物菌群结构,并对窖泥、大曲、酒醅和黄水中的细菌种类和丰度进行对比分析。结果表明,从宜宾产区白酒酿造生境的26个样品中共注释到来自于201个属的1 493个OTUs,主要分布于拟杆菌门(Bacteroidete)、变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes),其中5个属来自于古菌域的广古菌门(Euryarchaeota)。窖泥样品中微生物菌种的多样性最高,主要以古菌、瘤胃球菌和乳酸菌为主;大曲的多样性次之,主要包括未鉴定到属水平的细菌,芽胞杆菌、乳酸菌和高温放线菌等;酒醅和黄水中的微生物多样性最低,其主要微生物类群以乳酸菌和瘤胃球菌为主。宜宾产区浓香型白酒酿造过程微生物群落结构呈现出从多种微生物共同作用到功能微生物主要发挥作用的趋势。该研究为探究浓香型白酒酿造过程中功能微生物,解析白酒酿造机理,提升白酒品质奠定了基础。     

浓香型白酒窖泥微生物群落研究进展

窖泥微生物是决定浓香型白酒风格的关键因素。多种分子生物学新技术（如以聚合酶链式反应（PCR）为基础的技术、基因组学技术、高通量测序技术等）已用于窖泥微生物群落结构及功能研究,检测到越来越多的窖泥微生物,发现微生物多样性越来越高。老窖泥中的标志性优势微生物,在门水平为厚壁菌门（Firmicutes）、广古菌门（Euryarchaeota）、拟杆菌门（Bacteroidetes）,在纲水平为梭菌纲（Clostridia）,在属水平为梭菌属（Clostridium）、沉积微生物属（Sedimentibacter）、甲烷杆菌属（Methanobacterium）等。氢营养型甲烷菌既可以促进窖泥的老熟,又对浓香型白酒的香味物质的生成也有重要作用。有些环境因子对窖泥微生物有明显影响,且与有益微生物呈正相关。     

泸香型白酒窖泥微生物生态功能研究进展

窖泥中含有大量的功能微生物,其作为白酒生香功能微生物的繁殖载体,在泸香型白酒的生产过程中发挥了重要作用。窖泥微生物是决定浓香型白酒风格的关键因素,目前基于传统微生物技术和现代生物学技术(如以聚合酶链式反应(PCR)技术、基因组学技术、高通量测序技术)等对白酒窖泥微生物的研究,已经取得了丰富的研究成果,检测到越来越多的窖泥微生物,发现微生物多样性越来越高。本文综述了窖泥微生物群落结构的多样性、窖泥功能微生物对白酒风味的贡献、新老窖泥中无机成分的质量评价,并针对研究存在的问题提出未来研究方向:进一步发掘窖泥微生物资源,提升功能微生物的应用潜力,以期为白酒生产中遇到的实际问题提供理论指导。     

基于文献计量学的白酒窖泥研究进展与发展态势分析

为深入了解白酒窖泥领域的研究现状和热点,本文基于Web of Science核心合集数据库和中国知网（CNKI）学术期刊数据库,从年度发文量、发文作者和机构、高引文章和关键词等角度出发,采用文献计量法对1980—2021年该领域522 篇中文文献和112 篇英文文献进行知识图谱分析,详细阐述白酒窖泥的研究进展,并结合研究热点分析本领域未来的发展态势。窖泥研究对白酒产业高质量发展和品质提升具有重要作用,近10 年来有关窖泥的文献数量总体呈现波动上升态势,目前尚未达到成熟阶段,未来仍有广阔空间。中国学者是窖泥研究领域的主力军,张文学、唐玉明、周荣清、吴重德、徐岩等作为主要贡献者,所发表文献的影响力和学术价值都很高。窖泥研究主要机构有四川大学、四川轻化工大学、江南大学等,研究热点多集中在微生物群落、人工窖泥、有机酸、丁酸菌、功能菌等方面。通过本文综合分析,可以为我国科研人员了解窖泥相关的研究动态和研究方向、开展科研合作与学术交流提供信息帮助。     

老化窖泥己酸代谢的研究

浓香型白酒的独特风味与窖泥有着密不可分的关系,而以己酸为前体物质的己酸乙酯是浓香型白酒中最重要的香气成分。该实验采用宏转录组技术对产己酸关键酶基因crt1、bcd、etfA1、etfB1、hbd1、nfnA和nfnB在老化窖泥中的表达以及老化窖泥中的己酸代谢途径进行了研究,为白酒品质提升提供理论依据。结果表明,根据关键酶基因的物种注释结果,推测脱卤厌氧杆菌（Anaeromyxobacter dehalogenans）可能是窖泥中一类重要微生物;同时,窖泥中己酸的合成可能并非己酸菌作用的结果,而是由多种非己酸菌共同作用产生。在老化窖泥中,D-乳酸和L-乳酸之间不能通过乳酸消旋酶相互转换,丙酮酸通过丙酮酸氧化还原酶或2-氧代酸氧化还原酶而不是丙酮酸甲酸裂解酶催化生成乙酰辅酶A。     

窖泥细菌群落结构演替及其与环境因子的相关性

利用PCR-DGGE系统研究了剑南春不同窖龄(2～50年)窖泥的微生物群落结构、种群演替趋势及其与环境因子的相关性。结果表明,2年窖龄窖泥的细菌丰度和多样性指数与5年样品相似,而10年窖龄窖泥的细菌丰度和多样性指数则明显增加,之后的10年基本持平,但50年时又显著下降。相同窖龄的窖泥样品中,中层的物种丰度和多样性指数均高于上层和下层,特别是在2～5年样品中这一趋势更加明显。DGGE和序列分析显示,窖泥中优势种群均分布在厚壁菌门(Phylum Firmicutes)的杆菌纲(Class Bacill)和梭菌纲(Class Clostrida),其中耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)、芽孢菌(Bacillus fordii)、未培养的瘤胃菌(uncultured Ruminococcaceae bacterium)和梭菌(uncultured Clostridia bacterium)为窖泥样品中的主要优势种群。典型对应分析显示,窖泥微生物群落结构与环境因子具有显著的相关性,其中有效磷、氨氮、pH对微生物群落结构的影响较大,其次是腐殖质,而水分含量的影响较小。     

浓香型大曲白酒窖泥微生物研究进展

基于传统微生物技术和现代生物学技术对白酒窖泥微生物的研究,阐述了研究白酒酿造微生物所运用生物学技术的各种方法、原理及对窖泥微生物的研究现状。主要对宏基因组、聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术、高通量测序技术等现代分子生物技术在窖泥微生物代谢活动和群落代谢机制研究中的应用进行了综述,为解决白酒生产中遇到的实际问题提供了理论指导。     

文王浓香型白酒不同深度新老窖泥理化性质与微生物演替分析

目的:本研究分析了新窖（3年）和老窖（30年）不同深度窖泥（Pit Mud, PM）的有机酸和微生物群落结构关联度,以期了解窖泥在垂直维度的老化成熟规律。方法:基于Illumina MiSeq高通量测序分析窖泥微生物群落结构演替规律,结合相关性分析有机酸与微生物的作用规律。结果:垂直维度窖泥深层（4~10 cm）和浅层（0~4 cm）存在明显差异,老窖池浅层窖泥中的主要微生物属是Caproiciproducens,深层窖泥中Fastidiosipila和Hydrogenispora占据主导;而在新窖泥中,浅层和深层窖泥中占据主导的均是Lactobacillus、Bacillus和Clostridium sensu stricto 12,且相对丰度随窖泥深度的增加而增加。理化因子方面,新老窖池浅层窖泥与水分、己酸、丁酸、乳酸、乙酸和腐殖质的含量呈正相关,深层窖泥与氨态氮、有效磷和pH的含量呈正相关。有机酸和微生物的相关性分析发现,老窖池中Caloramatoraceae与有机酸含量呈正相关,新窖池中Lactobacillus和Hydrogenispora与有机酸含量呈正相关,Caproiciproducens与新老窖池有机酸含量均呈正相关。结论:本文探究了新老窖泥垂直维度的原核生物群落结构演替及其与理化因子的关联,为窖泥养护和窖池微生物群落的成熟和稳定提供了参考。