牙鲆生长激素基因的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达

采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,从牙鲆(Paralichthys olivaceus)脑垂体总RNA中扩增出编码牙鲆生长素(GH)成熟肽基因序列。重组至融合表达载体pGEX-4T-3中,构建成牙鲆GH基因融合表达载体pGEX-gh,转化大肠杆菌BL21(DF3),筛选阳性克隆,IVIG诱导表达。经SDS-PAGE电泳显示在45kD处有特异的蛋白条带出现,该蛋白的表达量随诱导时间的延长而增加,3h达最高值,达到细胞总蛋白的18．3％。该融合蛋白在胞内主要以包涵体状态存在,经优化表达条件,成功地获得了可溶性的融合蛋白,经Glutathione Sepharase 4B凝胶纯化后用Western-blotting检测表明其为牙鲆生长激素,并通过酶联免疫吸附受体法证实其具有生物学活性。     

利用自剪切融合蛋白在大肠杆菌中表达并纯化兔防御素

将源自兔嗜中性细胞的防御素基因NP-1插入原核表达载体pTYB2,并将重组质粒pTYB2-NP1转入大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导使防御素以融合蛋白的形式表达。然后,通过亲和层析利用自剪切融合蛋白分离提纯目的蛋白。蛋白电泳检测到以二聚体形式存在的防御素,但此蛋白没有对大肠杆菌的抑菌活性。同时,对该表达纯化系统的特点和用原核生物大肠杆菌表达真核生物防御素的问题进行了分析和讨论。     

人体c-Mpl分子配体蛋白XP1的表达、纯化及活性初步鉴定

TPO是近年发现的血小板生成素，它通过与其受体c-Mpl的结合刺激巨核细胞的发生，调节动物或人体血小板的生成。利用酵母双杂交系统，以人体c-Mpl受体作为诱饵蛋白，我们从人体肝脏cDNA文库筛选到另一与c-Mpl相结合的新配体，命名为XP1。将：xpl-cDNA构建到pET-28b大肠杆菌融合表达载体，经金属离子亲和层析柱和DEAE阴离子层析柱分离纯化，获得纯度为99％的His-XPI水溶性融合蛋白。表达产物利用小鼠巨核细胞集落形成单位测定活性。结果表明：xpl基因在大肠杆菌中获得高效水溶性表达；其产物对小鼠骨髓细胞巨核细胞集落形成单位有明显的刺激作用。     

中国明对虾线粒体MnSOD在大肠杆菌中的重组表达、产物纯化及活性测定

采用PCR方法扩增编码中国明对虾线粒体锰超氧化物歧化酶(MnSOD)成熟肽的基因,并克隆到大肠杆菌表达载体pCRR T7/NT TOPOR TA中进行体外重组表达.重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS后,经IPTG诱导表达产生包涵体形式的目的蛋白.对重组蛋白进行 LC-ESI-MS 分析的结果表明,融合蛋白的三个肽段与中国明对虾线粒体MnSOD 相应肽段完全一致.将重组蛋白通过金属螯合柱进行纯化,进而透析、复性,最后获得了活性高达2373U/mg的重组蛋白.中国明对虾线粒体MnSOD的成功表达,为深入研究其在中国明对虾免疫反应和抗氧化胁迫中的作用奠定了基础.     

在大肠杆菌中表达蜘蛛拖丝融合蛋白

蜘蛛丝凭借其优良的理化性质倍受人们青睐,但是蜘蛛本身难以高密度养殖给应用造成巨大的障碍。由此利用基因工程的手段来开发利用蜘蛛拖丝蛋白目前成为各国研究的热点。以往的研究表明,不同的编码蛛丝蛋白的cDNA片段在表达中的稳定性各不相同。在应用中存在适宜片段的筛选问题。本文从该角度出发,首次建立了Araneus diadematu克隆的拖丝蛋白基因ADF3与GSF融合产物的稳定原核表达系统。为今后进一步开发利用蜘蛛拖丝蛋白的研究奠定了基础。     

人高血压相关基因(HRG-1)编码蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定

为了研究一个新的人高血压相关基因HRG－1的编码蛋白在大肠杆菌中的表达及生物学活性,使用PCR的方法扩增人HRG－1基因ORF的编码序列,构建了原核表达质粒,并在大肠杆菌中诱导表达及进行体外活性鉴定,实验结果证明得到了具有生物学活性的人HRG－1原核表达蛋白,且人HRG－1原核表达蛋白具有真核表达蛋白一致的生物学活性。     

Q139霍乱弧菌LPS基因和O抗原基因在大肠杆菌中的克隆表达及O抗？…

本研究采用构建基因文库的方法，构建了Ｏ１３９霍乱弧菌的粘粒基因组文库及重组粘粒的亚克隆文库。另外构建了质粒基因组文库。从文库中筛选到可以表达Ｏ１３９霍乱弧菌ＬＰＳ和Ｏ抗原的重组克隆，经鉴定重组克隆表达的ＬＰＳ和Ｏ抗原不但具有与Ｏ１３９霍乱弧菌的ＬＰＳ和Ｏ抗原具有相同的反应原性，而且还具有相同的免疫原性。Ｏ抗原基因的部分测序分析表明，Ｏ１３９霍乱弧菌的抗原基因与Ｏ１群霍乱弧菌的Ｏ抗原基因不同源。     

位点特异性重组酶Cre的克隆、表达、纯化及体外活性鉴定

克隆了Cre基因，分别构建了真核表达载体pEF-EBFP-Cre和pGEX-Cre，在大肠杆菌中表达了Cre重组酶，并证明了重组酶的删除特性，为进一步在转基因动物乳腺生物反应器中使用此酶打下基础。     

cpcB与CT融合蛋白表达质粒在大肠杆菌中的表达和纯化

将人和鲑鱼嵌合型降钙素基因与藻蓝蛋白的β亚基基因相连,插入融合表达载体pGEX-4T-3中,转化大肠杆菌BL21。融合蛋白cpcB-CT基因在IPTG诱导下获得高效表达。超声破碎后,经SDS-PAGE分析,在48kD处有新增条,灰度扫描测定,过表达蛋白量占50％～60％,85％为包涵体。包涵体经变性、复性,过Glutathion-Sepharose-4B亲和吸附柱,获含有GST。的融合蛋白,该蛋白经凝血酶消化和截留分离,获得纯化的融合蛋白cpcBCT。Western blotting分析表明,产物具有与合成人降钙素相似的抗原决定簇部分;ELISA-受体法和大鼠降血钙试验表明,其具有降血钙作用。提示该融合蛋白可能具有良好的应用前景。     

制备性SDS—PAGE纯化大肠杆菌表达的重组人VEGF

在利用基因工程方法实现大肠杆菌表达外源重组人ＶＥＧＦ的基础上，应用制备性ＳＤＳ－ＰＡＧＥ从包涵体中分离纯化了这一因子。纯化蛋白在含有氧化型与还原型谷胱甘肽和肝素的缓冲液中复性，复性后的ＶＥＧＦ蛋白成为同源双体，经Ｍｉｌｅｓ方法检测，证明可提高血管通透性，具有生物活性。这一研究为制备具有生物活性的重组人ＶＥＧＦ蛋白，从而开展有关其生理与病理意义的研究奠定了基础。     

Changes in Gene Expression of E. coli under Conditions of Modeled Reduced Gravity

Relatively few studies have examined bacterial responses to the reduced gravity conditions that are experienced by bacteria grown in space. In this study, whole genome expression of Escherichia coli K12 under clinorotation (which models some of the conditions found under reduced gravity) was analyzed. We hypothesized that phenotypic differences at cellular and population levels under clinorotation (hereafter referred to as modeled reduced gravity) are directly coupled to changes in gene expression. Further, we hypothesized that these responses may be due to indirect effects of these environmental conditions on nutrient accessibility for bacteria. Overall, 430 genes were identified as significantly different between modeled reduced gravity conditions and controls. Up-regulated genes included those involved in the starvation response (csiD, cspD, ygaF, gabDTP, ygiG, fliY, cysK) and redirecting metabolism under starvation (ddpX, acs, actP, gdhA); responses to multiple stresses, such as acid stress (asr, yhiW), osmotic stress (yehZYW), oxidative stress (katE, btuDE); biofilm formation (lldR, lamB, yneA, fadB, ydeY); curli biosynthesis (csgDEF), and lipid biosynthesis (yfbEFG). Our results support the previously proposed hypothesis that under conditions of modeled reduced gravity, zones of nutrient depletion develop around bacteria eliciting responses similar to entrance into stationary phase which is generally characterized by expression of starvation inducible genes and genes associated with multiple stress responses.     

人肥胖基因在大肠杆菌中的表达

肥胖基因编码的瘦蛋白可以反映机体脂肪含量信息,在发育、繁殖、造血及体重调节等方面具有重要功能。本文利用PCR方法扩增去除信号肽的人肥胖基因cDNA序列,并将位于基因5’端的CCC转变为大肠杆菌常用密码子CCG,扩增片段经测序证实后,克隆原核表达载体pT7-7,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经温度诱导,SDS-PAGE电泳可见分子量约为：16kD的特异蛋白表达带,表达量最高占菌体蛋白总含量的45％以上。表达重组蛋白经纯化,注射昆明白小白鼠,小白鼠体重明显下降,说明纯化的重组蛋白具有生物学活性。     

以融合蛋白形式在E·Coli中表达人神经生长因子

将人神经生长因子基因（hNGF）克隆到pMalC2质粒中，构建了表达产物为麦芽糖结合蛋白（MBP）与hNGF的融合蛋白重组质粒。经由内切酶再水解及DNA序列测定等分析表明，重组质粒含hNGF基因（360bP），该质粒在E·Coli中的表达产物为融合蛋白MBP－hNGF（55kd），光密度扫描表明，其表达量约为30％。     

中国明对虾蜕皮抑制激素在大肠杆菌中的表达与分离纯化

采用大肠杆菌表达系统对中国明对虾蜕皮抑制激素(MIH)进行了体外重组表达研究.重组蛋白以包涵体的形式存在于菌体中.尿素-SDS-PAGE分析表明,经1mmol/L的IPTG诱导4h后,重组蛋白获得了大量表达,在分子量为13 kD处有一条与预测大小一致的特异性蛋白条带;经金属螯合柱纯化后,得到了电泳纯的融合蛋白.Western blotting检测结果表明:重组表达的融合蛋白与兔抗刀额新对虾MIH的多克隆抗体特异结合,证实该融合蛋白为中国明对虾MIH.通过胶内酶切与LC-ESI-MS分析进一步证实融合蛋白的部分肽段与日本对虾MIH一致.MIH融合蛋白的成功表达为进一步深入研究其在中国明对虾蜕皮过程分子作用机制奠定了基础.     

镭普克的制备及对小鼠H22肝癌的抑制作用

报道重组别藻蓝蛋白(rAPC,镭普克)表达菌株的20L高密度发酵、镭普克制备及对小鼠H22肝癌抑制作用的实验结果。采用两步发酵法最终OD600为36．18,比一步发酵法的40．16值低,但镭普克表达率是后者的1．8倍,为30．24％,镭普克生物量提高1．62倍。亲合层析结合分子筛层析纯化后,镭普克纯度可达98．03％。对小鼠H22肝癌静脉注射剂量为50mg/kg／d,抑瘤率为62．2％。初步的免疫实验结果表明,镭普克对淋巴B细胞功能具有增强作用。结果提示镭普克大规模生产的潜力和临床应用的可能性。     

人羟甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶催化域在大肠杆菌中的表达及纯化

参照1993年Frimpong等表达仓鼠同源酶催化域的研究结果，将PCR法制备的人HMG－CoA还原酶催化域cDNA克隆入表达载体pET30，使表达产物C端融合载体编码的His－Tag，以利产物的稳定和完整产物的纯化。     

龙须菜藻红蛋白亚基基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

用PCR扩增方法得到真核红藻－龙须菜藻红蛋白亚基基因序列,与其它6种已知红藻相应序列比较,显示了很高的保守性。在7株藻中β亚基比α亚基保守,α亚基倾向于小区域保守,而β亚基倾向于大片段的保守。该蛋白必需氨基酸的含量较高。藻红蛋白亚基基因在大肠杆菌中达到较高的表达量,诱导4小时,特异表达产物占菌体可溶性蛋白的44％,表达产物呈溶解状态,而两亚基可能是分别翻译的。